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UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO”
DECANATO DE MEDICINA
MAESTRIA EN FISIOLOGIA
“LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA
REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDAD”
Trabajo presentado para optar al grado de Magíster Scientiarum
Por: JOSE LORENZO GARAY FLORES
Barquisimeto, 2006
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APROBACION DEL TUTOR
En mi carácter de tutor del trabajo “LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA
DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE
COLINA DE ALTA AFINIDAD”, presentado por el ciudadano JOSE LORENZO
GARAY FLORES para optar al grado de Magíster Scientiarum en Fisiología, considero
que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la
presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En Barquisimeto, a los 26 días del mes de Enero de 2006.
____________________________ Prof. Nelson Loureiro, PhD
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“LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA
REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDAD”
Por: JOSE LORENZO GARAY FLORES
Trabajo de grado aprobado
________________________________ ________________________________ Dr. Nelson Enrique Loureiro D.S.
________________________________
Barquisimeto, ____ de ____________ de 2006
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Agradecimientos
- A Dios y a toda mi familia, por el incondicional apoyo y compañía.
- Al Estado venezolano y a la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”,
por el apoyo dado para mi formación y realización de este trabajo.
- Al Dr. Nelson Loureiro, por su profesionalismo, tenacidad en enseñarme y por
querer compartir lo aprendido a lo largo de los años.
- A la Sección de Fisiología y a la Unidad e Investigaciones de Fisiología por
poner a mi disposición toda su buena voluntad, estructuras y equipos.
- Al personal técnico del Laboratorio de Fisiología Celular, TSU Elis Mosquera y
William López por la calidad de la colaboración prestada para realizar este
trabajo.
- A los Brs. Regino Rodríguez, Daniela Petrucci, José A. Gutierrez, Maria Lis
Freites y Andrés Arteta por su generosa colaboración.
- A la Dra. Carmen Militza Pérez, por el apoyo prestado desde el extranjero en
estos años.
- A la Unidad de Investigaciones de Bioquímica y al Dr. Rafael Bonfante por toda
la colaboración prestada.
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INDICE
PAG. AGRADECIMIENTOS v INDICE DE ILUSTRACIONES viii RESUMEN ix CAPITULO I 1 INTRODUCCION 1 II ANTECEDENTES 4 Acetilcolina 4 Síntesis de Acetilcolina 5 Colina Acetil Transferasa (ChaT) 6 Aporte de Acetil Coenzima A 6 Aporte de Colina 7 Almacenamiento y liberación de Acetilcolina 7 Receptores Colinérgicos y Acetilcolinesterasa 8 El Transportador de Colina de Alta Afinidad (HAChT) 8 Clonación del HAChT 11 HAChT: Funcionamiento y Regulación de su Función 13 Dopamina y sus Receptores 17 Interacciones entre Sistema Colinérgico y Dopaminérgico en el Sistema Nervioso Central
20
Retina y Sistema Colinérgico 24 III 27 MATERIALES Y METODOS 27 Materiales 27 Cultivos Celulares 29 Mantenimiento de los Cultivos Celulares 30 Determinación de la Actividad del Transportador de Colina de Alta Afinidad (HAChT)
30
Determinación de las proteínas en el pellet 32 Electroforesis y Western Blot 32 Análisis de los datos 34 IV 35 RESULTADOS 35 Regulación de la actividad HAChT en retina: Efecto del tratamiento de la Dopamina
35
Regulación de HAChT por los niveles de cAMP 40 Regulación del HAChT por Adenosina 42
vi
Efecto del Pre Tratamiento de los cultivos celulares con Kainato o Glutamato
44
Efecto del Tratamiento de los cultivos celulares con Esteres de Forbol 46 Electroforesis e Inmunodetección del HAChT en retina de pollo 47 V 48 DISCUSION Y CONCLUSIONES 48 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 60 ANEXOS Currículum Vitae del Autor
vii
INDICE DE ILUSTRACIONES
FIGURA PAG.
1 12 2 36 3 37 4 39 5 40 6 42 7 43 8 45 9 46
10 47 11 57
viii
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO”
DECANATO DE MEDICINA
MAESTRIA EN FISIOLOGIA “LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA
REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDAD”
Autor: José Lorenzo Garay Flores
Tutor: Nelson Enrique Loureiro D.S.
RESUMEN
El sistema colinérgico está involucrado en diversas funciones fisiológicas, así como en importantes afecciones del SNC. La actividad del Transportador de Colina de Alta afinidad (HAChT) es la etapa limitante en la síntesis de acetilcolina. Otros marcadores colinérgicos presinápticos como la Colina-acetil-transferasa (ChAT) y el Transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) son regulados por aminoácidos excitatorios (AAEE´s) y, en el caso de VAChT dicha regulación implica mecanismos de fosforilación por PKC. El HAChT también presenta sitios consensuales para fosforilación por PKC y también por PKA. La fosforilación de HAChT por PKC induce cambios en su Vmax y en su ubicación celular, aunque no hay datos concluyentes acerca del papel que PKA tenga en la función del HAChT. A las interacciones dopaminérgico-colinérgicas en el SNC se atribuye gran importancia fisiológica y fisiopatológica (E. de Parkinson). La dopamina a través de receptores D1 induce aumento de los niveles de cAMP y activación de PKA. En este trabajo se demuestra que en cultivos celulares de retina embrionaria de pollo, la dopamina no induce cambios en la actividad del HAChT ni regula tónicamente dicha actividad.. Sin embargo quedó aquí demostrado por primera vez que incrementos en los niveles de cAMP (mediante inhibición de la fosfodiesterasa, por activación de adenilatociclasa o tras agregar directamente Sp-cAMP) reducen la actividad del HAChT. Se demuestra además que la Adenosina (probablemente a través de receptores A2) reduce significativamente la actividad del HAChT en estos cultivos. Se demuestra también que en retina la activación de PKC (mediante ésteres de forbol) reduce significativamente la actividad del transportador y que los AAEE´s (Glutamato y Kainato) también provocan una disminución significativa del mismo, probablemente mediante fosforilación por PKC o PKA. Otros sistemas de neurotransmisión deben explorarse para obtener más datos sobre la regulación heteróloga del terminal colinérgico en retina y otras regiones del SNC. Palabras Clave: Transportador de Colina, Dopamina, Aminoácidos excitatorios, Proteína cinasas.
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CAPITULO I
INTRODUCCION
En el Sistema Nervioso Central, el sistema colinérgico participa en diversos
procesos fisiológicos (memoria y aprendizaje, control del movimiento, estados
emocionales) así como en diversos trastornos neuropsiquiátricos (Enfermedad de
Alzheimer, Enfermedad de Parkinson). Las interacciones entre el sistema colinérgico y
otros sistemas de neurotransmisión parecen tener gran importancia en estos eventos
fisiológicos y fisiopatológicos y sin embargo, los conocimientos acerca del control del
funcionalismo colinérgico y la regulación del terminal colinérgico por parte de otros
sistemas de neurotransmisión son relativamente escasos.
La síntesis de la Acetilcolina depende en gran parte de la disponibilidad de colina,
provista desde el exterior de la neurona colinérgica a través del Transportador de Colina
de Alta Afinidad (HAChT), cuya función es considerada como la etapa limitante en la
síntesis del neurotransmisor. Se deriva de esto que cambios en la actividad del HAChT
pueden influir notablemente en la síntesis de la acetilcolina y de la liberación de esta,
como de hecho ocurre en presencia del inhibidor específico del HAChT, Hemicolinio-3.
La presencia de sitios consensúales para fosforilación por PKA y PKC en la
estructura del HAChT han hecho pensar que un mecanismo probable de regulación de
su actividad, y por ende del funcionalismo del terminal colinérgico, sea la fosforilación
de HAChT por parte de estas Proteína cinasas. Recientemente se ha demostrado que
HAChT es una fosfoproteína, capaz de reciclar entre la membrana plasmática y el
compartimiento endosómico mediante endocitosis clatrino – dependiente, y que además
su fosforilación por PKC modifica su ubicación celular promoviendo su traslado al
compartimiento endosómico con la consiguiente disminución de su actividad (Vmax.).
Sin embargo no han sido presentados datos concluyentes acerca de la posible regulación
de la actividad del HAChT por parte de PKA.
x
A nivel de los ganglios basales, se encuentra gran cantidad de interneuronas
colinérgicas, y las interacciones entre los sistemas dopaminérgico y colinérgico parecen
ser de suma importancia en el control del movimiento. En la Enfermedad de Parkinson,
el déficit dopaminérgico primario se asocia a un incremento de la actividad colinérgica,
cuya atenuación constituye una de los abordajes terapéuticos comunes de la afección.
La dopamina, a través e sus receptores D1 es capaz de incrementar la producción de
cAMP y por lo tanto de aumentar la actividad de PKA. La potencial susceptibilidad del
HAChT para ser fosforilado por PKA, plantea la posibilidad de que la dopamina
induciendo la fosforilación por PKA del HAChT sea capaz de modificar la captación de
colina por parte de este y regular de este modo el funcionalismo colinérgico, no solo a
nivel de ganglio basales, o estriado más específicamente, sino también en otras regiones
del SNC.
En el presente trabajo se estudia tal posibilidad, y se exploran además otros
mecanismos de regulación del HAChT por fosforilación, empleando como modelo
biológico los cultivos celulares de retina de embrión de pollo (tipo monocapa densa);
modelo que ha demostrado ser válido en este tipo de estudios. Estos cultivos expresan
los diferentes marcadores colinérgicos así como dopaminérgicos y de otros sistemas de
neurotransmisión.
En estos cultivos celulares (en los que las células colinérgicas son células
amácrinas) se procedió a cuantificar la actividad HAChT en presencia de dopamina y de
otras sustancias (neurotransmisores y no) capaces de inducir la activación de las vías de
fosforilación por PKA y PKC y, por lo tanto potenciales reguladores de la actividad
HAChT y de la actividad del Terminal colinérgico.
xi
CAPITULO II
ANTECEDENTES
Acetilcolina
La acetilcolina es el neurotransmisor sintetizado y liberado por las neuronas
colinérgicas, que actúa en las células nerviosas colinoceptivas y en las células de los
tejidos inervados por ellas. La estructura química de la acetilcolina es:
(CH3)3N+-CH2-CH2-O-CO-CH3
La actividad neurofisiológica de la acetilcolina es conocida desde el inicio del
siglo XX, siendo la primera sustancia identificada como neurotransmisor (trabajos de
Dale, Loewi, Feldberg). Denominada en un principio con el vocablo alemán vagusstoff
(sustancia del vago) por sus efectos autonómicos, sucesivamente se comprobó su
función como neurotransmisor en la unión neuromuscular y en el sistema nervioso
central. Es bien conocido su rol neurotransmisor en ganglios autónomos y en las
sinapsis posganglionares parasimpáticos. La acetilcolina es además el neurotransmisor
de las fibras colinérgicas que inervan la médula suprarrenal y de las fibras
posganglionares simpáticas que inervan las glándulas sudoríparas, vasos sanguíneos de
cara, cuello y músculo esquelético.
A nivel central, las neuronas colinérgicas pueden encontrarse en dos formas: (a)
como neuronas de proyección, cuyos cuerpos celulares se encuentran en el tallo
cerebral superior y prosencéfalo basal, o (b) como interneuronas (circuitos locales):
es el caso de las interneuronas que se encuentran en estriado o en núcleo accumbens.
Las primeras (a) neuronas colinérgicas de proyección en largas rutas provienen de
xii
ocho núcleos, a su vez agrupados en dos áreas: prosencéfalo basal y tallo
cerebral superior (Nestler E., 2001).
El prosencéfalo basal comprende:
(a) Núcleo septal medial (Ch1)
(b) Núcleo vertical de la banda diagonal (Ch2)
(c) Rama horizontal de la banda diagonal (Ch3)
(d) Núcleo basal de Meynert (Ch4)
Los núcleos colinérgicos del tallo cerebral son:
(a) Núcleo pedúnculo-pontino (Ch5)
(b) Núcleo tegmental laterodorsal (Ch6)
(c) Habénula medial (Ch7)
(d) Núcleo parabigeminal (Ch8)
Ch4: proyectan principalmente hacia corteza cerebral frontal, parietal y
temporal. Se piensa que esta proyección juega un papel influyente en la respuesta
cortical a la estimulación sensorial y en el estado emocional.
Ch1, Ch2 y Ch3: proyectan a hipocampo y son consideradas importantes en los
mecanismos de memoria y aprendizaje.
Ch4, Ch5 y Ch6: proyectan a los ganglios basales, no obstante la más importante
innervación colinérgica estriatal es intrínseca; proviniendo de interneuronas
involucradas en algunos de los circuitos neurales de control del movimiento (también
denominados extra-piramidales).
Síntesis de Acetilcolina.
La acetilcolina es sintetizada a partir de dos sustratos, la colina y el acetil
coenzima A, en una única reacción, reversible, catalizada por la enzima Colina Acetil
Transferasa. (ChAT) (EC 2.3.1.6).
xiii
Colina acetil transferasa (ChAT)
La Colina Acetil Transferasa (ChAT) se localiza con alta especificidad en
aquellas regiones del sistema nervioso en donde la síntesis de acetilcolina tiene lugar,
considerándosele por esto un confiable marcador colinérgico presináptico. A nivel
celular aparece localizada in vivo preferiblemente a nivel citosólico, soluble; sin
embargo se ha descrito una forma particulada de la enzima y una asociada a vesículas
sinápticas. La enzima purificada, en cerebro de rata presenta un peso molecular de 67 -
75 kDa y una Km para colina de 0,75 mM y para acetil CoA de 10 µM. (Cooper J.,
1996). La actividad de la enzima aislada, en presencia de concentraciones óptimas de
cofactores y sustratos aparece muy por encima de la tasa de conversión de la colina a
acetilcolina, sugiriendo una “represión” de la actividad de ChAT in vivo. También se ha
demostrado que los inhibidores de ChAT no reducen in vivo la síntesis de acetilcolina,
lo cual podría sugerir (a) ya sea la incapacidad e lograr concentraciones inhibitorias
efectivas localmente o (b) que no se está en presencia de la etapa limitante en la síntesis
del neurotransmisor (Siegel G. et al, 2006).
Aporte de Acetil Coenzima A
La AcetilCoA necesaria para la síntesis de acetilcolina proviene de tres fuentes:
(a) Piruvato formado por acción de la Piruvato deshidrogenada, proveniente de la
mitocondria, (b) Citrato, por acción de la Citrato liasa o del (c) Acetato, mediante la
Acetatotiocinasa. El sistema de transporte del AcetilCoA., formado principalmente en la
mitocondria, hasta la localización citosólica de la Chat ha sido propuesto como una
posible etapa limitante, regulada, en la síntesis del neurotransmisor.
xiv
Aporte de Colina:
La colina es el otro sustrato en la síntesis de la acetilcolina, y no es sintetizada en
las neuronas (Okuda T. & Haga T., 2003). Se sintetiza en el hígado, y es transportada al
cerebro (en forma libre o como fosfolípido). La mitad, aproximadamente, de la colina
empleada en la síntesis de acetilcolina, proviene de la hidrólisis de la acetilcolina por
acción de la acetilcolinesterasa. Otra parte de la colina proviene del catabolismo de la
fosfatidilcolina (aunque algunos [Tûcek S., 1993] señalan que esta sería una fuente
poco probable). Estas fuentes de colina parecen ser particularmente importantes en el
Sistema Nervioso Central, dadas las dificultades con que la colina atraviesa la barrera
hemato-encefálica.
Todas las células de mamífero están dotadas de un sistema de captación de
colina de baja afinidad (LAChT: Low Affinity Choline Transporter), pues la colina no
es capaz de atravesar libremente las membranas celulares. La neurona colinérgica, sin
embargo posee un sistema específico de captación de colina de alta afinidad (HAChT:
High Affinity Choline Transporter), cuya función está estrechamente asociada a la
síntesis y liberación de acetilcolina.
Almacenamiento y liberación de Acetilcolina.
La acetilcolina, una vez sintetizada es almacenada en vesículas, gracias a la
acción del Transportador Vesicular de Acetilcolina (VAChT: Vesicular Acetylcholine
Transporter). Esta proteína puede ser inhibida por el compuesto L-Vesamicol. La
captación de acetilcolina por parte de las vesículas ocurre gracias a una ATPasa de
protones, en forma de un Contra-Transporte H+ - Acetilcolina. L-Vesamicol es capaz
de inhibir también la liberación de acetilcolina, hecho que sustenta el concepto de que la
Vesícula es el lugar desde donde se libera la acetilcolina. La liberación de Acetilcolina
ocurre por exocitosis vesicular dependiente de calcio.
Receptores Colinérgicos y Acetilcolinesterasa.
A nivel post sináptico la acetilcolina actúa sobre dos tipos de receptores:
xv
(a) Receptor Colinérgico Nicotínico: son canales con compuerta activada
por ligando; están conformados por 5 subunidades organizadas
alrededor de un poro central. Su activación por la acetilcolina conlleva
una rápida entrada de Na+ y Ca2+, con la consiguiente despolarización
celular.
(b) Receptor Colinérgico Muscarínico: son receptores metabotrópicos
pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G.
Se han clonado 5 tipos (M1 a M5): los M1, M3 y M5 se acoplan a
proteínas Gq, activando Fosfolipasa C (PLC) mientras que M2 y M4 se
acoplan a Gi, inhibiendo la actividad de la adenilatociclasa; además
producen una rápida activación de los Canales de Potasio Rectificadores
dependientes de Proteína G. (GIRK´s).
La acción en la sinapsis de la acetilcolina termina al ser hidrolizada por la
enzima acetilcolinesterasa (AChE) (EC 3.1.1.7), a colina y acetato. AChE puede
hidrolizar hasta 1000 moléculas de acetilcolina por segundo por molécula de AChE. Se
encuentra en el citoplasma y al hacia el exterior en la membrana celular, de modo que
puede actuar sobre la acetilcolina intra- y extracelular. El knock-out total del gen de
AChE, da lugar a ratones con temblores, déficit en el crecimiento y alteraciones
neurológicas (Siegel G., 2006).
El Transportador de Colina de Alta Afinidad (HAChT).
Desde una perspectiva histórica, es a partir de los años ´60 y ´70 del siglo
pasado, que diversos grupos de investigadores comenzaron a estudiar y caracterizar el
fenómeno de la captación de colina, empleando principalmente sinaptosomas
preparados a partir de terminales nerviosos. Tatsuya Haga, en 1971 en su clásico trabajo
y Tesis Doctoral “Synthesis and release of [14C]Acetylcholine in Synaptosomes”,
reportaba que (a) la mitad de la colina marcada captada por sinaptosomas era utilizada
para la síntesis de acetilcolina, y que (b) esta proporción además dependía de la
concentración de la colina marcada en el medio de incubación, ocurriendo con
concentraciones en el rango micromolar (1 -5 µM de colina). Además señaló que (c) la
cantidad de acetilcolina sintetizada por los sinaptosomas aumentaba en forma paralela
xvi
con el incremento de la concentración de Na+ en el medio de incubación: y que (d) el
efecto del Na+ sobre la captación de colina dependía de la concentración de colina en el
medio. Es decir, pone en evidencia que en un determinado rango de concentraciones de
colina (cercana, además, a la concentración plasmática de colina), aproximadamente la
mitad de la colina captada es empleada en la síntesis de acetilcolina, y que el efecto
estimulador del Na+ en el medio sobre el transporte de colina dependía de la
concentración de esta última en el medio: es decir se trata de un efecto que es evidente
en ese mismo rango de concentraciones de colina (1 -5 µM). Sucesivos trabajos, como
el de Henry Yamamura y Solomon Snyder en 1972, demuestran tras un análisis de la
cinética del transporte de colina en estriado de rata, la presencia de dos componentes en
la captación de colina: un componente de baja afinidad (LAChT), con una Km de ~ 90
µM y uno de alta afinidad (HAChT), con una Km de ~ 1 µM.
Simon J. y Kuhar M.J. en 1975 y 1976, analizan la dependencia iónica y
metabólica del HAChT reportando:
(a) La Dependencia de Sodio: la actividad de HAChT se reducía al disminuir
[Na+], con un máximo descenso de la captación a [Na+] de 40 mM, y una
máxima actividad de HAChT a [Na+] de 150 mM (Fisiológica).
(b) Dependencia de Potasio: Al omitir, en el medio empleado para medir la
actividad del HAChT, el KCl se evidenció una caída en la actividad del
HAChT, aunque no de la magnitud de la provocada por la depleción del
NaCl. No obstante llegó a ser hasta de un 55 %.
(c) Dependencia “Metabólica”: la integridad de la actividad de la ATPasa Na+-
K+ resulta necesaria dado que el tratamiento con Ouabaína inhibe la
actividad HAChT; esto se debería a la necesidad de mantener el gradiente
electroquímico para el sodio, fuerza impulsora de éste sistema de transporte.
Estos mismos autores también evidenciaron en 1975, la asociación existente
entre actividad neuronal y actividad del HAChT. Y ese mismo año Murrin L.C. y Kuhar
M. demuestran la activación del HAChT in vitro mediante el empleo de agentes
despolarizantes: más específicamente observaron un aumento de la Vmax sin cambios
en la Km. Un dato importante es que los autores lograban prevenir dicha activación
mediante el empleo del antagonista del calcio Nifedipina, resultado comprensible en su
xvii
plenitud solo a partir de los trabajos publicados décadas después acerca de ubicación del
HAChT en la neurona colinérgica, como se expone en detalle más adelante.
Otro aspecto que contribuye a caracterizar al HAChT y distinguirlo del LAChT
(además de la diversa Km, así como la dependencia iónica y energética) es la
sensibilidad a la droga hemicolinio-3 (HC-3): 2,2´-(4,4´-bifenileno)-bis(2-hidroxi-4,4-
dimetilmorfolinio bromuro: un agente tóxico capaz de producir parálisis respiratoria y
bloqueo a nivel ganglionar, capaz de prevenir in vivo (solo in vivo) la síntesis de
acetilcolina. HC-3 actúa selectivamente sobre el HAChT, sin interferir con la actividad
de la ChAT. Quedó así evidenciado como ningún depósito endógeno de colina podía
sostener la síntesis del neurotransmisor, y la dependencia del aporte externo de colina.
Estos hallazgos ya señalaban a la actividad del HAChT, y la consiguiente disponibilidad
neuronal de colina, como la etapa limitante en la síntesis de acetilcolina.
Clonación del HAChT.
En los años ´80 y ´90 del siglo XX ulteriores hallazgos acerca de la distribución
del HAChT vieron la luz, pero no es sino hasta el año 2000 cuando Okuda T. et al
consiguen aislar un cDNA capaz de codificar para el HAChT del C. Elegans,
empleando la información disponible en el Proyecto Genoma y un sistema de expresión
en oocitos de Xenopus laevis. Los autores asumiendo que C.Elegans tenía neuronas
colinérgicas y por ende presentaba el HAChT, asumieron que en C.Elegans, el HAChT
era también Na+ dependiente, y procedieron a expresar en los oocitos de Xenopus laevis
aproximadamente 30 cDNAs que se predecía codificaban para transportadores Na+
dependientes como: transportadores de neurotransmisores, transportadores de glucosa
Na+ dependientes, etc. Se trataba de transportadores huérfanos, dado que no se conocía
la molécula por estos transportada. Uno de los RNA obtenidos a partir de cDNA, al ser
inyectado indujo en los oocitos un incremento de 1.5 veces en la captación de [3H]-
colina con respecto l control: este se presentaba además en forma Na+ dependiente y
sensible al HC-3 (Okuda T. y Haga T., 2003).
El HAChT fue sucesivamente caracterizado en otras especies, observándose una
alta homología en la estructura primaria, particularmente entre mamíferos (incluyendo
al humano, con un 93 % de conservación de la secuencia respecto al de rata),
xviii
presentándose como una proteína de 580 aminoácidos. El HAChT no presenta
homología con la familia de transportadores de neurotransmisores: pertenece a la
llamada Familia de Simportadores de Na+ / soluto (SSF), como el SDGT (Sodium-
dependent Glucose Transporter), etc. Entre otros trabajos importantes está el de
Apparsundaram S. et al. (2000), quienes usando la secuencia del provista por Okuda T.
et al. (2000) así como información del Proyecto Genoma Humano clonaron un cDNA
humano que codifica para una proteína de 580 aminoácidos, una masa estimada en 63
kDa, punto isoeléctrico = 4.9. La secuencia nucleotídica y aminoacídica de HAChT
humano está disponible en el GenBank, con N° de acceso: AF276871. El gen que
codifica para HAChT fue localizado en el cromosoma 2 (2q12). HAChT presenta tras
estudiar la secuencia con diversos algoritmos una conformación con 13 dominios
transmembrana, un dominio N-terminal extracelular y un extremo C-terminal
intracelular. Se evidencia además la presencia de sitios consensúales para fosforilación
por
(a) Proteín cinasa C (PKC): presentes en el dominio intracelular entre las asas 9
y 10 [Ser367 y Ser373]) así como a nivel C-terminal [Tre558].
(b) Proteín cinasa A (PKA): presentes entre las asas 7 y 8 y en la región C-
terminal [Ser522 y Ser 550].
(c) Además de 12 residuos adicionales de serina y 10 de treonina que pueden
representar otros sitios de fosforilación regulatoria.
(d) También sitios para Glicosilación de la proteína.
Figura 1. El HAChT en la membrana plasmática: sitios consensúales
para fosforilación por PKA y PKC y para glicosilación de la proteína.
xix
El HAChT se co-localiza con otros marcadores colinérgicos presinápticos
(ChAT, VAchT) en otros mamíferos, como ha sido documentado en estudios de
hibridación in situ, Northern Blot e Inmunohistoquímica (Misawa H. et al., 2001;
Kobayashi Y. et al, 2002).
Okuda T. et al, (2002) han descrito recientemente como la sustitución de un
residuo de valina por isoleucina en el III dominio transmembrana de la proteína,
provoca una disminución de la Vmax del 40 % aproximadamente en el humano y en
C.Elegans, sin modificaciones en la afinidad por la colina, el NaCl o el [3H]-
Hemicolinio.
HAChT: Funcionamiento y Regulación de su Función.
Si la Km de la Colina Acetil Transferasa (ChAT) por la colina resulta in vivo
igual a la determinada para la enzima aislada, es de esperarse que la síntesis de
acetilcolina se incremente con una mayor disponibilidad de colina; la disminución en la
síntesis y liberación de acetilcolina, que como se ha dicho, ocurre en presencia del
inhibidor específico del HAChT, HC-3, sin que se altere la actividad de la ChAT o del
VAChT, indica que la actividad del HAChT es el factor limitante en la síntesis de
acetilcolina; por lo menos en cuanto a regulación a corto plazo se refiere.
En los últimos dos años, han sido grandes los aportes hechos para comprender
mejor la regulación del funcionamiento del HAChT. Hasta hace poco era
completamente desconocido el mecanismo mediante el cual un incremento en la
actividad neuronal colinérgica se asociaba a un aumento de la Vmax del HAChT,
aunque ya algunos autores (Saltarelli M. et al. en 1987) habían señalado como en
condiciones despolarizantes (usando 40 mM de KCl en slices de estriado de rata) se
incrementaba la actividad de HAChT así como en ensayos de unión, la Bmax del [3H]-
Hemicolinio-3 sin cambios en la Kd: indicando la presencia de más sitios de unión
(HAChT) en estas condiciones: sugiriendo en dicha ocasión los autores la posibilidad de
que hubiera transportadores “ocultos”, pues el [3H]-Hemicolinio-3 se une al HAChT
que se encuentra expuesto (y funcional) en la membrana plasmática.
xx
En el 2003, Ferguson S. et al. y Ribeiro F.M. et al., en trabajos diferentes,
demostraron que, no obstante ser una proteína “funcional” al encontrarse en la
membrana plasmática, el HAChT:
(a) Se encontraba –sorpresiva- y principalmente a nivel intracelular,
específicamente localizada en el compartimiento endosómico y a nivel de una
sub población de las vesículas sinápticas, donde se co-localiza con el
Transportador Vesicular de Acetilcolina (VAChT).
(b) Se demostró además que la despolarización desencadena un incremento en la
actividad HAChT, asociado a un incremento del número de HAChT en la
membrana plasmática sináptica.
(c) Que este aumento (de la Vmax de HAChT y su densidad en la membrana) es
Ca2+ dependiente y sensible al pretratamiento con Toxina Botulínica, indicando
como la fusión de las vesículas sinápticas a la membrana plasmática es
indispensable para que ocurra este incremento en la captación de colina tras la
despolarización.
(d) Que HAChT se encuentra constantemente reciclando entre el compartimiento
endosómico intracelular y la membrana plasmática: trasladándose a esta última
en las vesículas sinápticas involucradas en la liberación de acetilcolina (junto a
VAChT), para posteriormente regresar al compartimiento endosómico por
endocitosis dependiente de Clatrina.
Estos hallazgos explican el mecanismo fisiológico, antes desconocido, que
asocia el incremento de la actividad neuronal al aumento de la captación de colina –vía
HAChT- en la neurona colinérgica. En su conjunto, además, esto significa un rol
fisiológico novedoso de las vesículas sinápticas en la homeóstasis del neurotransmisor.
Otro importante descubrimiento, más reciente aún, ha sido el de Gates J. et al.
(2004). Estos investigadores evidenciaron por primera vez en sinaptosomas de
hipocampo y estriado de ratón, que:
(a) El HAChT es una fosfoproteína, cuya presencia en la superficie
celular y su actividad transportadora está regulada por la Proteína
xxi
cinasa C (PKC) y por la actividad de las Proteín-Fosfatasas 1 y 2A
(PP1/PP2A).
(b) Que la activación de PKC mediante el empleo de los ésteres de
Forbol, β - PMA (Miristolato-Acetato de Forbol β) y β - PdBu
(Dibutirato de Forbol β) a la dosis de 1 µM induce una disminución
de la Vmax de HAChT en forma dosis y concentración dependiente,
sin cambios en la Km.
(c) El tratamiento de los sinaptosomas con los inhibidores de PP1/PP2A,
Ácido Okadaico (OKA) y Calyculina A (Cal A) produjo un patrón de
modificación de la actividad HAChT similar al obtenido con ésteres
de forbol.
(d) La activación de PKC y la inhibición de PP1/2A, reducen la
presencia de HAChT en la superficie celular en más de un 30%.
Estos autores, sin embargo, no observaron cambios en la cantidad de HAChT
presente en la membrana celular ni en su Vmax mediante el empleo del inhibidor de
PKC Staurosporina (1 µM, 45´), lo que podría indicar la ausencia de una inhibición
tónica, por parte de PKC. Este dato, visto el efecto que el solo tratamiento con OKA o
Cal A tienen sobre estos parámetros, sugiere que otros mecanismos de fosforilación
puedan intervenir regulando tónicamente la localización intracelular y el funcionalismo
del HAChT.
No obstante el trabajo de Gates J. et al. aquí mencionado, constituya la más
completa documentación existente en la literatura acerca de la fosforilación como
mecanismo de regulación del HAChT, debe tenerse en cuenta que la estructura del
HAChT no presenta únicamente sitios consensúales para fosforilación por PKC, y muy
poco se ha dilucidado el papel que otras Proteína cinasas jueguen en este sentido.
Ya desde la pasada década de los ´90 algunos trabajos habían presentado
resultados que, a veces sin confirmar o hasta siendo algunos contradictorios entre ellos,
habían señalado el posible papel de PKC en la regulación del HAChT: Ford B. et al
(1999) evidenció en rebanadas de cerebro de Limulus que el tratamiento con β-PMA o
β-PdBu disminuían la captación de colina. Issa A. et al. (1996) demuestran la inhibición
del HAChT mediante el empleo de Acido Okadaico y Caliculina A, sugiriendo el rol
xxii
modulador de la actividad fosfatásica en la síntesis de acetilcolina. Pero por otra parte,
Vogelsberg V. et al. (1997) evidencian un incremento de la actividad HAChT y unión
de [3H]-HC3 en sinaptosomas de hipocampo, estriado y corteza frontal de ratón tras
inyectar a nivel cerebro ventricular db - AMP –cíclico (db-cAMP), un análogo del
segundo mensajero AMP cíclico (cAMP). Además presentan datos adicionales
(aumento de actividad HAChT con el inhibidor de fosfodiesterasas IBMX, con
Forskolina) que indicarían un rol estimulante sobre la actividad de HAChT, de la
fosforilación por parte de la Proteína cinasa A (PKA). No obstante, los resultados
obtenidos en presencia de Ácido Okadaico contradicen a Issa A. et al (1996) e incluso al
recientísimo trabajo de Gates J. et al. (2004), dado que reportan un efecto estimulante
sobre HAChT del tratamiento con Ácido Okadaico. Los resultados de Vogelsberg V. et
al. (1997), por demás, no han sido confirmados ni por los mismos autores ni por otros
grupos más recientemente. Chatterjee T. y Bhatnagar R. (que habían sugerido la
presencia de dos estados funcionales distintos para el HAChT), en 1990 señalan la
conversión en presencia de ATP, y a través de un mecanismo dependiente de calcio, de
todos los sitios de unión para [3H]-HC3 a un estado de baja afinidad, conversión que era
prevenida por Gossypol (inhibidor de PKC), pero no por Staurosporina, ni por
Trifluoperazina inhibidor de Proteín cinasa dependiente de Calmodulina (CaM cinasa).
Por otra parte los autores demostraron que tanto Gossypol como la Trifluoperazina
inhibían la captación de colina en sinaptosomas, mientras que la Staurosporina era
ineficaz en ese sentido. En otro trabajo, Yamada et al. (1991) demuestran como en
condiciones despolarizantes (KCl 40 mM), la trifluoperazina (TFP) inhibe ya sea el
aumento de Bmax (sin cambios en Kd) en la unión de [3H]-HC3 (anteriormente
demostrado por Saltarelli et al. en1988), como el incremento en la captación de colina
inducido por la despolarización.
Este último resultado, con el conocimiento actual, podría atribuirse, al menos
parcialmente, al efecto inhibidor de la TFP sobre la CaM cinasa que fosforila la
Sinapsina I en la vesícula sináptica: al quedar en forma no fosforilada, la Sinapsina I fija
la vesícula sináptica al citoesqueleto, impidiendo su liberación y por ende la
incorporación de un mayor número de transportadores HAChT (que se encuentran en la
vesícula) a la membrana plasmática. Esto daría cuenta del efecto preventivo de TFP
sobre el aumento de la captación de colina en condiciones despolarizantes.
xxiii
Resultan por otra parte evidentes, al analizar retrospectivamente la literatura, las
contradicciones existentes entre estos diversos trabajos. Solo los resultados publicados
por Gates J. et al. (2004) con respecto al rol de la fosforilación del HAChT por PKC en
sinaptosomas, evidenciando con diversas metodologías el rol fisiológico de este
mecanismo en la homeóstasis de la colina y con la evidencia directa de HAChT como
fosfoproteína, parecen presentarse como hecho científico asentado, mientras que poco o
nada se ha profundizado en el posible rol de las Proteínas cinasas A (PKA) y/o Ca2+ /
Calmodulina dependiente (CaM cinasa).
Dopamina y sus Receptores.
La Dopamina es una catecolamina sintetizada a partir del aminoácido precursor
tirosina. La tirosina, concentrada en las neuronas dopaminérgicas es convertida en L-
dihidroxifenilalanina (L-DOPA) mediante hidroxilación en la posición 3 por parte de la
enzima “Tirosina Hidroxilasa” (TH): esta enzima es la etapa limitante en la síntesis de
catecolaminas; se presenta como un homotetrámero que requiere Fe2+ como cofactor,
así como oxígeno molecular y tetrahidrobiopterina. En las neuronas dopaminérgicas se
expresa otra enzima, la DOPA descarboxilasa, más correctamente denominada
“Descarboxilasa de Aminoácidos Aromáticos” (AADC, por las siglas en inglés): esta
enzima, que requiere del cofactor Piridoxal fosfato y se localiza a nivel citoplasmático,
cataliza la remoción del grupo carboxilo de la L-DOPA para formar Dopamina y CO2,
última etapa en la síntesis del neurotransmisor.
En el cerebro de rata, se distinguen 3 núcleos dopaminérgicos principales:
(a) Sustantia Nigra (pars compacta): proyectan al n. caudato y putamen
(neoestriado), formando el sistema dopaminérgico Nigro-estriatal.
(b) Área Tegmental Ventral: proyectan a estructuras del sistema límbico: n.
accumbens, corteza prefrontal y cingulata, formando el sistema
dopaminérgico meso-limbo-cortical.
(c) Núcleo Arcuato hipotalámico: involucrada en la regulación endocrina, vía
hipófisis, en el denominado sistema dopaminérgico tuberoinfundibular.
xxiv
El sistema dopaminérgico meso-limbo-cortical, aparece involucrado en los
mecanismos de refuerzo – gratificación en las drogas de abuso y como blanco de acción
de drogas antipsicóticas (Kandel E. et al, 2001).
El Sistema Nigro-estriatal está involucrado en el control del movimiento
voluntario y la Enfermedad de Parkinson, siendo la dopamina liberada a nivel estriatal
un componente crítico en estos circuitos de los ganglios basales: la muerte de neuronas
dopaminérgicas en la Sustantia Nigra (pars compacta; las neuronas de la pars reticulata
son esencialmente GABAérgicas) como ocurre en la Enfermedad de Parkinson, se
traduce en una disminución de los niveles de dopamina a nivel estriatal y graves
alteraciones de la motilidad.
El estriado recibe aferencias excitadoras glutamatérgicas desde la corteza, que
inervan dos grandes grupos de neuronas GABAérgicas de proyección espinosa media a
este nivel:
(a) Un grupo que coexpresa Dinorfina y Sustancia P y proyecta
directamente a la parte interna del Globo Pálido (GPi) y la pars
reticulata de la Sustantia Negra.(SNr).
(b) Otro que expresa encefalina y neurotensina envía prolongaciones
indirectamente al GPi y SNr, por medio de proyecciones al segmento
externo del Globo Pálido (GPe) y al núcleo SubTalámico (STn) y
desde aquí a los núcleos de eferencia (GPi y SNr).
Las estructuras de eferencia (GPi y SNr) proyectan al tálamo y este, finalmente a
la corteza. La vía directa proporciona una retroalimentación positiva y la indirecta una
retroalimentación negativa en el circuito ganglios basales „ tálamo. La activación de la
vía directa hace que las neuronas activas del GPi y que tónicamente inhiben, se
inactiven produciendo deshinibición transitoria del tálamo; la activación de la vía
indirecta aumenta la inhibición. La activación de la vía directa facilita el movimiento,
mientras que la activación de la indirecta lo inhibe.
Las neuronas dopaminérgicas de la Sustantia Nigra (pars compacta) proyectan a
las neuronas estriatales que activan ambas vías modulándolas: las neuronas estriatales
que proyectan a la vía directa presentan receptores D1 (que facilitan la transmisión) y las
que lo hacen a la vía indirecta presentan receptores D2. La inervación dopaminérgica
xxv
disminuye la inhibición tálamo-cortical que finalmente facilita los movimientos
iniciados a nivel cortical. (Kandel E., 2001). No obstante, se debate existe aún sobre el
preciso rol funcional de la dopamina en el estriado.
Los Receptores de la Dopamina clonados son 5, D1 a D5 , pertenecientes a la
Superfamilia de receptores acoplados a proteínas G y se clasifican en dos grandes
subgrupos:
(a) Tipo D1: comprende los receptores D1 y D5. Actúan acoplados a proteína Gs
y presentan alta afinidad por benzazepinas como SCH-23390. Su activación
se asocia a un incremento de la actividad de la adenilatociclasa (AC), con
aumento del AMP cíclico (cAMP) intracelular, y activación de la PKA.
(b) Tipo D2: incluye los receptores D2, D3 y D4. Se acoplan a proteína Gi, con
inhibición de la AC y disminución de la producción intracelular de cAMP.
Interacciones entre Sistema Colinérgico y Dopaminérgico en el Sistema
Nervioso Central.
La complejidad y significado funcional de las interacciones entre el sistema
dopaminérgico y colinérgico en el sistema nervioso central, así como la extensión de
estas interacciones, no ha sido aún aclarada. Un ejemplo de la importancia que un
mejor conocimiento de éstas puede tener, lo constituye en el ser humano la enfermedad
de Parkinson (EP). Esta es una común afección descrita por vez primera hace casi 200
años. El sistema colinérgico tiene un rol crucial en el control del movimiento que ejerce
el estriado y, como es de esperar, esta región contiene algunos de los más altos niveles
del sistema nervioso central de acetilcolina, receptores colinérgicos y otros de sus
marcadores. La administración de antagonistas de los receptores colinérgicos representa
una de los primeros pasos terapéuticos en la enfermedad de Parkinson. La mejoría de
los síntomas observada sugirió la hipótesis de que el defecto subyacente fuera un
desbalance entre los sistemas dopaminérgico y colinérgico, consecuencia de la pérdida
de neuronas dopaminérgicas. Hoy en día se sabe que la pérdida de terminales
dopaminérgicos interfiere sobre la actividad colinérgica, aunque en un modo menos
protagónico, desde el punto de vista fisiopatológico, que el anteriormente propuesto
(Calabresi P. et al, 2000).
xxvi
El cuerpo estriado presenta además interneuronas (que inervan ampliamente a
sus neuronas de eferencia) de diferentes tipos: unas colinérgicas grandes y otras más
pequeñas (productoras de GABA, somatostatina, NO y neuropéptido Y). Estas
interneuronas modulan la actividad GABAérgica de las neuronas de proyección
espinosa media así como de los terminales glutamatérgicos y dopaminérgicos que
inervan al estriado. Estas interneuronas parecen tienen gran importancia en el efecto de
inhibición tónica ejercido por el estriado: Se postula que la actividad neta de las
neuronas estriatales de proyección (GABAérgicas) sería resultado del equilibrio entre el
efecto inhibidor de la dopamina y el efecto excitatorio de la acetilcolina (vía receptores
muscarínicos): esto podría contribuir a explicar que antagonistas muscarínicos mejoren
la sintomatología en la EP, dado que en presencia de un déficit de actividad inhibitoria
de la dopamina a nivel estriatal, prevalecería en modo suprafisiológico el efecto
excitatorio de la acetilcolina; efecto que los antagonistas muscarínicos, aplicados
terapéuticamente, podrían evitar (Nestler E., 2001).
Se postula para la EP que la pérdida de las aferencias dopaminérgicas desde la
Sustantia Nigra (pars compacta) hasta el cuerpo estriado, induce una mayor actividad de
la vía indirecta y una menor actividad de la vía directa, debido a los diferentes efectos
de la dopamina sobre ambas vías, a través de los receptores dopaminérgicos D1 y D2
respectivamente. Se ha demostrado que la denervación crónica dopaminérgica afecta en
modo importante la neurotransmisión a nivel estriatal, sin que se haya podido dilucidar
hasta la actualidad con precisión el modo en que esto ocurre.
La fuente principal de acetilcolina a nivel estriatal son las grandes interneuronas
colinérgicas (20 – 50 µM), las cuales forman parte de una extensa red neural, donde
ellas representan el 1 – 2 % del tota l de la población neuronal. Poseen una arborización
dendrítica más extensa que las neuronas de proyección, lo que indica el rol que pueden
jugar integrando las diversas aferencias al estriado y proyectando sobre extensas áreas y
múltiples poblaciones neuronales. Estas interneuronas (no obstante la mayor parte de las
aferencias que reciben son fibras glutamatérgicas de origen cortical y talámico) reciben
aferencias dopaminérgicas (Calabresi P. et al, 2000), cuyo papel no ha sido aún
dilucidado del todo. Imperato A. et al (1993) en experimentos realizados empleando la
técnica de microdiálisis cerebral en estriado de rata, evidenciaron un incremento en la
xxvii
liberación de acetilcolina tras la administración de neurolépticos (sulpiride, haloperidol
y clozapina). La administración del antagonista de los receptores D1, SCH23390, redujo
la liberación de acetilcolina al ser administrado solo y fue capaz de prevenir el
incremento en la liberación de acetilcolina al ser administrado 5 minutos antes que el
haloperidol. Estudios electrofisiológicos (Záborsky L. et al., 1993) han evidenciado
como la administración sistémica de agonistas D1 incrementó la tasa de disparo (firing
rate) en un 83 % a nivel de pálido ventral (área con abundante población colinérgica),
mientras que antagonistas D2 selectivos la disminuyeron en un 62 %. Otro estudio que
sugiere un rol regulador de la dopamina sobre la función colinérgica en estriado es el de
Rodríguez - Puertas et al. (1994) quienes analizando el estado de diversos marcadores
colinérgicos en la EP, estudiaron, entre otros marcadores, la unión de 3H-hemicolinio-3
en estriado y a nivel de corteza frontal de pacientes con EP, evidenciando un incremento
de Bmax para 3H-hemicolinio-3 en corteza frontal del 60 % en los pacientes con EP
respecto a los controles y en estriado incrementos del 59 % en n. caudato y 145 % en
putamen. Ha sido también descrita una reducción en la actividad de la colina acetil
transferasa (ChAT) a nivel de corteza prefrontal en pacientes con EP, especialmente en
los casos asociados a marcado déficit cognitivo (Mattila P. M., 2001). Resultados como
estos sugieren que en la EP el llamado “desbalance” estriatal entre actividad
dopaminérgica y colinérgica ocurre no solamente por el déficit dopaminérgico y la
consiguiente prevalencia (por “omisión”) de la actividad colinérgica; sino que el déficit
en la señal dopaminérgica proveniente de la Sustantia Nigra (pars compacta) ocasiona
una incremento en la actividad colinérgica, cuya atenuación mejora las condiciones en
el paciente.
A pesar de estos datos, resulta verdaderamente escaso el conocimiento
disponible acerca de las vías de señalización mediante las cuales la dopamina produciría
cambios en la actividad de la neurona colinérgica, y si estas interacciones ocurren en
igual forma en otras regiones el sistema nervioso central. A nivel de prosencéfalo basal,
estudios de marcaje con anticuerpos anti-tirosina hidroxilasa (TH) sugieren que al
menos una subpoblación de neuronas septohipocampales colinérgicas recibiría aferencia
dopaminérgica, presentando receptores D1 y D2. El significado fisiológico de estas
interacciones permanece aún sin esclarecer.
xxviii
No obstante se hayan presentado evidencias de una posible regulación de la
actividad colinérgica a través de la ChAT como el de Mattila P. M. en la EP, ya
mencionado o el de Loureiro D. S. et al., (2001), sobre regulación de ChAT por parte de
aminoácidos excitatorios, la etapa limitante en la síntesis de acetilcolina, como ya se
dijo, es el aporte de colina a través del HAChT; no hay datos disponibles, hasta la fecha,
acerca de la posible regulación de la neurona colinérgica por parte de la dopamina a
través de mecanismos de fosforilación / defosforilación de proteínas. La dopamina,
como se señaló antes, es capaz de modificar la actividad de la adenilatociclasa en uno u
otro sentido actuando a través de los receptores tipo-D1 o tipo-D2, acoplados
funcionalmente a proteínas Gs y Gi respectivamente, y por ende de modificar los
niveles de cAMP intracelulares: aumentándolos (vía tipo-D1) o disminuyéndolos (tipo-
D2). El HAChT es una fosfoproteína, capaz de ser fosforilada por PKC (Gates J. et al,
2004) lo que induce cambios en su localización celular y en la actividad captadora de
colina de la neurona colinérgica. No se han presentado aún evidencias sobre posibles
sustancias capaces de modificar en modo heterólogo la actividad del terminal
colinérgico actuando mediante esta vía. De igual manera, la eventual fosforilación del
HAChT por parte de Proteín cinasa A y las eventuales consecuencias de esto,
permanecen sin esclarecer.
La capacidad de la dopamina de regular a través de sus receptores los
mecanismos de fosforilación, vía cAMP - PKA, aunado al hecho demostrado de la
presencia de sitios consensúales para PKA en la estructura del HAChT, hacen surgir la
posibilidad de que un mecanismo de regulación de la actividad colinérgica por parte de
la dopamina pueda ser el de la fosforilación / defosforilación del HAChT: esto podría
modificar la actividad del HAChT, la disponibilidad de colina (etapa limitante) y,
finalmente, la producción de acetilcolina en la neurona colinérgica.
Retina y Sistema Colinérgico.
En la retina existen diferentes poblaciones celulares, organizadas en capas.
Tres clases principales de neuronas se distinguen:
(a) Fotorreceptores: Bastones y Conos, que se encuentran en la Capa
Nuclear Externa CNE).
xxix
(b) Interneuronas: Células Amácrinas, Células Bipolares y Células
Horizontales que ocupan la Capa Nuclear Interna (CNI).
(c) Células Ganglionares: situadas en la Capa Ganglionar (CG).
Los fotorreceptores, células bipolares y horizontales forman sinapsis entre ellas
en la Capa Plexiforme Externa (CPE); por su parte, las células amácrinas, bipolares y
ganglionares forman sinapsis entre sí en la Capa Plexiforme Interna (CPI). El flujo de
señales tiene sentido “Vertical”, en cuanto a la información que desde los
fotorreceptores va a las Células Bipolares y desde estas hasta las Células Ganglionares
(cuyos axones conforman el nervio óptico) y sentido “Horizontal” mediante los
contactos sinápticos establecidos por las Células Horizontales en la CPE y por las
Células Amácrinas en la CPI. (Kandel E., 2000).
Si además de tomar en cuenta estas poblaciones “mayores” de neuronas
retinianas, se tiene cuenta de los diversos sistemas de neurotransmisión que se expresan
dentro de cada uno de estos fenotipos celulares pueden entonces distinguirse
aproximadamente 50 subtipos de neuronas retinianas (Guimarães M.Z.P. et al., 2001).
Las Células de Müller, constituyen otro grupo celular, de tipo glial, que atraviesa
completamente los diferentes estratos de la retina y recientemente (Fisher A. y Reh T.,
2001) se ha demostrado su potencial como fuente para la regeneración neuronal
retiniana.
La retina de pollo expresa los diferentes marcadores colinérgicos, pre- y post-
sinápticos. El receptor colinérgico nicotínico (nAChR) aparece tempranamente en la
retina de pollo; algunos tipos de nAChR se evidencian hasta dos días antes que la
actividad ChAT (Torrão A. y Britto L., 2002). El receptor colinérgico muscarínico está
presente ya en embriones de pollo de 5,5 días y aumenta hasta alcanzar un máximo a la
edad de 13 – 14 días (Bmax de 320 fmol / mg de proteína, en ensayo de unión de [3H]-
Quinuclidinillbenzilato ([3H]-QNB)), con una distribución similar a la descrita para el
nAChR y actividad colinesterásica (Sugiyama H. et al., 1977). En 1977, Baughman R. y
Bader C. evidenciaron, mediante estudios autoradiográficos con [3H]-Colina y
determinación indirecta de la actividad HAChT, la presencia de células colinérgicas en
la retina de pollo adulto a nivel de Capa Nuclear Interna, correspondiendo a células
amácrinas y Capa Ganglionar, donde las células colinérgicas son células amácrinas
xxx
desplazadas. Estas células proyectan hacia la Capa Plexiforme Interna, como se
evidencia empleando el marcaje para la colinesterasa o mediante la unión de [3H]-QNB
(Sugiyama H. et al., 1977). Otros marcadores presinápticos son evidenciables en retina
de pollo, como la ChAT, (cuya inmunoreactividad también aparece localizada nivel de
Capa Nuclear Interna y Capa Ganglionar) o el VAChT cuya detección mediante
Inmunoblot es posible en retina de pollo adulto o en embriones de más de 19 días
(Loureiro D.S. et al, 2002). En cultivos celulares monocapa de retina de embrión de
pollo, un 5 - 10 % del total de las células, aproximadamente, son células amácrinas
colinérgicas. (Puro et al., 1977). En este tipo de cultivos (monocapa), las neuronas
provenientes de embriones de pollo de 8 -9 días de edad (E 8-9), son capaces, al cabo de
varios días, de desarrollar los diferentes marcadores colinérgicos: captación de [3H]-
Colina mediante HAChT, conversión de [3H]-Colina en [3H]-Acetilcolina, liberación de
[3H]-Acetilcolina en respuesta a estímulos despolarizantes y expresión de actividad
ChAT, en niveles comparables a los presentados por la retina intacta. No obstante, en
los cultivos monocapa (y no en los agregados) se observa una disminución importante
de la actividad ChAT a partir del 7º día en cultivo (C7), así como de la liberación de
[3H]-Acetilcolina tras estimular con KCl 44 mM. La actividad HAChT, por el contrario,
no sufre alguna disminución significativa entre los días 4º y 12º en cultivo. Esta
“desdiferenciación” colinérgica es prevenida en cultivos monocapa mediante el
tratamiento con medio condicionado proveniente de cultivos agregados de 6 a 10 días
(C6-10), y no de cultivos C3, indicando esto que la estabilización del fenotipo colinérgico
en cultivo requiere de señales externas en un período específico y crítico de tiempo, así
como una adecuada interacción entre diversas poblaciones celulares, que sí se da en los
cultivos agregados (De Mello F. et al., 1990). Las células colinoceptivas en la retina
incluyen células bipolares, ganglionares y amácrinas, mientras que las células amácrinas
pueden ser también dopaminérgicas y GABAérgicas, glicinérgicas o purinérgicas
Los cultivos celulares de retina de embrión de pollo han demostrado ser un
modelo biológico experimental válido y versátil para el estudio de las interacciones
neuronales a nivel del Sistema Nervioso Central. Es un cultivo primario sencillo en su
montaje, y en el que (si se mantienen las condiciones adecuadas) las células retinianas
se dividen, desarrollan y presentan características muy similares a las que presentan las
células en la retina intacta. En este trabajo se emplean cultivos celulares primarios, del
xxxi
tipo monocapa densa, de embriones de pollo de 8 días de edad, en el que se evidencian
tanto las neuronas como las células gliales típicas del tejido retiniano.
xxxii
CAPITULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales.
� Ácido Ascórbico, Riedel – De Haen.
� Ácido Glutámico, Sigma.
� Acrilamida, Promega.
� Adenosina, Sigma.
� Albúmina sérica bovina (BSA), Santa Cruz.
� Anticuerpo Policlonal Anti-HAChT de Rata, obtenido en conejo, Chemicon.
� Anticuerpo anti-IgG de conejo, obtenido en cabra, Chemicon.
� Aprotinina, Sigma.
� Azul de Bromofenol, USB.
� Bisacrilamida, Sigma.
� Bradford (Solución), BioRad.
� Dimetilformamida, Sigma.
� Dopamina – HCl, Sigma.
� DTT, Sigma.
� EHNA (erythro-9-Amino-β-hexyl-α-methyl -9H- purine -9-ethanol
hydrochloride), Sigma
� Forskolina, Sigma.
� HC-110, Kodak.
� Hemicolinio-3, ICN.
� Isobutil-metilxantina (IBMX), Sigma.
xxxiii
� Kainato, Sigma.
� Leupeptina, Sigma.
� Luminol, Sigma.
� Metanol, Merck.
� Minimal Essential Medium (MEM), Sigma.
� Pargilina, Sigma.
� PdBu (Dibutirato de Forbol), Sigma.
� Película MIN-R, Kodak.
� Peróxido de hidrógeno, IQE.
� Persulfato de Amonio, Promega.
� PMA (Miristolato-acetato de forbol), Sigma.
� PMSF, Sigma.
� POPOP, Sigma.
� PPO, Sigma.
� Raclopride, Sigma.
� SDS, Sigma.
� SCH23390, Sigma.
� Sp-cAMPS (Sp-adenosina 3´,5´-monofosfotioato cíclico), Sal de
trietilamonio, Sigma.
� Suero Fetal Bovino, Gibco BRL.
� Sulfato de Eserina (Fisostigmina), Sigma.
� TEMED, USB.
� Tripsina, Gibco BRL.
� Tween 20, Riedel – De Haen
� [3H]-Colina, NEN. (Actividad: 75 Ci / mmol).
� 4-Bifenilfenol, Merck.
xxxiv
Cultivos Celulares.
Se prepararon cultivos celulares primarios del tipo monocapas densas a partir de
retinas de embrión de pollo. La preparación de los cultivos celulares se llevó a cabo
según la metodología descrita por De Mello et al, (1990), modificado. Huevos fértiles
obtenidos de gallinas de la raza Issa-Brown fueron colocados frescos en un incubador
ad hoc (a 38º C, ventilado, humidificado y con rotación) por un período de ocho días.
Posteriormente, en campana de flujo laminar (y previo lavado externo con isopropanol)
los huevos fueron abiertos, los embriones extraídos con pinzas estériles y colocados en
una cápsula de Petri. Se descartaron aquellos embriones cuyo tamaño no se
correspondiera con el apropiado para la edad, así como aquellos que presentaban
cualquier otro tipo de desviación con respecto al aspecto externo normal.
Sucesivamente, se disecaron los ojos de estos embriones removiendo el parpado
y separando sutilmente el ojo del resto de la cabeza. Los ojos se colocaron en otra
cápsula de Petri con solución salina isotónica de Hanks libre de calcio y magnesio
(CMF), con osmolaridad y pH fisiológicos. Todo el procedimiento se llevó a cabo
dentro de una campana estéril de flujo laminar horizontal. Se removieron (mediante
disección manual con pinzas) cuidadosamente el cristalino y el humor vítreo y se
procedió a abrir el globo ocular.
La retina, distinguible por su característico color blanco perla, se separó
(levantándola desde la periferia hacia el centro del globo ocular) gradualmente del resto
del ojo hasta quedar únicamente unida a este por el nervio óptico, que finalmente fue
seccionado.
Las retinas así obtenidas se colocaron en un tubo de baquelita y fueron
sometidas a digestión con tripsina al 0,05 %, por un lapso aproximado de diez minutos a
37º C. Se centrifugaron entonces a 500 g por 1 minuto, descartándose el sobrenadante
para interrumpir la reacción. Las retinas así digeridas fueron resuspendidas en medio de
cultivo: Minimal Essential Médium (MEM) o Basal Medium Eagle (BME) con 5 % de
Suero Fetal Bovino y Gentamicina (50 µg /mL). La disociación final se llevó a cabo de
forma mecánica, pipetando dicha suspensión unas doce veces aproximadamente contra
el fondo del tubo de baquelita, evitando cuidadosamente el burbujeo. La suspensión
xxxv
celular obtenida fue diluida en el volumen final de medio de cultivo (aproximadamente
10 - 15 x 106 células por ml de medio). Finalmente se procedió a colocar en cada
cápsula de Petri estéril de 35 mm de diámetro 2 mL de la suspensión celular.
Mantenimiento de los Cultivos Celulares.
Las células en cultivos se colocaron en incubador, a 37º C, aire al 5% de CO2 y
ambiente saturado de vapor de agua. Al cabo de 24 horas de haber realizado los cultivos
celulares, se procedió a observar las células y sustituir el medio de cultivo con medio
nuevo (previamente llevado a 37º C). Sucesivamente se procedió a sustituirlo cada 48
horas hasta el momento del empleo en los diversos experimentos. En algunas ocasiones
se procedió a determinar la actividad de la ChAT (método de Fonnum (1975)
modificado (Loureiro D.S. et al., 2001), para confirmar la presencia de otros
marcadores colinérgicos presinápticos en las células en cultivo.
Determinación de la Actividad del Transportador de Colina de Alta Afinidad
(HAChT).
La determinación de la actividad del HAChT se llevó a cabo mediante
experimentos de captación de colina tritiada ([3H]-Colina) por un lapso limitado de
tiempo en las células en cultivo. Antes de realizar los experimentos se observaron con
un microscopio invertido las placas de petri, con la finalidad de detectar y excluir de los
experimentos placas que presentaran signos de contaminación, sufrimiento celular o
áreas anormalmente despobladas de células. Se procedió entonces a retirar el medio de
cultivo (acondicionado a 37º C) y a agregar el medio en el que se realizaría la
incorporación, que fue el MEM (Minimal Essential Médium) con Sulfato de Eserina a
la concentración de 50 µM; el volumen final fue en todos los casos de 1 mL. La
concentración de colina en el MEM es de 7,16 µM. Independientemente del tratamiento
dado a las células, en el tiempo “0” se procedió a añadir la [3H]-Colina en la cantidad
de 0,1 µCi por placa, y cronometrar el tiempo pasado por las células en presencia de la
colina radioactiva. Todo el tiempo (exceptuando el momento de agregar las drogas o la
[3H]-Colina), las células permanecieron en el incubador a 37º C. Transcurrido el tiempo
debido se procedió a retirar el medio de incubación y así eliminar la [3H]-Colina no
captada por las células. Para asegurar esta eliminación, se lavó 5 veces cada placa con
xxxvi
CMF + Sulfato de Eserina 50 µM, (a pH 7,4 y osmolaridad 300 mOsm / L) empleando 2
mL para cada lavada por placa. Se observaron nuevamente las células, prestando
particular atención a detectar desprendimientos, vacuolización, retracción u otros signos
de sufrimiento celular.
En una segunda fase se cosecharon las células de las placas mediante un
cosechador de goma. Esto se hizo en un volumen final de 500 µL de agua pentadestilada
para inducir la ruptura celular por shock osmótico y evitando cuidadosamente la pérdida
de células en el proceso. Fueron entonces transferidas a viales Eppendorf, en las que
fueron sometidas a 3 ciclos de congelamiento / descongelamiento (a – 70º C y +37º C)
para completar la lisis (y liberar la radiactividad) en el medio. Se centrifugaron a 12.000
r.p.m. por 15 minutos en una microcentrífuga luego de lo cual se tomaron 100 µL del
sobrenadante, que se colocaron en filtros de fibra de vidrio: esto se hizo por triplicado
para cada vial (placa). El pellet y el resto del sobrenadante se congelaron para
posteriormente determinar el contenido de proteínas del mismo. Los filtros se secaron
en una estufa a 100 º C por un lapso de 90 minutos aproximadamente, y después se
disolvieron en 5 mL de cocktail de centelleo, para finalmente ser contados en un
Contador líquido de centelleo.
La actividad del sistema de captación de colina de baja afinidad se determinó
midiendo la captación de colina en presencia del inhibidor específico del HAChT
Hemicolinio-3 a la concentración de 50 µM (Loureiro D.S. et al, 2001). La actividad del
HAChT se expresa en picomoles de colina por miligramo de proteína por minuto (pmol
/ mg /min).
Determinación de las proteínas en el pellet:
Se determinaron mediante el método de Lowry (Lowry O.H. et al, 1951): para
una adecuada digestión de las proteínas del pellet antes de la determinación, una vez
descartado el resto de sobrenadante de cada vial, se añadieron 200 µL de NaOH 1M a
cada vial, agitando y dejando reposar por una noche. Las muestras se prepararon
añadiendo 10 µL de esta suspensión a 190 µL de agua pentadestilada. Como estándar se
utilizó albúmina sérica bovina (BSA) y las lecturas se hicieron en espectrofotómetro
(Spectronic 20) a 750 nm.
xxxvii
Electroforesis y Western Blot.
Preparación de las muestras: Se prepararon muestras a partir de retinas de
embrión de pollo de diferentes edades para la (E 7-15) así como hipocampo-estriado de
ratas Sprague-Dawley adultas. La muestras se prepararon en Buffer de homogenización
(Buffer de Homogenización: Tris base 20 mM, MgCl2 10 mM, CaCl2 0,6 mM, EGTA
0,5 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, aprotinina 5 µg/mL, leupeptina 2 µg/mL y Triton X-
100 al 0,05 %; pH 7,4) y se procedió a la determinación de proteínas según el método
de Bradford (Bradford M.M., 1976). Luego se diluyeron en Buffer SDS 3X (Buffer
SDS 3X: para 10 mL= Glicerol 3 mL, Dodecil Sulfato de Sodio –SDS- 0,9 g, Tris 0,5 M
–pH 6,8- 3,75 mL, Azul de Bromofenol 0,1% 0,3 mL y agua pentadestilada hasta
completar el volumen final) hasta alcanzar una concentración final de proteínas de 5
µg/mL.
Las muestras fueron sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8 %,
(minigeles de 12 x 8 cm) de 1,5 mm de espesor. Se colocaron las muestras de retinas de
embrión de pollo y cerebro de rata (hipocampo-estriado) en la cantidad de 200 µg
aproximadamente. Paralelamente se colocó el marcador de peso molecular en cada uno
de los geles. La electroforesis se llevó a cabo en un tanque (MiniProtean II, BioRad)
lleno de Buffer de Corrida (14,4 g de Glicina, 3 g Tris base, SDS 1 g para 1 L en agua
pentadestilada) a 110 V y a temperatura ambiente, con una duración promedio de 100
minutos. Culminada la electroforesis, se procedió a colocar cada gel en contacto directo
con una membrana de nitrocelulosa (Amersham) y se procedió a la transferencia a 80 V
por cuatro horas dentro de refrigerador, en un tanque (BioRad) lleno de Buffer de
Transferencia (14,4 g de Glicina, 3 g Tris base, 1 mL de SDS 10 % y 200 mL de
Metanol para 1 L en agua pentadestilada) frío. Las membranas fueron mantenidas en
Buffer de Transferencia por 30 minutos antes de ser usadas.
Culminada la transferencia, se descartaron los geles (en alguna ocasión se
procedió a su tinción con azul de Coomassie brillante para verificar la eficacia de la
transferencia) y se procedió a teñir las membranas con rojo de Ponceau con la finalidad
de observar las bandas correspondientes a las proteínas transferidas, incluyendo los
marcadores de peso molecular. Sucesivamente se lavaron con TTBS (Solución Buffer
Tris Tween 20: 50 mM Tris base, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 y Tween 20 al 0,05 %)
xxxviii
hasta remover el colorante y se procedió al bloqueo de las membranas. El procedimiento
más común fue el de incubar en TTBS + 5 % de leche descremada por 90 minutos en
agitación leve. Se procedió a lavar las membranas con TTBS y sucesivamente se
colocaron en presencia de anticuerpo primario Anti-HAChT Humano y de rata,
policlonal (Chemicon) obtenido en conejo. Esto se hizo diluyendo el anticuerpo
primario 1:333 o 1:500 en TTBS + BSA 1 % y dejando las membranas en incubación
por toda una noche (overnight) en agitación constante y a temperatura ambiente. Tras
lavar las membranas con TTBS por 3 veces, se procedió a incubarlas con Anticuerpo
secundario (Chemicon) anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano
(obtenido en cabra) en una dilución 1:3000 en TTBS + BSA 1% + Leche descremada 1
% por una hora, a temperatura ambiente y en agitación constante. Se lavaron las
membranas con TTBS por 3 veces y se procedió a detectar la unión del anticuerpo
mediante quimioluminiscencia en película Kodak y revelado con HC-110 (Kodak).
Análisis de los datos.
Los resultados obtenidos se expresan en su mayoría como promedio ± ES,
indicando el número de experimentos. En algunos casos se presentan como porcentaje
respecto del control. El análisis estadístico se realizó mediante prueba t de Student o
ANOVA de una vía (utilizando la prueba de Bonferroni como test Post-hoc) mediante
software estadístico (GraphPad Software, San Diego, CA).
xxxix
CAPITULO IV
RESULTADOS
Regulación de la actividad HAChT en retina: Efecto del tratamiento de la
Dopamina.
Con la finalidad de verificar el efecto del tratamiento con Dopamina sobre la
actividad del HAChT en retina, se procedió inicialmente a tratar los cultivos celulares
(E8C6-7) con dopamina 100 µM e IBMX 500 µM (Lankford K. et al., 1988; DeMello
M.C.F. et al., 1982) por un período aproximado de 60 minutos. Los experimentos se
llevaron a cabo en presencia de Pargilina 100 µM (un inhibidor de la Monoamino
oxidasa –MAO-, que impide el rápido metabolismo de la dopamina agregada) y de
ácido ascórbico 100 µM (un agente antioxidante, que impide la oxidación de esta
catecolamina), los controles también fueron tratados con Pargilina y ácido ascórbico
100 µM. El tratamiento con IBMX, una metilxantina que inhibe las fosfodiesterasas,
tiene como finalidad impedir la conversión del cAMP a 5´-AMP. La dopamina usada
se preparó fresca antes de cada experimento. La actividad HAChT promedio medida en
presencia de dopamina e IBMX fue de 15,2 ± 0,85 pmol / mg /min, contra un valor de
23,02 ± 1,45 pmol / mg /min obtenido en las placas de control; significando esto una
reducción (estadísticamente significativa, p < 0,0001) del 34 % de la actividad del
transportador. (Figura 2).
Dado el marcado efecto inhibidor de la dopamina + IBMX sobre la actividad
HAChT, se procedió a realizar experimentos de Curva Dosis – Respuesta, con la
finalidad de determinar la eventual dosis dependencia de dicho efecto. Se montaron
experimentos en forma similar a los descritos para dopamina 100 µM + IBMX 500 µM,
pero esta vez con concentraciones de dopamina de 10, 20, 50 y 100 µM (con IBMX 500
µM en todos los casos). Tales experimentos, aunque confirmando el efecto inhibidor del
xl
tratamiento con dopamina + IBMX, no evidenciaron alguna dosis – dependencia de
dicho efecto: los valores promedio obtenidos en esta serie de experimentos fueron de
25,71 ± 1,56 pmol / mg /min en las placas control y 17,02 ± 1,52 (dopamina 10 µM),
16,06 ± 1 (dopamina 20 µM), 19,1 ± 1,19 (dopamina 50 µM) y 19,78 ± 1,24 pmol / mg
/min (dopamina 100 µM) (Figura 3) existiendo una diferencia estadísticamente
significativa entre los valores de actividad HAChT obtenidos en las placas control y
todas las placas tratadas con dopamina (10, 20, 50 o 100 µM) + IBMX 500 µM, aunque
sin diferencias entre los valores de actividad HAChT obtenidos con diferentes dosis de
dopamina + IBMX 500 µM.
Control Dopamina+IBMX0
5
10
15
20
25
*
HA
Ch
T (
pm
ol/
mg
/min
)
Figura 2. Efecto de la dopamina (100 µM) + IBMX (500 µM) sobre
la actividad HAChT en cultivos celulares de retina de embrión de
pollo (E8C6-7). Cada columna representa la Media ± EE de los
resultados obtenidos en 4 experimentos independientes realizados por
duplicado con 3 cuantificaciones por placa. (*) p < 0,005.
xli
control 10 µµµµM 20 20 20 20 µµµµM 50 µµµµM 100 µµµµM0
10
20
30*
Concentración Dopamina
HA
Ch
T (
pm
ol/
mg
/m
in)
Figura 3. Curva dosis – respuesta de actividad HAChT en presencia
de diferentes concentraciones de dopamina + IBMX 500 µM en
cultivos celulares de retina de embrión de pollo (E8C6-7). Cada
columna representa la Media ± EE de los resultados obtenidos en 3
experimentos independientes realizados por duplicado con 3
cuantificaciones por placa. (*) p < 0,05: al comparar los valores
control con cada uno de los valores obtenidos en los cultivos tratados
se observó una diferencia significativa con cada una de las dosis; sin
embargo no se observó alguna diferencia significativa (p=n.s.) al
comparar, entre ellos, los valores obtenidos en los cultivos tratados.
En vista de la ausencia de dosis – dependencia en el efecto de la dopamina +
IBMX, no obstante se haya descrito para cultivos celulares de retina de embrión de
pollo de esta edad que la acumulación de cAMP en respuesta a la dopamina ocurre en
forma dosis dependiente (DeMello M.C.F. et al., 1982) se procedió a medir el efecto
inhibidor de la dopamina 100 µM + IBMX 500 µM sobre la actividad HAChT, en
presencia de un antagonista de los receptores dopaminérgicos tipo-D1, (+)-SCH23390
en la concentración de 1 µM durante 60 minutos. Este es capaz de inhibir en esta
concentración la acumulación de cAMP inducida por dopamina 200 µM en cultivos
celulares de retina de embrión de pollo (Do Nascimento J. et al., 1997). La actividad
HAChT se redujo significativamente al tratar las placas con dopamina 100 µM + IBMX
500 µM, con valores de 18,6 ± 4, pmol / mg /min respecto a los 23,02 ± 4,2 pmol / mg
xlii
/min de las placas control. Sin embargo este efecto inhibidor no se modificó
significativamente en ningún sentido al añadir al tratamiento con dopamina e IBMX el
antagonista D1 (+)-SCH23390 (17,9 ± 3,77 pmol / mg /min).
Dado que el bloqueo de los receptores D1 no modificó el efecto inhibidor de la
dopamina + IBMX (ni potenciándolo ni revirtiéndolo), se procedió a cuantificar el
eventual efecto de la dopamina endógena sobre la actividad basal de HAChT, a través
de los receptores D1 y D2. Para esto se determinó la actividad HAChT en cultivos
tratados con antagonistas de los receptores dopaminérgicos del tipo-D1 ((+)-SCH23390
1 µM) o de los tipo-D2 (Raclopride 2 µM; Guimarães M.Z.P. et al., 2001). Los
resultados se muestran en la Figura 5.
Ni el empleo de antagonistas D1 o D2 tuvo algún efecto sobre la actividad basal
del HAChT en los cultivos celulares, descartándose la posible influencia de la dopamina
endógena sobre la actividad basal del HAChT.
Contr
ol
DA+IB
MX
DA+IB
MX+SC
H23
390
0
10
20
30*
HA
Ch
T (
pm
ol/
mg
/min
)
Figura 4. Efecto del (+)-SCH23390 (1 µM) sobre el efecto inhibidor del
tratamiento con dopamina 100 µM + IBMX 500 µM en la actividad
HAChT de cultivos celulares de retina de embrión de pollo (E8C6-7).
Cada columna representa la Media ± EE de los resultados obtenidos en 3
xliii
experimentos independientes realizados por duplicado con 3
cuantificaciones es por placa. (*) Se observó una diferencia significativa
entre los valores control y los tratados (p < 0,005), pero ninguna
diferencia significativa entre estos últimos (p = n.s.).
Contr
ol Mµµµµ
Rac
lopr
ide
2 Mµµµµ
SCH23
390
1
0
5
10
15
20
25
HA
Ch
T (
pm
ol / m
g /m
in)
Figura 5. Efecto del tratamiento de los cultivos celulares con (+)-
SCH23390 1 µM o con Raclopride 2 µM sobre la actividad HAChT de
cultivos celulares de retina de embrión de pollo (E8C6-7). Cada columna
representa la Media ± EE de los resultados obtenidos en 3
experimentos independientes realizados por duplicado con 3
cuantificaciones es por placa. No se observó ninguna diferencia
estadísticamente significativa entre estos 3 grupos.
Regulación de HAChT por los niveles de cAMP.
Dada la reproducibilidad del efecto inhibidor del tratamiento con Dopamina 100
µM + IBMX 500 µM, así como la imposibilidad de revertir dicho efecto mediante
antagonistas dopaminérgicos y la falta de efecto sobre la actividad basal de HAChT de
estos antagonistas, se procedió a evaluar el efecto que pudiera tener únicamente la
inhibición de las fosfodiesterasas mediante la cuantificación de la actividad HAChT en
xliv
presencia del solo IBMX 500 µM. Se llevaron a cabo paralelamente experimentos con
el solo vehículo (DMSO), descartándose efectos inespecíficos. El tratamiento con
IBMX 500 µM indujo una reducción estadísticamente significativa (p < 0,0005) en la
actividad HAChT. Esta fue del 32 % aproximadamente: porcentaje de inhibición similar
al observado con el tratamiento dopamina 100 µM + IBMX 500 µM (34 %). Figura 6.
Sucesivamente, se procedió a determinar si la reducción en la actividad HAChT
observado tras la inhibición de la actividad fosfodiesterásica podía ser reproducido a
través de otros medios capaces de incrementar los niveles de cAMP. Se trataron cultivos
celulares con un análogo del cAMP, el Sp Adenosina-cAMP, capaz de atravesar
libremente la membrana plasmática y resistente a la acción de la fosfodiesterasa, a la
concentración final de 100 o 200 µM (Gallo G. et al., 2002) durante 45 – 60 minutos. El
tratamiento de los cultivos con este análogo del cAMP indujo una reducción
significativa (p < 0,005) de la actividad HAChT en un 29 % aproximadamente. Figura
6.
Adicionalmente la estimulación de la adenilatociclasa endógena mediante el
tratamiento de los cultivos celulares con Forskolina 40 µM (Lankford L. et al, 1988) +
IBMX 500 µM (agregados 30 a 60 minutos antes de cuantificar la actividad HAChT)
redujo la actividad HAChT en un promedio del 69 %, duplicando el efecto observado
con IBMX 500 µM. Figura 6.
xlv
Contr
ol IBM
X
IBM
X
Contr
ol cAM
P
cAM
P
Cont
rol F
K +
IBM
X
FK +
IBM
X
0
5
10
15
20
**
**
*
HA
Ch
T (
pm
ol / m
g / m
in)
Figura 6. Efecto del tratamiento de los cultivos celulares de retina de
embrión de pollo (E8C6-7) con Isobutil-metilxantina (IBMX) 500 µM,
Sp-cAMP (100 – 200 µM) y Forskolina (40 µM) + IBMX 500 µM
sobre la actividad HAChT. (**): p < 0,0005. (*): p < 0,005.
Los experimentos anteriores demuestran como el incremento de la concentración
intracelular de cAMP, ya sea inhibiendo su catabolismo (IBMX), añadiéndolo
directamente (Sp-cAMP) o estimulando su síntesis (Forskolina) induce inhibición de la
actividad HAChT.
Regulación del HAChT por Adenosina.
Se conocen 4 subtipos de receptores para adenosina (P1): A1, A2A, A2B y A3, todos
pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a Proteínas G (GPCR`s). Los
subtipos A2A y A2B están acoplados a Gs, por lo que su activación promueve el
incremento de los niveles de cAMP. En la retina de pollo (a partir del día 14 de edad
embrionaria) así como en cultivos celulares de retina de la misma especie (E8C6-7), la
adenosina es capaz de incrementar los niveles de cAMP independientemente del efecto
de la dopamina (Paes R. et al., 1982; Paes R. et al., 1992). En vista de los resultados
antes obtenidos se procedió a cuantificar la actividad del HAChT tras incubar las células
en cultivo con Adenosina 100 µM. Los experimentos se realizaron en presencia o no de
xlvi
un inhibidor de la Adenosina Deaminasa: EHNA 10 µM (erythro-9-Amino-β-hexyl-α-
methyl-9H-purine-9-ethanol hydrochloride) (Martins Ferreira J. y Paes R., 2001).
Figura 7.
Contr
ol
Aden
osina
+EHNA
0
4
8
12
16
20
*
HA
Ch
T (
pm
ol / m
g /m
in)
Figura 7. Efecto del tratamiento de los cultivos celulares de retina de
embrión de pollo (E8C6-7) con Adenosina 100 µM + EHNA 10 µM,
sobre la actividad HAChT. (*) p = 0.016. Cada columna representa la
Media ± EE de los resultados obtenidos en 4 experimentos
independientes realizados por cuadruplicado con 3 cuantificaciones es
por placa.
El tratamiento con Adenosina 100 µM + EHNA 10 µM indujo una reducción
estadísticamente significativa de la actividad del HAChT con valores en las placas de
control de 15,58 ± 1,231 pmol / mg /min y en las tratadas 13,47 ± 1,04 pmol / mg /min
significando esto una reducción del 14 % aproximadamente. El tratamiento con
Adenosina 100 µM no produjo cambios significativos con respecto al control (aunque se
aprecia disminución de la actividad HAChT), así como el EHNA 10 µM solo.
Efecto del Pre Tratamiento de los cultivos celulares con Kainato o Glutamato.
Recientemente se ha demostrado que los Aminoácidos Excitatorios (AAEE) pueden
ser importantes en la regulación de la neurona colinérgica, demostrándose que pueden
xlvii
inhibir la actividad de la ChAT (Loureiro D.S. et al., 2001), así como la unión de [3H]-
Vesamicol al VAChT en cultivos de retina de pollo (Loureiro D.S. et al., 2002). Los
AAEE pueden inducir activación de PKC a través de receptores ionotrópicos o
metabotrópicos, y evidencias recientes señalan que en algunos tipos de células también
incrementan los niveles de cAMP través de receptores metabotrópicos glutamatérgicos
(mGluRs) tipo-I (Hoffpauir B. y Gleason E., 2002).
Bajo estas premisas se procedió a cuantificar la actividad del HAChT tras haber
mantenido los cultivos celulares en presencia de Glutamato (500 µM - 1 mM) o Kainato
(100 – 500 µM) (Loureiro D.S. et al., 2001) por espacio de 15 a 30 minutos. El
Glutamato y el Kainato se retiraron al cabo de este lapso de tiempo, cambiando el medio
de incubación y se procedió a la determinación. Los resultados se aprecian en la Figura
8. Estos fueron obtenidos a partir de 5 experimentos independientes realizados por
duplicado o triplicado.
Control Glutamato Kainato0
25
50
75
100
* *
% d
e A
cti
vid
ad
H
AC
hT
Figura 8. Efecto del Pre Tratamiento de los cultivos celulares de retina
de embrión de pollo (E8C6-8) con Glutamato o Kainato sobre la
actividad del HAChT. (*) p < 0,05. Cada columna representa la Media
± EE de los resultados obtenidos en 5 experimentos independientes
realizados por duplicado o triplicado con 3 cuantificaciones es por
placa.
xlviii
El Pre Tratamiento de los cultivos celulares con Glutamato indujo una reducción de
la actividad del HAChT del 26 % aproximadamente, con valores de 15,12 ± 6,18 pmol /
mg /min en los controles y 11,12 ± 4,66 pmol / mg /min en los cultivos pre tratados. El
Pretratamiento con Kainato redujo la actividad del HAChT en un 24 %
aproximadamente, obteniéndose valores de 36,24 ± 5,15 pmol / mg /min en las tratadas
y 27,63 ± 4,05 pmol / mg /min en sus pares control. Se realizaron así mismo
experimentos de captación de [3H]-Colina hasta 24 horas después de haber mantenido
los cultivos celulares en presencia de Glutamato o Kainato, obteniéndose valores
equivalentes a los obtenidos en los controles, excluyéndose así que las disminuciones de
actividad HAChT pudieran atribuirse a muerte celular.
Efecto del Tratamiento de los cultivos celulares con Esteres de Forbol.
Con la finalidad de comprobar si mediante activadores de PKC era posible lograr
inhibiciones similares a las obtenidas con AAEE´s, así como para verificar si en retina
la regulación del HAChT por PKC tenía características similares a las descritas en
sinaptosomas de hipocampo y estriado de ratón (Gates J. et al., 2004), se sometieron
cultivos celulares a tratamiento con 12-Miristato 13-acetato de Forbol (β-PMA) o 12,
13-dibutirato de Forbol (β-PdBu) por períodos de 60 minutos en la concentración de
200 nM – 1 µM (β-PMA) y 1 – 2 µM (β-PdBu). Los resultados se presentan en la Figura
9.
Control Ester Forbol0
10
20
30
40
*
HA
Ch
T (
pm
ol / m
g /m
in)
xlix
Figura 9. Efecto del tratamiento de cultivos celulares de retina de
embrión de pollo (E8C6-8) con Esteres de Forbol. Cada columna
representa la Media ± EE de los resultados obtenidos en 5 experimentos
independientes realizados por duplicado con 3 cuantificaciones es por
placa. (*) p < 0,005.
El tratamiento de los cultivos con Esteres de Forbol redujo la actividad del HAChT
en modo significativo, obteniéndose en los controles un valor promedio de 34,81 ± 4,83
pmol / mg /min y en los cultivos tratados 24,28 ± 4,5 pmol / mg /min. (30 % de
diferencia). Se realizaron paralelamente experimentos en presencia del solo vehículo
con la finalidad de depurar los resultados del efecto inespecífico del mismo (etanol).
Electroforesis e Inmunodetección del HAChT en retina de pollo.
Dado que hasta la fecha no se ha caracterizado estructuralmente ni molecularmente,
el HAChT en el sistema nervioso central de aves, se llevó cabo una electroforesis en
gel de poliacrilamida seguida de transferencia e inmunodetección en muestras de retina
de pollo usando un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a HAChT de rata.
No obstante se haya empleado el anticuerpo en tejido proveniente de una especie no
– mamífero, fué posible el reconocimiento de una banda que corresponde en peso
molecular (60 kDa) al estimado para el HAChT (Pollo E15), junto a la de muestras
provenientes de hipocampo y estriado de rata (Figura 10).
Figura 10. Inmunodetección del HAChT en hipocampo-estriado de rata
y en retina de embrión de pollo de 15 días de edad.
l
CAPITULO V
DISCUSION Y CONCLUSIONES
En el presente trabajo se intentó evidenciar el posible rol que la dopamina podría
ejercer en la regulación del funcionalismo colinérgico a través de mecanismos de
fosforilación que afectaran la actividad del HAChT. Las premisas para explorar tal
posibilidad fueron principalmente dos: por una parte el conocimiento de las importantes
interacciones entre los sistemas colinérgico y dopaminérgicos en el sistema nervioso
central, (especialmente a nivel de ganglios basales y en la fisiología del control del
movimiento) y por otra la presencia en la estructura del HAChT de sitios potenciales
para su regulación mediante el mecanismo de fosforilación / defosforilación, en el que,
potencialmente, la dopamina podría intervenir; estas fueron ya explicadas
detalladamente (Antecedentes).
El aumento de los niveles de cAMP inducidos por dopamina a través de receptores
D1 aparece temprano durante el desarrollo de la retina de embrión de pollo,
observándose ya al 7º día de desarrollo embrionario (Marques A. y Garcia De Mello F.,
1990). Los cultivos celulares de retina de embrión de pollo (E8C6), acumulan cAMP en
forma dosis – dependiente en respuesta a la estimulación con dopamina tras 10 minutos
de estimulación, obteniéndose un efecto máximo con 100 µM (De Mello M.C.F. et al.,
1982). Por otra parte, mediante marcaje autoradiográfico con [3H]-SCH23390, los
receptores D1 aparecen localizados (en retinas de embriones de 12, 14 y 16 días, y
pollos de 3 días) a nivel de las capas plexiformes externa, interna y Capa Ganglionar
(Marques A. y Garcia De Mello F., 1990); es de hacer notar que las células amácrinas
colinérgicas establecen sus contactos sinápticos preferentemente a nivel de la capa
plexiforme interna, y los cuerpos de una parte de ellas se localizan en la capa ganglionar
(Baughman R. y Bader C., 1977).
li
Los resultados aquí presentados, sin embargo, descartan el posible rol regulador de
la dopamina sobre el HAChT en los cultivos celulares de retina de embrión de pollo:
(a) El efecto inhibidor sobre el HAChT que tiene la estimulación de los
receptores D1 con dopamina 100 µM + IBMX 500 µM, no es diferente al
obtenido al tratar los cultivos celulares con el solo IBMX, indicando que la
dopamina per se carece de algún efecto en este sentido. La probable
inactivación de la dopamina por oxidación o degradación por la enzima
MAO fue descartada al usar ácido ascórbico 100 µM y atmósfera con CO2 al
5 %, lo que origina una leve acidificación del medio y mediante el uso de
Pargilina. Además la dopamina empleada en los experimentos siempre se
preparó pocos minutos antes de iniciarlos excluyéndose la posible oxidación
y degradación de esta durante el almacenamiento en solución.
(b) Tampoco se observó ninguna diferencia al emplear diferentes dosis de
dopamina, siendo esta, como se ha dicho, capaz de incrementar los niveles
de cAMP en forma dosis – dependiente (De Mello M.C.F. et al., 1982).
(c) La ausencia de variaciones en la actividad HAChT con respecto a los
controles al tratar los cultivos celulares con antagonistas dopaminérgicos D1
(SCH23390) o D2 (Raclopride) indican la ausencia de un efecto regulador de
base, o “tónico”, de la dopamina sobre el HAChT a través de de estos
receptores en uno u otro sentido. También se descarta una posible acción de
base ejercida por la dopamina sobre HAChT a través de sus receptores D2 (e
inhibición de la adenilatociclasa) vista la ausencia de cambios de la
actividad del transportador en presencia de Raclopride.
Queda claro que las células amácrinas colinérgicas en la retina no son sensibles ni a
la estimulación con dopamina ni al bloqueo de receptores dopaminérgicos D1 o D2, y
que por lo tanto no son dopaminoceptivas y no pueden ser reguladas por células
dopaminérgicas.
No obstante la retina forme parte del Sistema Nervioso Central (SNC) y los cultivos
celulares de retina de embrión de pollo constituyan un modelo adecuado para el estudio
de las interacciones celulares en el SNC (De Mello F. et al, 1990), estos resultados no
lii
permiten de ninguna manera excluir la posibilidad de que en otras regiones del SNC la
dopamina pueda regular la función colinérgica a través de mecanismos como el
hipotizado. Una posibilidad que cabe explorar es la de emplear otros modelos biológicos
en los que hayan sido documentadas interacciones colinérgico – dopaminérgico, tal
podría ser el caso de realizar experimentos de incorporación de colina en rebanadas de
estriado de mamífero y caracterizar en estos el eventual efecto de la dopamina sobre la
actividad del HAChT.
En este trabajo se obtuvo un claro efecto inhibidor del IBMX 500 µM sobre la
actividad del transportador en los cultivos tratados únicamente con esta metilxantina
inhibidora de las fosfodiesterasas, indicando que variaciones en los niveles
intracelulares de cAMP y la consiguiente activación de PKA intervenían en la
regulación de la actividad del HAChT. En 1997, Vogelsberg V. et al., propusieron la
regulación de HAChT por cAMP y mecanismos de fosforilación; estos resultados no
fueron confirmados ulteriormente y sobre todo el efecto del ácido okadaico,
estimulando el HAChT, reportado por ellos fué posteriormente contradicho por varios
autores (Issa A. et al., 1996; Gates J. et al., 2004).
El potente efecto inhibidor de Forskolina, un activador de la adenilatociclasa, sobre
el HAChT (70 %) y adicionalmente el producido por un análogo del cAMP resistente a
la fosfodiesterasa, confirman la hipótesis según la cual el HAChT puede ser regulado
mediante fosforilación PKA – dependiente.
Estos resultados constituyen la primera demostración de que la actividad del
HAChT es susceptible de ser también regulada por los niveles de cAMP y
fosforilación inducida por PKA, produciendo un efecto similar al inducido por PKC
(Gates J. et al., 2004). Se plantea así la dúplice regulación, de la actividad del HAChT
por mecanismos de fosforilación / defosforilación, por PKC y PKA, caracterizados por
una disminución de la actividad del transportador asociada a la activación de estas
proteína cinasas.
En el caso de fosforilación por PKC, la activación inducida con ésteres de forbol en
sinaptosomas de hipocampo y estriado de ratón, fue suficiente para reducir la expresión
del HAChT en la superficie celular (o de sinaptosomas) en aproximadamente un 30 %, y
liii
para reducir la actividad HAChT en porcentajes variables entre 33 % en hipocampo y
38 % en estriado (Gates J. et al, 2004). Los datos obtenidos en este trabajo en cuanto a
reducción de la actividad HAChT vía PKC son similares (30 %) a los reportados
previamente. Sin embargo al analizar el efecto aquí evidenciado, de la activación de
PKA de mediante IBMX, Sp-cAMP y Forskolina + IBMX, sorprende el dato de que la
activación de adenilatociclasa con Forskolina 40 µM es capaz de producir una
inhibición del 70 % en comparación con la obtenida con solo IBMX 500 µM (32 %), de
forma que el tratamiento con IBMX potencia el efecto de la Forskolina. El efecto
inhibidor descrito en la fosforilación del HAChT mediada por PKC en sinaptosomas de
cerebro de ratón, no tiene la intensidad del efecto PKA –dependiente demostrado aquí.
No se puede atribuir tal diferencia, al hecho de que en los experimentos de Gates J. et
al. hubieran empleado sinaptosomas y nosotros células íntegras ya que en este trabajo,
se estimularon cultivos celulares (idénticos a los usados en los experimentos con
forskolina) con Esteres de Forbol (β-PMA y β-PdBu) obteniéndose inhibiciones de la
actividad HAChT del orden del 30 %, similares a las de Gates J. et al. Por otra parte,
puede descartarse la posibilidad de que el efecto se deba a causas inespecíficas como la
citotoxicidad, visto que la concentración de Forskolina fue la misma usada por Lankford
L., De Mello F. y Klein W., 1988 en cultivos celulares de retina de embrión de pollo de
igual etapa de desarrollo sin que se hayan reportado efectos tóxicos. Además en
cultivos de células PC12 se observan incrementos dosis dependiente de cAMP tras
estimular los cultivos celulares con Forskolina hasta concentraciones de 75 µM (Florio
C. et al., 1999). En todo caso, niveles elevados de cAMP se han asociado a un rol anti-
apoptótico en retinas de rata recién nacida (Varella M. et al., 1999).
Una vez descartado que, en los cultivos celulares aquí empleados, la dopamina actúe
como probable regulador de la actividad HAChT en los terminales colinérgicos a través
del incremento de cAMP y la activación de PKA, cabe explorar otros
neurotransmisores. Entre los diversos sistemas de neurotransmisión localizados a nivel
de retina, y que actúan a través de receptores acoplados a proteína Gs, está la
Adenosina, que a través de sus receptores A2 aparece como un posible (o uno de los
posibles) candidato (s) en la mediación de este efecto. La Adenosina es una sustancia
neuroactiva en el SNC y abundante en retina, es capaz de promover incrementos de
cAMP en cultivos celulares de este tejido, al cabo de 24 horas de haber sido plaqueadas
liv
las células (E8C1), y puede captada y liberada muy tempranamente en dichos cultivos
(Paes R. et al., 2003).
En este trabajo la Adenosina 100 µM + EHNA 10 µM (un inhibidor de la Adenosina
Deaminasa) produjo una inhibición promedio de la actividad del HAChT de un 14 %,
aproximadamente, en los cultivos celulares. Este resultado constituye la primera
evidencia de que la Adenosina es capaz de regular la actividad del HAChT. El EHNA
10 µM no tuvo ningún efecto sobre el transportador al ser empleado solo, descartándose
cualquier efecto inespecífico atribuible a este.
La magnitud del efecto observado con Adenosina es, sin embargo, inferior a las
obtenidas con IBMX, cAMP o Forskolina. A este respecto cabe destacar que la
Adenosina actúa en la retina no solo a través de receptores acoplados a proteínas Gs
(A2), pues a través de los A1, por los que además presenta mayor afinidad que por los
A2 (Nestler E., 2001), reduce los niveles de cAMP (Paes R. et al., 1992). En retina de
mamíferos así como en la de pollo, la Adenosina endógena y los receptores A1 se
localizan nivel de la Capa Ganglionar y la Capa Plexiforme Interna, asociándose por
ende a neuritos y conexiones sinápticas que involucran a células amácrinas, bipolares o
ganglionares. No se puede descartar que la adenosina pueda haber interactuado con
receptores A1 en células amácrinas colinérgicas y que el efecto neto final observado
sobre la actividad del HAChT en este trabajo, podría en realidad atribuirse a la
sumatoria de dos efectos opuestos entre sí, con cierta predominancia del efecto mediado
por los A2: es decir, no se puede aquí excluir que los diversos receptores de adenosina
podrían estar activándose simultáneamente. La posibilidad de discernir entre los efectos
de la Adenosina mediados por receptores A1 o A2 sobre el HAChT, permitiría
profundizar en el rol de esta como regulador fisiológico del terminal colinérgico: otros
autores (Santos F. et al., 1998), por ejemplo, han reportado disminución de la liberación
de [3H]-Acetilcolina estimulada con KCl tras haber tratado cultivos de retina de
embrión de pollo con Adenosina Deaminasa, logrando sin embargo revertir dicho efecto
mediante agonistas A1, a través de mecanismos cAMP independientes. Por estas razones
se recomienda el tratamiento de los cultivos celulares con agonistas / antagonistas de los
receptores A1 y / o A2 durante la cuantificación del efecto de la Adenosina sobre el
HAChT: un incremento del efecto inhibidor de la Adenosina en presencia de
antagonistas A1, por ejemplo, podría dar una medida más precisa de la máxima
lv
capacidad de la Adenosina de regular el HAChT y de esta forma conseguir grados de
inhibición similares a los obtenidos con Forskolina + IBMX..
En vista de estos resultados, también se puede plantear la posibilidad que en los
experimentos con IBMX (una metilxantina como la cafeína) como inhibidor de las
fosfodiesterasas, este podría también haber actuado como antagonista de los receptores
A1, (Nestler E., 2001) produciendo dos efectos a la vez, uno impidiendo el catabolismo
del cAMP y el otro favoreciendo indirectamente la unión de la adenosina a los
receptores A2 (acoplados a Gs y activación de PKA). Se recomienda por ello evitar el
empleo de metilxantinas para lograr inhibir las fosfodiesterasas y usar en este tipo de
experimentos el inhibidor Ro20-1724, específico para la fosfodiesterasa de cAMP.
Resulta interesante el hecho de que los receptores para adenosina A2 y,
específicamente A2A, se expresan especialmente en ganglios basales (estriado dorsal, n.
accumbens), donde hay una gran presencia de neuronas (interneuronas) colinérgicas, en
las que la regulación del HAChT a través de estos receptores podría ser de gran
importancia fisiológica y fisiopatológica. Tal como se sugirió para la dopamina, pudiera
caracterizarse este efecto de la adenosina sobre el HAChT en modelos biológicos
(rebanadas de estriado de rata) que permitan el estudio de la interacción purino-
colinérgica a nivel de ganglios basales.
En los cultivos celulares de embrión de pollo ha sido demostrado que los AAEE´s
pueden inducir cambios notables en marcadores presinápticos colinérgicos diferentes al
HAChT. Loureiro D.S. et al., 2001, aprovechando la alta resistencia de estos cultivos a
los efectos neurotóxicos de los AAEE´s, demostraron como la actividad de la ChAT
podía ser inhibida hasta en un 85 % tras mantener los cultivos celulares hasta por 16
horas en presencia de Kainato (150 µM), Glutamato (1 mM) o AMPA (100 µM),
aunque con este último los autores reportan una inhibición máxima inferior al 60 %.
Este efecto no se observó tras adicionarlos directamente en el homogenizado de las
células, requiriéndose así la integridad celular. Dicho efecto es específico para las
células colinérgicas y no constituye un efecto de los AAEE´s sobre las otras poblaciones
de células amácrinas, pues no afecta otros sistemas de neurotransmisión característicos
de estas células retinianas. Este efecto inhibidor de los AAEE´s sobre la ChAT
demostró además ser reversible y estar mediado tanto por receptores glutamatérgicos
lvi
ionotrópicos como metabotrópicos de tipo-I, a través de mecanismos que involucran a la
NO sintasa y se presentan como calcio dependientes, descartándose la participación de
las vías de señalización celular más comunes, como la fosforilación. También se ha
demostrado (Loureiro D.S. et al., 2002) como los AAEE´s pueden participar en la
regulación del VAChT, y más específicamente que el Kainato (100 µM por 5 horas) es
capaz de reducir la unión de [3H]-(-)Vesamicol (un indicador del funcionalismo del
VAChT) hasta en un 53 % en cultivos celulares agregados (E8C11) de retina de pollo.
Este efecto fue potenciado por el tratamiento previo de los cultivos con ácido okadaico
(10 nM) y prevenido completamente con el tratamiento de los cultivos con un inhibidor
de PKC, el BIM (Bisindolylmaleimide hydrochloride; 200 nM), indicando que dicho
efecto era dependiente de la activación de PKC. Las células amácrinas reciben
inervación glutamatérgica desde las células bipolares y expresan receptores tanto
ionotrópicos como metabotrópicos (Duarte C.B. et al., 1998). El Kainato es capaz de
inducir en cultivos celulares de retina de embrión de pollo (E8C3-12) la producción de IP3
y DAG, mediante mecanismos que requieren del calcio extracelular (Reis R. et al.,
1995) y por ende de activar PKC e inducir fosforilación del VAChT y otras proteínas.
En otro trabajo (Krištofikova Z. y Klaschka J., 1997) evidenciaron una disminución
de la actividad HAChT en sinaptosomas de hipocampo de rata, inducida por AAEE´s,
pero solo empleando concentraciones extremadamente altas (10 mM)de glutamato en el
medio y descartando (los mismos autores) que tal resultado pudiera reflejar eventos
fisiológicos y atribuyéndolo finalmente a un importante efecto neurotóxico.
Los resultados aquí presentados demuestran que en cultivos celulares de retina de
embrión de pollo, tanto Kainato como Glutamato, en concentraciones que ya se han
demostrado no – tóxicas en este modelo, promueven una significativa reducción de la
actividad del HAChT. Como se señaló ya, se realizaron paralelamente experimentos en
los que tras haber sometido a los cultivos celulares al tratamiento con los AAEE´s por
períodos de 15 – 30 minutos, los mismos se mantuvieron hasta por un lapso de 24 horas
en el incubador, luego de haber retirado el glutamato o el kainato, al final se determinó
la actividad HAChT encontrándose valores similares a sus pares control no tratados con
AAEE´s; de esta forma se excluye que la neurotoxicidad y muerte celular sean la causa
de la reducción de la actividad del transportador. El hecho de que la actividad del
HAChT haya sido determinada luego de retirar los AAEE´s del medio y sustituir el
lvii
mismo antes de añadir la [3H]-Colina (Pre-Tratamiento), excluye la posibilidad de que
la despolarización inducida por los AAEE´s (en caso de permanecer en el medio durante
la medición de la actividad HAChT) promoviera la liberación de la [3H]-Acetilcolina
neoformada a partir de la [3H]-Colina, con disminución de la radioactividad intracelular
y obtención de una “falsa” baja actividad del HAChT.
Este resultado, aunque novedoso, de alguna manera no debería representa una
sorpresa visto el efecto de regulación en sentido inhibitorio que diversos trabajos han
venido atribuyendo a los AAEE´s sobre los otros marcadores colinérgicos presinápticos,
y especialmente a nivel de retina. El hecho de que los AAEE´s reduzcan también la
actividad del HAChT cuya actividad es la etapa limitante en la síntesis de acetilcolina
pareciera indicar un patrón de regulación en sentido negativo del sistema glutamatérgico
sobre el funcionalismo colinérgico. Si este patrón es exclusivo de la retina o representa,
por el contrario, un modo de interacción presente en otras regiones del sistema nervioso
representa una interrogante de suma importancia.
Un probable mecanismo a través del cual los AAEE´s podrían producir este efecto
es el de la activación de PKC: ya sea a través de receptores metabotrópicos (mGlurs tipo
I) o ionotrópicos (tipo AMPA /KA). Como se ha visto, la fosforilación de HAChT por
PKC inducida con ésteres de forbol en sinaptosomas de cerebro de rata (o en cultivos
celulares de retina, como se ha demostrado aquí) induce disminución de la actividad del
transportador. Esta disminución de la actividad de HAChT ocurriría, en base a las
evidencias más recientes (Ribeiro F. et al., 2003; Ferguson S. et al., 2003; Gates J. et
al., 2004; Ribeiro F. et al., 2005) por un proceso de endocitosis dependiente de clatrina
(regulado y activado probablemente por la fosforilación del HAChT) que requiere de la
integridad de un dominio di-leucina ubicado en la porción carboxi-terminal del HAChT.
No pueden, sin embargo, excluirse otros posibles mecanismos a través de los cuales los
AAEE´s podrían reducir la actividad del HAChT: hay evidencias de que los receptores
glutamatérgicos metabotrópicos tipo – I al ser activados pueden, además de producir
incrementos de IP3 y calcio intracelular, también estimular la producción de cAMP en
algunos tipos de célula (Hoffpauir B. y Gleason E., 2002) Es necesario, para establecer
con claridad el modo en que este efecto ocurre y la importancia de los diversos tipos de
receptor involucrados, emplear diversos agonistas y antagonistas de los receptores
glutamatérgicos, así como la caracterización del efecto de los AAEE´s sobre el HAChT
lviii
en presencia de inhibidores de PKA (H-89, por ejemplo) y PKC (Staurosporina).
También se hace necesario evaluar este efecto en otras regiones del SNC y verificar si
estos resultados pueden ser extrapolados a estas. En este trabajo se propone un modelo
de regulación del HAChT por parte del cAMP similar al descrito anteriormente para la
regulación vía PKC. Figura 11.
Figura 11. Esquema del probable mecanismo de reducción de la
actividad del HAChT dependiente de cAMP – PKA (C = unidades
catalíticas de PKA; R = unidades regulatorias de PKA. HAChT=color
naranja; AC=adenilatociclasa).
Es necesario también involucrar al PACAP (Polipéptido Activador de la
Adenilatociclasa Pituitaria). Este es un péptido de 38 aminoácidos, aislado por primera
vez en extractos de hipotálamo ovino por su capacidad de estimular la producción
hipofisiaria de cAMP. Pertenece a la Superfamilia de péptidos que conforman el VIP
(Polipéptido Intestinal Vasoactivo), Glucagón, GRH (Hormona liberadora de
Somatotropina) y la Secretina (Vaudry D. et al., 2000) El PACAP es un péptido
neuroactivo, con amplia distribución en el sistema nervioso y también en la retina,
donde se ha localizado (en rata) particularmente a nivel del cuerpo celular de Células
Ganglionares. Los receptores del PACAP están acoplados a proteínas G y desde un
punto de vista farmacológico se dividen en 2 clases: Tipo-I: (PAC-1) específicos para
PACAP, cuya activación se asocia a incremento de la producción de cAMP, activación
lix
de Fosfolipasa C y movilización de calcio; y los Tipo-II: (VPAC1 y VAC2) activados
por PACAP y por VIP, acoplados a la adenilatociclasa, capaces de incrementar la
producción de cAMP. En la retina de pollo se han caracterizado recientemente dos
tipos: PAC1 y VPAC (Carrazzoni J. et al., 2005). Las retinas de embriones de 6 días ya
son capaces de expresar PAC1, (acoplados a la adenilatociclasa): a partir de los 8 días
PACAP a la concentración de 10 nM es capaz de promover incrementos de hasta 10
veces en la producción de cAMP, capacidad que se mantiene hasta los 12 días de edad
para sucesivamente disminuir hasta los 16 días, edad en la que PACAP solo es capaz de
promover un incremento de 2 veces en los niveles de cAMP. Mediante
inmunohistoquímica ha sido recientemente demostrado que en retinas de embrión de
pollo PACAP se localiza en los cuerpos de células amácrinas en la Capa Nuclear
Interna, y en la Capa Plexiforme Interna, donde se evidencia mediante microscopía
confocal co-localización con la inmunoreactividad para la enzima Tirosina Hidroxilasa
(TH), marcador de células dopaminérgicas en la retina, en las que PACAP sería un
factor importante en sostener la expresión de esta enzima (y desarrollar por completo el
fenotipo dopaminérgico).
Sería interesante, vistas la ubicación de la inmunoreactividad para PACAP (a nivel
de Capa Plexiforme Interna y Capa Nuclear Interna), así como las características
funcionales de sus receptores: capaces de incrementar tanto los niveles de cAMP
(activando PKA) como de activar la Fosfolipasa C (y activar vía DAG la PKC), estudiar
el efecto de este neuropéptido sobre la actividad del HAChT y, en general, sobre la
expresión de los diversos marcadores colinérgicos en la retina de pollo.
Vistos en su conjunto, los resultados obtenidos en el presente trabajo constituyen
evidencia de que, al menos en el tejido retiniano, otros neurotransmisores (AAEE´s,
Adenosina) pueden intervenir en la regulación del funcionalismo del terminal
colinérgico a través de cambios en la actividad del HAChT mediados por fosforilación.
Es necesario, sin embargo, continuar explorando la posibilidad de que otros sistemas,
como el de PACAP, estén involucrados en la regulación heteróloga del terminal
colinérgico tanto en retina como en otras regiones del SNC. Una mayor comprensión de
los fenómenos fisiológicos que regulan la actividad colinérgica, probablemente sea la
herramienta más útil para entender y tratar las diversas afecciones del Sistema Nervioso
en los que el sistema colinérgico está involucrado.
lx
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RESUMEN CURRICULAR DEL AUTOR APELLIDOS: Garay Flores NOMBRES: José Lorenzo NACIONALIDAD: Venezolana LUGAR Y FECHA DE NACIMIENTO: Puerto Cabello (Venezuela) 18 de Septiembre de 1965. ESTUDIOS REALIZADOS:
- Secundaria o Institución: Colegio “San Vicente de Paúl”. Barquisimeto. Venezuela. o Año: 1977 – 1982. o Título: Bachiller en Ciencias.
- Universitarios
o Institución: “Universidad de los Estudios de Papua”, Facultad de Medicina y Cirugía. Italia.
o Año: 1983-1989 o Título: Doctor en Medicina y Cirugía o Nota obtenida: Máxima de Calificaciones y Matrícula de Honor
- Otros Estudios
o Maestría en Fisiología (en curso actualmente). UCLA. Venezuela. o Curso de Capacitación Pedagógica. UCLA. Venezuela. Aprobado (225
horas).
- Cargo Actual o Profesor de Fisiología (Agregado) en la Universidad Centroccidental
“Lisandro Alvarado” Desde el 01 – 07- 1994.
- Trabajos recientes (relacionados con la línea de Investigación):
“Posible rol regulador de PKA sobre el Transportador de colina de alta afinidd en cultivos celulares de retina”. (2004) 54º Convención anual de AsoVAC. Venezuela. “Regulación del Transportador de Colina de lata afinidad por Aminoácidos excitatorios en cultivos celulares de retina”. (2004) 54º Convención anual de AsoVAC. Venezuela.