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BiotecnologBiotecnologíía y Alimentacia y Alimentacióónn
II. AlimentaciII. Alimentacióón y Saludn y Salud
CURSO DE BIOTECNOLOGCURSO DE BIOTECNOLOGÍÍA EN LA EMPRESAA EN LA EMPRESAV EDICIV EDICIÓÓNN
David TomDavid Tomáás s FornFornéé[email protected]@ainia.es
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Biotecnología en la Industria Alimentaria.
Desarrollo de alimentos funcionales
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Contenido
• Definición de alimento funcional
• Características de un alimento funcional
• Tipos de alimentos funcionales
• Desarrollo de alimentos funcionales basados en probióticos
Definición
Características
Evaluación y caracterización funcional y tecnológica
Aspectos tecnológicos
• Conclusiones
• Anexo (ingredientes funcionales y aplicaciones)
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¿Qué son los alimentos funcionales?
El termino alimento funcional aparece por primera vez en Japón, en los años 80.
Alto coste de la atención sanitaria debido a:
Envejecimiento poblacional
Dieta carentes nutrientes
SOLUCIÓN frente al
Hoy en día, se conoce la relación entre:
Dieta Estado de salud
saludable Estado salud óptimo
Desarrollo nuevos productos funcionales
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Son productos con probados efectos beneficios fisiológicos y/o reducción en el riesgo de enfermedades crónicas
¿Qué términos podemos utilizar?
8 Alimento funcional8 Nutracéuticos8 Farmaalimentación8 Alimento diseñado8 Vitafood8 Fitoquímicos
8 Alimentos medicinales8 Suplementos dietéticos8 Productos herbales8 Sustancias botánicas8 Nutracosméticos
Goldberg, I. (1994). Functional foods, designer foods, pharmafoods, nutraceuticals. Champman and Hall, New York
Mazza, G. (1998). Functional foods. Biochemical and processing aspects. Technomic Publishing Company, Inc, Lancaster, Pennsylvania
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En Europa, aunque no existe un acuerdo general sobre que son los alimentos funcionales, se acepta la definición propuesta por el profesor M. Robertfroid (Am. J. Clin. Nutr. 2000; 71:1660s-1664s)
“ Un alimento funcional es aquel que contiene un componente alimenticio (sea un nutriente o no) con efecto selectivo sobre una o varias funciones del organismo, cuyos efectos positivos justifican que pueda reivindicarse que es funcional o incluso saludable”
Alimentos funcionales
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Características alimentos funcionales
Efecto beneficiososobre la salud
Base científica.Estudios epidemiológicos.
Necesario conocer interaccionesentre el ingrediente y la matriz del alimento.
Administrado demanera convencional.
No deben reducir valor nutritivo del alimento que los contiene
Dosis establecida por expertos
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Beneficios de los alimentos funcionales
Fomento de la salud intestinal
Reducción del nivel de colesterol
Descenso en la presión arterial
Mejora de la respuesta inmunológica
Protección frente a problemas cardiovasculares y algunos cánceres
Hasler, C.M. (1998). Functional foods: Their role in disease prevention and healthpromotion. Scientific Status Summary. Food Technology, 52(11), 63-70
Ventajas que aporta al consumidor
Consumiendo un PRODUCTO con las mismas características que el
TRADICIONAL
GARANTIAS DE SALUD: PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES
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Problemas de los alimentos funcionales
Médicos: no los consideran una medicina y normalmente prescriben un fármaco en lugar de recomendar su ingesta
Consumidores: necesitan más información
- ¿Qué son exactamente?
- ¿Son adecuados para todo el mundo?
- ¿Son verdaderamente efectivos?
- ¿Pueden utilizarse como un tratamiento médico?
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Suplementación, añadiendo alguna sustancia que el propio alimento ya contiene hasta niveles adecuados que tengan efecto beneficioso como alimento funcional
Clasificación de alimentos funcionales
Enriquecimiento, mediante introducción de un ingrediente funcional normalmente no presente en el alimento
Substitución de alguna sustancia por otra similar, pero más saludable.
Eliminación, mediante la separación de algún componente no saludable de un alimento
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Ingredientes funcionales y aplicaciones (1/4)
Ingredientes funcionales
Flavonoides:anthocianidinas, catequinas, flavononas, flavonas
Pre/Probióticos: fructo-oligosaáridos (FOS), lactobacilus
Proteínas de soja (fitoestrógenos): isoflavonas
Aplicaciones
Bebidas, zumos, suplementos alimenticios, cosméticos,
Yoghurt, golosinas, mantequilla
Confitería, bebidas, suplemento dietético, leche, salsas
Beneficio potencial
- Neutraliza radicales libres
- Reduce riesgo de cáncer y enfermedades y cardiovasculares
- Mejora de la calidad de la microflora intestinal
- Mejora los síntomas de la menopausia - Descenso en el riesgo de osteoporosis
Esteroles vegetales: estanol ester
- Menos colesterol en sangre
Confitería, margarina, chocolate, leche
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Ingredientes funcionales
Carotenoides: alfa-caroteno, beta-caroteno, luteina, licopeno
Fibra dietética: fibra insoluble, beta-glucano, fibra soluble
Ácidos grasos: omega-3 -DHA/EPA, ácido linoleico conjugado (CLA)
Aplicaciones
Cosméticos, industrias alimentarias, aceite vegetal (expuesto a luz)
Zumo, bebidas, cereales de desayuno, confitería
Beneficio potencial
- Neutraliza radicales libres - Reduce riesgo de cáncer de próstata
- Menor riesgo de cáncer de colon - Reduce el riesgo de enfermedad cardiovascular
-Descenso en los niveles de triglicéridos y colesterol en sangre
- Mejora de las funciones visual y mental - Descenso en el riesgo de algunos cánceres
huevos, pastas, dulces, pasteles, panadería, bollería, leche infantil
Zumos, bebidas
Ingredientes funcionales y aplicaciones (2/4)
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Minerales: calcio, hierro y zinc
Vitaminas liposoluble: vitamina A, D, E and K
-Mejora de la función visual
-Mejora de la absorción del calcio
-Neutralización de radicales libres, actividad antioxidante necesarias para la coagulación normal de la sangre
Leche, zumo, galletas, mantequilla, dulces, biscuits, aceite vegetal (A,E)
Vitaminas hidrosoluble : vitamina C, complejo B
-Protección del sistema vascular
-Mejora de las funciones nerviosas
zumos, bebidas, biscuits
Leche, yogur, comidas preparadas, dulces, galletas, biscuits
- Descenso en el riesgo de osteoporosis - Tratamiento de anemia, - Mejora del sistema inmunológico, digestión
Ingredientes funcionales AplicacionesBeneficio potencial
Ingredientes funcionales y aplicaciones (3/4)
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Taninos: proantocianidinasPan, confitería, chocolate, vino
- Mejora en el tracto urinario - Reducción del riesgo de enfermedades cardiovasculares
Proteínas y aminoácidos:triptófano, glutamina, arginina, cisteína,...
- Mejora del sistema nervioso - Mejora del sistema inmunológico
Cosméticos, leche infantil, complementos dietéticos, alimentos para deportistas
Alcoholes azucarados (polioles): sorbitol, manitol, xilitol, lactitol, maltitol
-Utilizados en dietas bajas en carbohidratos para diabéticos
- No favorece la caída de dientes
Cosméticos, complementos dietéticos
Excitantes y tranquilizantes: - cafeína, ginseng,…- valeriana, melisa,...
- Estimulación del sistema nervioso y mejora de las funciones psicológicas - Favorece la relajación del sistema nervioso e inducción al sueño
Bebidas energéticas, suplementos herbales
Ingredientes funcionales AplicacionesBeneficio potencial
Ingredientes funcionales y aplicaciones (4/4)
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Desarrollo de nuevos alimentos (2007)
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Ventas de alimentos funcionales
Europa17%
Estados Unidos42%
Japón40%
Australia1%
Facturación Total Mercado de alimentos funcionales: 33.000 mlls US$
AÑO 2000. FUENTE: Leatherhead Food R.A.
Mercado Japonés
Probióticos82,1%
Anticaries 0,2%Anticolesterol 0,2%
Antidiabéticos 0,2%Minerales 2,0%
Grasas saludables 3,1%
Fibras 5,1%
Antihipertensión 3,2%
Oligosacáridos 4,0%
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Desarrollo de alimentos funcionales mediante empleo de microorganismos probióticos
¿Qué es un probiótico?
• “Un suplemento dietético a base de microbios vivos que afecta beneficiosamente al animal huésped mejorando su equilibrio intestinal” (Fuller 1989)
• “Un monocultivo o cultivo mixto viable de bacterias que cuando se aplican a animales o seres humanos afecta beneficiosamente al huésped mejorando las propiedades de la flora autóctona” (Havenaar y Huis in’t Veld 1992)
• Microorganismos vivos que, cuando se consumen en cantidades apropiadas, confieren al huésped efectos saludables” (Guarner y Schaafsma, 1998)
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Desarrollo de alimentos funcionales mediante empleo de microorganismos probióticos
Qué es un probiótico
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Características de los probióticos
• Se trata siempre de microorganismos vivos que deben ser capaces de sobrevivir el paso por el aparato digestivo y proliferar en el intestino.
Muestran resistencia a jugos gástricos y crecer en presencia de bilis
Disponen de un “vehículo” que les protege durante el paso por el estomago y de la bilis
• Deben encontrarse en una dosis adecuada para obtener los efectos deseados.
• Generalmente (aunque no exclusivamente) son bacterias Gram + que pertenecen a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium. Los fermentos lácteos habitualmente empleados (L. delbrueckii ssp. bulgaricus y S. thermophilus) pueden tener efectos similares pero no suelen proliferar en el intestino.
• Su mecanismo de acción puede ser mediante:
Producción sustancias antimicrobianas
Exclusión de la fijación de patógenos
Competencia por nutrientes
Modulación del sistema inmunitario
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Efectos beneficiosos
Trastornos aparato digestivo
• Prevención de diarreas causadas por bacterias patógenas y/o virus
• Infección por Helicobacter pylori
• Enfermedades inflamatorias.
• Cáncer
• Estreñimiento.
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Efectos beneficiosos
Inmunidad mucosa
Alergias
Enfermedades cardiovasculares
Otros (no alimentarios) como trastornos del aparato urogenital (vaginosis, vaginitis o infecciones)
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Desarrollo de alimentos funcionales mediante empleo de microorganismos probióticos
Guias para su evaluación
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Evaluación de probióticos de uso alimentario
•Identificación de la cepa por métodos fenotípicos y genotípicosGénero, especie, cepa
Depósito en una Colección de Cultivos (CECT)
•Caracterización funcionalEstudios “in vitro”
Estudios en animales
•Evaluación de la inocuidadEstudios “in vitro”
FASE 1-Estudio en humanos
•Ensayos clínicos con placeboFASE 2- Estudio en humanos
Tamaño de muestra y resultado primario
Segundo estudio independiente para confirmar resultados
•FASE 3-Estudio en humanosComparar probióticos con tratamiento
estándar para una condición específica
•MICROORGANISMO PROBIÓTICODenominación (género, especie, cepa)
Nº bacterias viables durante su vida útilCondiciones de almacenamiento
Aptitud tecnológica
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Caracterización funcional de un microorganismo
Ensayos “in vitro” para caracterizar propiedades funcionales
• Resistencia a la acidez gástrica
• Resistencia a ácidos biliares
• Adherencia a mucosas y/o células hepiteliales humanas y líneas celulares
• Capacidad de reducir adhesión de agentes patógenos
• Actividad hidrolasa de sales biliares
• Capacidad antimicrobiana frente a patógenos
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Caracterización funcional de un microorganismo
Ensayos “in vitro” para caracterizar su inocuidad
• Perfiles de resistencia antimicrobiana
• Inocuidad en seres humanos
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Desarrollo de alimentos funcionales. Aspectos tecnológicos
Concepto de alimento funcional e identificación nutracéutico (p.ej. producto cárnico bajo en grasa)
Desarrollo de nuevas formulaciones (p.ej. prototipos con diferentes sustitutos de grasa) evaluando los siguientes aspectos tecnológicos:
de formulación: presentación y dosis del nutracéutico, forma de incorporación, homogeneidad en el producto, reformulación otros ingredientes,…
de procesado: forma de incorporación, solubilidad, influencia sobre parámetros termodinámicos (transferencia de calor), tasa de degradación del nutracéutico, variables del proceso (temperatura vs tiempo), …
organolépticos: el sabor, la sensación en boca, la palatabilidad, la textura, …
Estudio de la función fisiológica (p.ej. grasa: aporte calórico, ácidos grasos esenciales, vit. liposolubles A, D, E y K, sensación de saciedad y atributos sensoriales…)
Evaluación ventajas salud (p.ej. relación consumo grasas con patologías: obesidad, hipercolesterolemia, ECV, cáncer, …)
Estrategias tecnológicas a implementar (p.ej. sustitución grasas)
reducción del nivel de grasa de materias primas
adición de sustitutos o imitadores de la materia grasa (glucídica, proteica o lipídica)
adecuación de las tecnologías de elaboración y/o preparación del producto
Estudio de vida útil (microbiológica y organoléptica) y estudio de aceptación consumidores
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EVALUACIÓN DE LA
ACEPTACIÓN SENSORIAL
DESARROLLO DE PROTOTIPOS
Selección de la matrizIdentificación de
ingredientes funcionales
Caracterizaciónquímica
Caracterización tecnológica
ESTUDIOS PRELIMINARES: IDENTIFICACIÓN DE LAS CARATERISTICAS BENEFICIOSAS
Estudio cualitativo
Recomendaciones nutricionales
Caracterización sensorial
SELECCIÓN DEL PROTOTIPO
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Los métodos in vitro presentan inconvenientes que se pretenden solucionar
mediante el desarrollo de reactores o digestores in vitro
No existen técnicas o modelos perfectos para estudiar el grado de
biodisponibilidad de los nutrientes en el hombre, y es necesario
la acción conjunta de diversos sistemas in vitro e in vivo
para obtener una información completa de
la biodisponiblidad de
nutrientes
Evaluación de la biodisponibilidad de compuestos bioactivos cardiosaludables
Ventajas del Digestor Dinámico in vitro:
- son métodos más rápidos, de menor coste y de fácil manipulación- con posibilidad de toma de muestra en cualquier parte del tracto gastrointestinal
- con mejor reproducibilidad que los estudios in vivo- no supone limitaciones éticas
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El digestor dinámico in vitro diseñado y desarrollado por ainia reproduce las condiciones naturales del tracto gastrointestinal humano (estómago e intestino delgado) y sus características principales
- El digestor reproduce el proceso de digestión gastrointestinal.
- En el estómago se lleva a cabo la digestión gástrica de los alimentos, consistente en la transformación del bolo alimenticio en una masa fluida llamada quimo (digerido gástrico).
- Posteriormente continúa la digestión intestinal, donde se siguen descomponiendo los nutrientes y/o compuestos bioactivos, dando lugar al quilo (digerido intestinal).
- Tras alcanzar un adecuado tamaño, dichos compuestos se absorben a través del equipo de diálisis
Evaluación de la biodisponibilidad de compuestos bioactivos cardiosaludables
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Todos los estudios aportan información sobre el producto, pero:
Para poder afirmar o declarar un posible efecto del producto sobre el organismo humano relacionado con la salud
Estudios clínicos en humanos
La eficacia o efectividad de un alimento/ingrediente cardiosaludable se puede determinar:
- Experimentos in vitro con cultivos celulares
- Estudios con animales de experimentación
- Estudios clínicos con personas
Evaluación de la funcionalidad de compuestos bioactivos cardiosaludables
Evaluación de la funcionalidad
Exigencias de la EFSA
•Caracterización funcional
•Mecanismo de acción
•Establecer el efecto dosis-respuesta
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-Se basan en el uso de modelos experimentales que reproducen a escala de laboratorio la funcionalidad objeto de estudio. El efecto biológico se determina analizando los biomarcadores adecuados.
-Se utilizan como
•Sistema de diagnóstico para identificar y seleccionar nuevos compuestos bioactivos (“high-throughput screening”).
•Sistema de diagnóstico para evaluar y/o validar la funcionalidad.
•Sistema para determinar el mecanismo de acción.
-Se dispone de modelos basados en microorganimos y basados en cultivos celulares.
Estudios “in vitro” del efecto biológicoEstudios “in vitro” del efecto biológico
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MODULACIÓN DEL SISTEMA INMUNITARIO (Líneas celulares sanguíneas: monocitos humanos THP1, células T de ratón CTLL2 y D10.G4.1, macrófagos de ratón Raw 264.7).
REGULACIÓN DE LA OBESIDAD (Línea celular de ratón 3T3-L1).
NEUROPROTECCIÓN (Línea celular humana de neuroblastoma SH-SY5Y).
MODULACION DEL METABOLISMO DEL COLESTEROL (Línea celular humana de hepatomaHepG2, microorganismos probióticos).
BIOACCESIBILIDAD (Línea celular humana Caco-2, digestor in vitro).
REDUCCIÓN RIESGOS MICROBIOLÓGICOS (actividad antimicrobiana frente Listeria, Salmonella, E.coli OH157…).
BIOENSAYOS CELULARES
EVALUACION DE BIOMARCADORES
BIOMARCADORES de: estrés/inflamación (p.e: el metabolito de NFkb), muerte celular (relación de los genes BAX, BCL2), regulación tejido adiposo (gen de la Leptina, formación de cuerpos grasos), proliferación celular, absorción de colesterol (diferencia colesterol presencial y absorbido)….
TÉCNICAS: moleculares: (expresión génica, PCR a tiempo real) espectrofluorimetria, citometría de flujo, microbiología clásica
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Sistema integrado Digestor Dinámico in vitro/cultivos celulares
Digestor Dinámico in vitro
Monocapa celular Caco-2
Estudio absorción/transporte intestinal
Estudio funcionalidad órgano diana
Bioensayo celular en cultivos celulares
Determinación en la monocapa celular y en la parte basal de compuestos bioactivos biodisponibles
Determinación la capacidad cardiosaludablemediante análisis de biomarcadores específicos
Evaluación de la funcionalidad de compuestos bioactivos cardiosaludables
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Patrón habitual para demostrar una relación causa-efecto relevante para el ser humano:
Ensayos de intervención nutricional randomizados y controlados
Se tendrán en cuenta las características que debe reunir un ensayo clínico “idóneo”:
- Randomizado: consiste en asignar de manera aleatoria a los pacientes a cada grupo de tratamiento, para que los diferentes grupos sean comparables u homogéneos
- Controlado con placebo: consiste en administrar placebo en lugar de tratamiento
- Doble ciego: ni el individuo participante ni el técnico responsable del ensayo clínico conocen en qué grupo está el participante
Evaluación de la funcionalidad de compuestos bioactivos cardiosaludables
Estudios de intervención nutricional
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•Existen datos científicos suficientes que indican que el consumo de alimentos funcionales(probíóticos) pueden derivar en beneficios para la salud, tanto para personas inmunodeprimidas como para personas sanas.
•Es necesario considerar los alimentos funcionales como un complemento a una dieta equilibrada y a un estilo de vida saludable.
•La biotecnología moderna permite el desarrollo de alimentos funcionales mediante el uso de microorganismos beneficiosos, así como aporta las bases de los métodos moleculares y celulares que permiten una adecuada evaluación de los mismos.
•Es necesario aplicar Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) en el desarrollo y producción de alimentos funcionales.
•Deben desarrollarse y normalizarse nuevos métodos (in vitro e in vivo) para evaluar la funcionalidad e inocuidad de los alimentos funcionales, así como un marco reglamentarioque regule el uso de los mismos.
Conclusiones
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EVALUACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
373/X
Las propiedades bioactivas de interés se analizan
mediante la realización de ensayos específicos en
función del efecto biológico de interés
Niveles de experimentación
• in vitro
• in vivo
• Ensayos clínicos
EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS
MODULO TEÓRICO. Introducción
38
EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS
La evaluación in vitro e in vivo de compuestos bioactivos se basan
en modelos experimentales
Un modelo experimental debe cumplir al menos tres requisitos
esenciales:
deber reproducir el proceso biológico de interés
el sistema debe ser sensible a factores externos
las fluctuaciones del sistema deben ser medibles
MODULO TEÓRICO. Introducción
393/X
EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS
Un herramienta esencial para el diagnóstico de
bioactividad es la selección del biomarcador adecuado
Un biomarcador es un indicador del estado el modelo
experimental utilizado, es un parámetro medible y que
responde a los cambios producidos en el sistema.
Los biomarcadores pueden ser:
-proteínas
-metabolitos
-genes
-estado fisiológico
MODULO TEÓRICO. Introducción
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EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS
Según la naturaleza del biomarcador se utilizan distintas tecnologías:
TRANSCRIPTOMICA
METABOLOMICAPROTEOMICAGENÓMICA
ADN
ARN
Expresión génica
PROTEÍNAS METABOLITOS
WESTERN-BLOT CROMATOGRAFIA
-Técnicas inmunológicas: técnicas Elisa-Métodos enzimáticos (método indirecto)-Técnicas Fluoro-colorimétricas
MODULO TEÓRICO. Introducción
qPCR
-Técnicas de imagen-citometría de flujo
RMN
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INTRODUCCIÓN A LA TÉCNICA DE CULTVO CELULAR
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MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales
3/12
Origen del cultivo celular
¿Qué es el cultivo celular?
• Un cultivo celular es la propagación de células fuera del organismo de origen en condiciones controladas, por ello se denomina cultivo in vitro.
•También se entiende como cultivo celular “al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas”.
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43
MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales
•El origen del cultivo celular
•Animal: de distintos tejidos de vertebrados o invertebrados
•vegetal
Aspectos generales de los cultivos celulares
in vivo in vitro
órgano
Cultivo celular
hepatocitos
animales Planta del tabaco
Células planta tabaco
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MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales
Ventajas
Colecciones internacionales destacadas
Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de cultivos
ATCC American Type Culture Collectionhttp://www.lgcstandards-atcc.org/
Human and Animal Cell Cultureshttp://www.dsmz.de/
European Collection of CellCultureshttp://www.hpacultures.org.uk/collections/ecacc.jsp
Istituto Giannina Gaslinihttp://dppm.gaslini.org/biobank/
Minassas, USA
DSMZ Braunschweig, Alemania
≈500
ECACC Salisbury, Wiltshire, UK
≈1000
GEIMM
≈800
Genova, Italia ≈2300
Fuente: www.biotech.ist.unige.it/cldb/indexes.html
•Establecimiento de líneas internacionales de fácil acceso
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MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales
A pesar de las ventajas se ha de considerar que ….
•Validez del modelo “in vitro”, no son animales enteros
Las conclusiones de los ensayos deben ser debidamente acotadas. Cada vez se están realizando más estudios de validación de modelos “in vitro” como por ejemplo: ECVAM (European Center ofValidation of Alternative Methods), INVITOX (colección de protocolos “in vitro”)http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/
Skin irritation (March 2010)
In vitro test methods based on Reconstructed Human Epidermis (theEpiSkinTM, the modified EpiDermTM and the SkinEthic TM RhE) included in the new OECD Test Guidelines (No. to be defined and published) were pre-validated and validated by ECVAM and endorsed by its Scientific AdvisoryCommittee (ESAC).
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MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares
1. 3 Aplicaciones
Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas:
•Investigación del cáncer
•Inmunología: producción de anticuerpos monoclonales
•Ingeniería de proteínas: producción de proteínas en
líneas celulares como por ejemplo, insulina, hormona de
crecimiento,…
•Estudios de interacción y señalización celular, en la
diferenciación y en el desarrollo. Estudio de los
receptores y de las vías de traslocación de la señal.
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MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares
1. 3 Aplicaciones
•Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de
tejidos para el trasplante
•Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por
reproducción in vitro de clones de plantas de interés
comercial.
•Virología: producción de vacunas, establecimiento de
condiciones de cultivo animales
•Aplicaciones diagnósticas: por ejemplo en medicina y
farmacología destacan el análisis cromosómico de células
crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección
de infecciones virales, ….
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CONTENIDOS DE UN BIOENSAYO: CASOS PRÁCTICOS
49
CASO PRACTICO:
EVALUACIÓN DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTI-INFLAMATORIA
Respuesta del sistema inmunitario
InflamaciónInfección
Daño celular
•La inflamación es una respuesta inespecífica frente a agresiones del
medio
•Muchas enfermedades llevan asociado un proceso inflamatorio: artitis,
enfermedad de Crohn…
•En un proceso complejo que desencadena cambios a nivel celular y
molecular
MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares
50
Modelo experimental in vitro basado en líneas celulares
Sistema celular: células de macrófago de ratón
Evaluación de la capacidad anti-inflamatoria mediante
biomarcadores génicos Estimuloinflamatorio
transducción de la señal
Activación genesPro-inflamatoriosNFkB, iNOS, TNFa, COX2,
CASO PRACTICO :
EVALUACIÓN DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTI-INFLAMATORIA
MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares
51
> Evaluación de la capacidad de modular el sistema inmunitario
Bioensayo celular (líneas celulares Raw 264.7, D.10G4, CTLL2) analizandobiomarcadores génicos específicos, proliferación celular..
Bioensayo celular de cribado analizando un biomarcador general mediante un sistema de alto rendimiento
1385,4 404,1 117,9 34,4 10,0 2,9
C
010000200003000040000500006000070000
PROLIFERACION CTLL2
Sistema inmune : células sanguíneas
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Aplicaciones del cultivo celular: Determinación de la capacidad antiinflamatoria
Línea celular Raw 264.7 macrófago de ratón
FASE 1. Preparación de las células
•Descongelación de las células
•reactivación , producción de cantidad
•Preparación de medio de cultivo y reactivos
MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares
53
Línea celular Raw 264.7 macrófago de ratón
FASE 2.Ensayo de bioactividad
•Inducir inflamación mediante el tratamiento con LPS
•Tratar las células con los extactos objeto de estudio:
cultivos microbianos y/o extractos de macroorganismos
Importante controles: blanco, negativo y/o positivo
•Fin del bioensayo: toma de muestra a analizaR
•recoger medio de cultivo celular
•Recoger células
Adicionar compuestos Incubación 37ºC, 5% CO2
MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares
Aplicaciones del cultivo celular: Determinación de la capacidad antiinflamatoria
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Aplicaciones del cultivo celular: Determinación de la actividad antiinflamatoria
FASE 3 . Resultados: Análisis de biomarcadores
• Medida de metabolitos en el medio de cultivo:
•producción de óxido nitrico (Greiss)
•A partir de las células recogidas: análisis de la expresión génica
•Extracción de ARN
•Transcripción reversa a ADN
•PCR in real time (primers del gen diana, controles internos)
82
MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares
55
FUNDAMENTO DE UN SISTEMA DE CRIBADOFUNDAMENTO DE UN SISTEMA DE CRIBADO
MODULO I. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR COMO SISTEMA DE ANALISIS MASIVO
Generalmente los sistema de cribado al actuar como primer filtro en la búsqueda de compuesto hacen uso de biomarcadores generales asociados al proceso biológico (Moléculas clave).
Posteriormente, en la validación y caracterización del efecto biológico se hace uso de biomarcadores específicos.
7
56
Sistema de Cribado de
compuestos con potencial efecto neuroprotector
EVALUACION EFECTO NEUROPROTECTOR
Neuroglia alterada
Neuroglia Estado normal
Mediadores InflamatoriosNeurotóxicosLisis celularExceso de especies reactivasDaño celularApoptosis…
NeurodegeneraciNeurodegeneracióónnParkinsonAlzheimer…
Estrés oxidativoplaca b-amiloide….
8
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cribado basado en la actividad anti-inflamatoria
EVALUACION EFECTO NEUROPROTECTOR
Biomarcador molécula central en el proceso inflamatorio NF-kb
Sistema artificial: Línea celular modificada, THP1-XBlue-CD14
(NF-kb -SEAP)
Sistema de Cribado de
compuestos con potencial efecto neuroprotector
Efecto extrapolable
Lectura del biomarcador: reacción colorimétrica
Rápido
Manipulación sencilla
Alto procesado de muestra
9
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Sistema de Cribado de
compuestos con potencial efecto neuroprotector
EVALUACION EFECTO NEUROPROTECTOR
Biomarcador molécula central en la inflamación NFkb
Neuroglia Activa
NFkb activo
Estímulo inflamatorio NeurodegeneraciNeurodegeneracióónn
Compuestos
NeuroprotecciNeuroproteccióónn
NFkb inactivoInhibe
mediadores inflamatorios
NFkb activo
10
59
> Evaluación de la capacidad neuroprotectora
2. Bioensayo celular de validación con neuronas (línea celular SH-SY5Y) biomarcadores génicos específicos mediante técnicas moleculares (RT-PCR a tiempo real) o analizando la muerte celular mediante citometría de flujo.
1.Bioensayo de cribado analizando la actividad antiinflamatoria
Cultivo de neurona SH-SY5Y0
200
400
600800
1000
1 2 3 4 5 6
Tipo de muestra
Cantidad normalizada expresada del gen iNOS/Β -actina respecto a las células sin tratar
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Metabolismo del tejido adiposo
-órgano en el que se almacena las grasas
-órgano endocrino: metabólicamente activo
Sistema de cribado para compuestos
que regulen el metabolismo del tejido adiposo
EVALUACION EFECTO REGULACION TEJIDO ADIPOSO
Type 2 Diabetes and obesity: A review 11
61
cribado basado en la capacidad inhibir la acumulacion de
lípidos durante la adipogénesis
12
EVALUACION EFECTO SOBRE TEJIDO ADIPOSO
Biomarcador: formación de cuerpos grasos
Sistema no artificial: Línea celular 3T3-L1 fibroblastos de ratón
Capacidad de diferenciarse a adipocito
Sistema de cribado para compuestos
que regulen el metabolismo del tejido adiposo
Efecto extrapolable
Lectura del biomarcador: reacción colorimétrica
Alto procesado de muestra
62
Sistema de cribado para compuestos
que regulen el metabolismo del tejido adiposo
13
Biomarcador molécula central en la inflamación NFkb
Maduración del adipocitoCon los compuestos
No Efecto moduladorNo Efecto modulador
Efecto moduladorEfecto modulador
Adipocito maduroCúmulos de grasa
Adipocitoinhibición de
los cuerpos grasos
EVALUACION EFECTO SOBRE TEJIDO ADIPOSO
Pre-adipocito
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> Evaluación del efecto anti-obesidad
Bioensayos celulares con la línea celular de tejido adiposo 3T3-L1
Cribado evaluando la capacidad de inhibir cúmulos grasa
Preadipocito Adipocito maduro
64
> Evaluación del efecto anti-obesidad
Bioensayos celulares con la línea celular de tejido adiposo 3T3-L1
Bioensayo de validación de analizando biomarcadores génicos
Adipocito maduro línea 3T3-L1
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UN MECANISMO DE ACCION BACTERIANO PARA REDUCIR EL COLESTEROL:
DESCONJUGACION DE LAS SALES BILIARES
> Reducción del colesterol mediante microorganismos
“SCREENING” DE BACTERIAS
L. acidophilusMRS
L. acidophilusMRS+ TDCA+ CaCl2
L. acidophilusMRS+ GDCA
A B C
EVALUACION DE LA CAPACIDAD ASIMILADORA DE COLESTEROL
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Estudios “in vitro”.
Estudios “in vivo”.
Ensayo clínicos.
> Estudio de las funcionalidades
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Casos prácticos
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Estrategia Innovadora
FUNCIONALIDAD
EFECTO SOBRE LA SALUD
-Bioaccesibilidad.
-Diana funcional de interés.
-Estudio mecanismo de acción (EFSA).
TECNOLÓGICA
-Reducción de riesgos microbiológicos.
-Optimizar formato aplicación.
-Identificación de cultivos iniciadores.
-Mejorar de las propiedades sensoriales.
Identificar
Evaluar
Demostrar
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> Evaluación y caracterización de funcionalidades
DIANA FUNCIONAL
METABOLISMO DEL COLESTEROL
OBESIDAD
SISTEMA INMUNITARIO
NEUROPROTECCIÓN
BIOACCESIBILIDAD
RIESGO MICROBIOLÓGICO
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desarrollo de alimentos funcionales para la prevención del síndrome metabólico
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FLASH TECNOLOGICO: NUTRIGENOMICA ainia
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NutriciónAvances tecnológicos
en Biología Molecular
+
GENOMICA NUTRICIONAL
NUTRIGENOMICA NUTRIGENETICA
Gen
Nutriente
Nutriente
Gen
PROYECTO GENOMA HUMANO
CONCEPTOInnova_t-NUTRIGENOMICA
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Nutrición personalizada para prevenir o tratar enfermedades
OBJETIVO GENOMICA NUTRICIONAL
Innova_t-NUTRIGENOMICA
Enfermedades de gran impacto social estudiadas con base
nutrigenómica:
• Diabetes
• Enfermedades cardiovasculares
• Obesidad
• Cáncer
• Enfermedad de Crohn
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NUTRIGENOMICA Y TECNOLOGIAS “OMICAS”
TRANSCRIPTOMICAMETABOLOMICA
PROTEOMICA
GENÓMICA
DIETA GENES ADN
ARNExpresión génica
PROTEÍNAS
METABOLITOS
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EJEMPLO ESTUDIO BASE NUTRIGENOMICA
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Consorcios País Objetivo Web
NutrigenomicsConsortium
Holanda Regulación génica de los ácidos grasos en el síndormemetabólico
http://www.nutrigenomicsconortium.nl
Network of Excellence in Nutrigenomics(NUGO)
Europa (EC) Estlecimiento de una red europea de investigación nutrigenómica (investigación, aprendizaje, estanadraización…)
www.nugo.org
NCMHD Center ofExcellence forNutritional Genomics
USA Dieta personalizadaInteracciones gen dieta
nutrigenomics.ucdavis.edu
Centre of Excellence in Nutrigenomics
Nueva Zelanda Enfermedad de CrohnNuevos compuestos bioactivos
www.nutrigenomics.org.nz
Functional Food Genomics
Japón Biomarcadores y ingredientes bioactivos
Nutrigenomics Network Alemania Enfermedades complejasInteracciones gen—dieta
www.nutrigenomik.de
REDES DE NUTRIGENÓMICA
Innova_t-NUTRIGENOMICA
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Innova_t-NUTRIGENOMICA
NUTRIGENOMICA
Identificar y valorar tendencias
tecnológicas en Nutrigenómica,
Alimentación y Salud, para conocer el
futuro y poder establecer medidas para
su óptimo progreso
Factores sociales, legales y ambientales
Estilo de vida
Tecnologías de procesado de alimentos
Ingredientes con actividad específica
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