UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Programa de Pós-Graduação de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos Escola de Química Dissertação de Mestrado Aplicação de Tecnologia Enzimática na Obtenção de β-Caroteno a partir de Óleo de Buriti (Mauritia vinifera) Bernardo Dias Ribeiro RIO DE JANEIRO FEVEREIRO/2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Programa de Pós-Graduação de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de Química
Dissertação de Mestrado
Aplicação de Tecnologia Enzimática
na Obtenção de β-Caroteno a partir de
Óleo de Buriti (Mauritia vinifera)
Bernardo Dias Ribeiro
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO/2008
APLICAÇÃO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA NA OBTENÇÃO DE β-CAROTENO A PARTIR DE ÓLEO DE BURITI (MAURITIA VINIFERA)
Bernardo Dias Ribeiro
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE PÓS-
GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS DA ESCOLA
DE QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIIRO, COMO PARTE DOS
REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS (M.Sc.).
Orientadores:
Prof. Daniel Weingart Barreto, D. Sc. Profª. Maria Alice Zarur Coelho, D. Sc.
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO/2008
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T 18 R484a Ribeiro, Bernardo Dias
Aplicação de tecnologia enzimática na obtenção de β-caroteno a partir de óleo de buriti (Mauritia vinifera)/ Bernardo Dias Ribeiro. Rio de Janeiro, 2008.
xvi, 103 f.: il. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, 2008.
Orientadores: Daniel Weingart Barreto e Maria Alice
Zarur Coelho 1. Hidrólise enzimática. 2. Óleo de Buriti. 3. β-
Caroteno 4. Lipases I. Barreto, D. W. (Orient.) II. Coelho, M. A. Z. (Orient.) III. UFRJ. Escola de Química. IV. Título
CDD: 665.3
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por ter me dado força e autoconfiança para conseguir superar todas as dificuldades que enfrentei durante esta dissertação;
À minha mãe Sonia, que sempre lutou muito para me dar estudo, comida, conforto, e tudo mais o que ela pode fazer, apesar de todas as dificuldades que a vida lhe proporcionou. Sempre darei o meu melhor para poder corresponder o seu esforço, mãe;
À minha avó Maria, meu avô Afranio e meu tio Afranio José por me apoiarem sempre quando precisei, apesar de não conseguir ser mais presente como era em alguns anos atrás, mas tenham certeza que amo muito todos vocês;
À minha noiva Aline, porque além de me fazer muito feliz, me deu algumas sugestões interessantes durante a condução desta dissertação;
A todos os meus amigos e familiares, por não terem me esquecido apesar de toda minha ausência neste período;
Ao meu orientador prof. Daniel Barreto, grande mestre e “pai científico”, por ter me ensinado como pensar mais concretamente sobre produtos naturais e também na minha vida, a ter mais foco nas pesquisas devido a minha avidez de querer saber sobre tudo e achar tudo interessante. Grandes conversas na hora do almoço que giravam em torno de praticamente qualquer assunto. Acima de tudo, mestre, obrigado por sua amizade e consideração;
À minha orientadora profª Maria Alice, por ter me acolhido carinhosamente no seu laboratório desde 2003, e que considero como minha “madrinha científica”. Quem conhece sabe que você tem um coração imenso, teacher, e só tenho a agradecer por mim e por todos do laboratório por tudo o que você faz pensando em nós;
À Roberta, Etel, Priscilla, Gizele, Ana Iraidy, Ariana, André, Mariana, Kelly, Tatiana e todos os outros que freqüentaram o laboratório de Enzimologia Industrial, pela amizade e pelo ambiente agradável de trabalho;
Á estagiária Lívia, por ter me ajudado em algumas análises em um ponto crítico da dissertação, e também ao pessoal do Departamento de Processos Orgânicos (Érika, Elizandra, Karine e Lourdes) pela convivência pacifica e divertida;
À profª Suely Freitas, por te me emprestado alguns solventes para realização de experimentos;
À profª Eliana Flávia, e ao técnico Paulinho, por terem permitido o uso do shaker no laboratório E-107;
A profª Magali Cammarota, por ter permitido o uso dos seus equipamentos, enquanto nosso laboratório estava em obras;
A profª Andréa Salgado e a pós-doutoranda Ninoska, por ter permitido o uso de seu shaker no Laboratório de Engenharia Química;
Ao prof Alexandre Torres (IQ-UFRJ), por ter me tirado várias dúvidas de HPLC, e de análise de insaponificáveis;
À profª Claudia Rezende (IQ-UFRJ), e as alunas Carolina, Silvia e Michelle, por terem feito e me explicado um pouco mais sobre análise da composição de ácidos graxos em cromatografia em fase gasosa;
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À prof Délia Rodriguez-Amaya (FEA-UNICAMP), por ter me enviado um artigo falando sobre carotenóides da polpa de buriti, e por ter feito o guia de análise e isolamento de carotenóides, que foram essenciais para a tese;
A todas as demais pessoas que contribuíram, direta e indiretamente, para que o presente texto pudesse ser desenvolvido;
Aos membros da banca examinadora, pelo aceite do convite;
A CAPES, pela bolsa de mestrado concedida;
A FAPERJ, pela bolsa ALUNO NOTA 10 concedida;
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Alguns homens vêem as coisas como são, e dizem: Por quê?
Eu sonho com as coisas que nunca foram e digo: Por que não?
George Bernard Shaw
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RESUMO RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicação de tecnologia enzimática para obtenção de β-caroteno a partir de óleo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.
O β-caroteno é utilizado como corante alimentício ou como complemento nutricional, por ser a principal fonte de pró-vitamina A. Estima-se que o mercado mundial de carotenóides, que em 2005 foi de 887 milhões de dólares, irá crescer 3% ao ano, quebrando a barreira de 1 bilhão de dólares em 2009, sendo o β-caroteno responsável por quase 30% deste mercado. A maior parte do β-caroteno vendido no mundo é obtida por síntese química a partir da β-ionona, mas uma pequena parte é produzida por processos biotecnológicos, utilizando diferentes microorganismos, tais como fungos filamentosos (Blaskelea trispora e Phycomyces blaskeleeanus), leveduras (Rhodotorula glutinis), bactérias (Flavobacterium multivorum) e microalgas (Dunaliella salina e D. bardawil). Alguns frutos oleaginosos como o dendê (Elaeis guineensis) e o buriti (Mauritia vinifera) apresentam um alto teor de carotenóides, principalmente de β-caroteno. O buriti é uma palmácea que cresce em diversas áreas do Brasil, e apresenta diversos usos tradicionais, como na preparação de refrescos e doces da região Amazônica. O recente interesse em novas fontes naturais de β-caroteno têm estimulado o desenvolvimento de processos para a extração do óleo rico em carotenóides do buriti. A maior parte desses processos, entretando, ainda é baseada em tecnologias convencionais que incluem a secagem e a prensagem do óleo da polpa. O presente trabalho trata da caracterização inicial do óleo bruto e refinado de buriti, incluindo a determinação dos insaponificáveis, e posteriormente a hidrólise enzimática de ambos os óleos, para a posterior extração e concentração de β-caroteno. Na etapa de hidrólise foi avaliado o desempenho de duas lipases comerciais, Lipozyme TL IM e CALB L, e também de uma lipase produzida em laboratório originada de Yarrowia lipolytica. Os parâmetros avaliados no processo de extração foram: temperatura, quantidade de enzima (atividade enzimática) e relação substrato (óleo de buriti) / água. As condições experimentais foram estabelecidas através de um planejamento estatístico de experimentos, de forma a se otimizar seus valores em função do maior rendimento de ácidos graxos livres e a perda mínima de carotenóides durante o processo. Os resultados foram analisados em relação ao teor de ácidos graxos livres por titulação; carotenóides totais por espectrofotômetro e composição de carotenóides totais por HPLC, utilizando coluna YMC ODS-A com fase móvel de acetonitrila/metanol/THF (50/45/5). Na caracterização do óleo bruto, os resultados foram similares aos já encontrados na literatura, mas o óleo refinado apresentou apocarotenóides, que são formados durante o processo de refino de óleos vegetais. As condições ótimas de hidrólise enzimática foram diferentes para cada óleo, onde a lipase Lipozyme TL IM apresentou uma atividade lipolítica superior às demais. Após a hidrólise do óleo, foram testados alguns métodos para separar os ácidos graxos formados dos carotenóides, e assim aumentar a concentração de β-caroteno no produto final.
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ABSTRACT RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicação de tecnologia enzimática para obtenção de β-caroteno a partir de óleo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.
β-carotene is the main source of provitamin A, and is widely used as a food colorant and nutritional supplier. The global market for carotenoids, which was of US$ 887 millions in 2005 and has been growing at an yearly rate of 3% , is estimated to surpass US$ 1 billion in 2009., β-carotene being responsible for almost 30% of this market. Most of the β-carotene sold in the world is produced by chemical synthesis from β-ionone, but a small amount is manufactured using biotechnological processes, based on different microorganisms, such as fungi (Blaskelea trispora and Phycomyces blaskeleeanus), yeasts (Rhodotorula glutinis), bacteria (Flavobacterium multivorum) e microalgae (Dunaliella salina and D. bardawil). Some oleaginous fruits such as palm (Elaeis guineensis) and buriti (Mauritia vinifera) present high concentrations of carotenoids, specially β-carotene. Buriti is a palm tree that grows wild in different areas of Brazil, and has been traditionally used for the preparation of beverages and candies in the Amazon area. The recent interest about other natural sources of β-carotene stimulated the development of processes to extract the carotenoid-rich oil of the buriti fruit. Most processes, however, are still based on the conventional technologies for pulps, including drying and pressing the oil off the pulp. The present work involves the initial characterization of crude and refined buriti oil. The characterization includes the determination of unsaponifiable matter, followed by enzymatic hydrolysis, for further extraction and concentration of β-carotene from the buriti oil. In the hydrolysis process, the performance of two commercial lipases Lipozyme TL IM and CALB L, and also a lipase originated from Yarrowia lipolytica produced in our laboratory was evaluated. The analysed parameters in the hydrolysis process were temperature, enzyme quantity (enzymatic activity) and ratio substrate buriti oil/ water. The experimental conditions were established based on an experimental design in order to set the more favourable conditions for the process. The results were analysed for the free fatty acids contents using titration; total carotenoids using spectrophotometry and its composition by HPLC, using a YMC ODS-A column with a mobile phase of acetonitrile/methanol/THF (50/45/5). In the characterization of crude oil, the results were similar with those described in the literature, but the refined oil presented apocarotenoids, which were formed during the refining of the oils. The optimized conditions of the enzymatic hydrolysis were different for each oil, where the Lipozyme TL IM had a higher lipolytic activity. After the hydrolysis of the oil, some methods were tested to separate the fatty acids formed from the carotenoids, increasing the β-carotene concentration in the final product.
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LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Exemplares de soja, canola e palma ..........................................................................1 Figura 2 - Traumatina .................................................................................................................1 Figura 3 - Principais carotenos ...................................................................................................5 Figura 4 - Principais xantofilas...................................................................................................6 Figura 5 - Biossíntese resumida dos insaponificáveis (Simões et al, 2003)...............................8 Figura 6 - Esquema geral de biossíntese de terpenóides (Dewick, 2002) ..................................8 Figura 7 - Biossíntese de licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005). ..................9 Figura 8 - Biossíntese de carotenóides a partir do licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005)................................................................................................................................10 Figura 9 - Principais isômeros cis do β-caroteno .....................................................................11 Figura 10 - Epoxicarotenóides derivados do β-caroteno..........................................................11 Figura 11 - Apocarotenóides derivados do β-caroteno ............................................................12 Figura 12 - Formulação de β-caroteno dispersável em água (http://www.corporate.basf.com/, 2007).........................................................................................................................................15 Figura 13 – Alimentos biofortificados. A) Tomate laranja e normal; B) Arroz dourado e branco .......................................................................................................................................16 Figura 14 - Vias sintéticas para obtenção de β-ionona.............................................................18 Figura 15 - Síntese de β-caroteno por condensação enol-éter..................................................19 Figura 16 – Síntese de β-caroteno por condensação de Wittig ................................................19 Figura 17 – Dunaliella salina e seu cultivo em tanques abertos ..............................................20 Figura 18 – Phycomyces blakesleeanus e um zigosporo de Blakeslea trispora .......................22 Figura 19 - Rhodotorula glutinis e Sporobolomyces roseus ....................................................22 Figura 20 - Halomonas elongata e Escherichia coli ................................................................23 Figura 21 – Palmeiras e frutos do buriti ...................................................................................25 Figura 22 – Algumas reações catalisadas por lipases...............................................................30 Figura 23 – Esquema geral do sítio ativo de uma lipase ..........................................................32 Figura 24 – Mecanismo de reação em lipases ..........................................................................33 Figura 25 – Perfil de carotenóides dos óleos de buriti .............................................................55 Figura 26 – Avaliação do tempo reacional de hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti .........................................................................................................................................56 Figura 27 – Avaliação da quantidade de ácidos graxos produzida pelo custo de lipase durante a hidrólise de óleo bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................56 Figura 28 – Avaliação da temperatura na redução da concentração de β-caroteno durante a hidrólise de óleo bruto (a) e refinado (b) de buriti ...................................................................57 Figura 29 – Avaliação da relação óleo/água na hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti .........................................................................................................................................58 Figura 30 – Avaliação da quantidade de enzima sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................58 Figura 31 – Avaliação da quantidade de enzima sobre a concentração de carotenóides .........58 Figura 32 – Avaliação de emulsificantes sobre a hidrólise enzimática dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................59 Figura 33 - Avaliação da adição de cálcio sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.....................................................................................................................................60 Figura 34 – Avaliação de adição de adsorventes sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................61 Figura 35 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................62
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Figura 36 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a concentração de carotenóides durante a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti .............................................................62 Figura 37 - Avaliação da substituição da água por tampão fosfato sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti ...............................................................................................62 Figura 38 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b).........................................64 Figura 39 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM..................................................................................................................................................65 Figura 40 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)........................................66 Figura 41 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L..................................................................................................................................................67 Figura 42 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b).................................68 Figura 43 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica ...................................................................................................................................69 Figura 44 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme TL IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b).........................................71 Figura 45 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme TL IM .............................................................................................................................................72 Figura 46 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)........................................73 Figura 47 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L................................................................................................................................................74 Figura 48 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b) ......................75 Figura 49 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica ...................................................................................................................76 Figura 50 – Otimização da quantidade de enzima na hidrólise enzimática dos óleos de buriti79 Figura 51 – Avaliação da velocidade de agitação sobre a hidrólise enzimática dos óleos de buriti .........................................................................................................................................79 Figura 52 – Otimização do tempo reacional na hidrólise enzimática dos óleos de buriti ........80 Figura 53 – Avaliação de ácidos graxos livres e carotenóides durante o pós-processamento do óleos bruto e refinado de buriti.................................................................................................82 Figura 54 – Perfil de carotenóides do óleo refinado após desacidificação com soda alcoólica82 Figura 55 – Fitoesteróis ..........................................................................................................101 Figura 56 – Retinal .................................................................................................................102 Figura 57 - Tococromanóis: (A) Tocoferóis, (B) Tocotrienóis ..............................................102 Figura 58 – Toruleno (R = CH3) e Torularodina (R = COOH) ..............................................102
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LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Insaponificáveis de alguns óleos vegetais ................................................................2 Tabela 2 – Potenciais fontes vegetais produtoras de β-caroteno..............................................24 Tabela 3 – Composição centesimal da polpa do fruto de buriti ...............................................26 Tabela 4 – Perfil de ácidos graxos de frutos oleaginosos.........................................................27 Tabela 5 – Perfil de carotenóides de alguns óleo vegetais .......................................................27 Tabela 6 – Faixas ótimas de atuação de algumas lipases .........................................................31 Tabela 7 - Comparação entre processos convencionais de hidrólise de óleos e gorduras........35 Tabela 8 – Faixa de valores utilizada para otimização dos parâmetros da hidrólise enzimática..................................................................................................................................................50 Tabela 9 – Planejamento Composto Central em 3 níveis com 3 pontos centrais.....................51 Tabela 10 – Comparação da composição de ácidos graxos dos óleos de buriti .......................52 Tabela 11 – Comparação dos índices físico-químicos dos óleos de buriti...............................53 Tabela 12 – Comparação da composição de carotenóides dos óleos de buriti.........................54 Tabela 13 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti utilizando planejamento composto central ........................63 Tabela 14 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti utilizando planejamento composto central ...................70 Tabela 15 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti .........................................................................................................................................77 Tabela 16 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti .........................................................................................................................................77
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AOT Sulfosuccinato de bis(2-etill hexil) sódio ATP Adenosina Trifosfato BHT Butiril hidroxitolueno CHB1 Carotenóide β-hidroxilase non-heme-di-ferro monooxigenase CHB2 Carotenóide β-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450 CHE Carotenóide ε-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450 CRTISO Carotenóide isomerase FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FPP Pirofosfato de farnesila GGPP Pirofosfato de geranilgeranila HPLC High Pressure Liquid Chromatography IPP Pirofosfato de isopentenila LCB Licopeno β-ciclase LCE Licopeno ε-ciclase PD Fitoeno desaturase PEP Fosfoenolpiruvato ppm Partes por milhão = mg/kg PUFA Poly unsaturated fatty acids Span 20 Monolaurato de sorbitana THF Tetrahidrofurano Tween 80 Polioxietileno monooleato de sorbitana UV-VIS Ultravioleta-visível ZD ζ-Caroteno desaturase
3.4) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS _______________________________ 46 3.4.1) Caracterização dos Óleos de buriti ___________________________________ 46 3.4.2) Pré-Avaliação do Processo Enzimático________________________________ 47
3.4.2.1) Tempo reacional e Seleção de enzimas_____________________________ 47 3.4.2.2) Temperatura _________________________________________________ 48 3.4.2.3) Relação Óleo/Água ____________________________________________ 48 3.4.2.4) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimática) ______________________ 48 3.4.2.5) Aditivos _____________________________________________________ 48
3.4.3) Otimização da Hidrólise Enzimática __________________________________ 49 3.4.4) Desacidificação e Concentração de β-Caroteno_________________________ 51
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO _______________________________ 52
4.1) CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS DE BURITI ________________________ 52 4.1.1) Composição em ácidos graxos_______________________________________ 52 4.1.2) Determinação dos Índices Físico-Químicos ____________________________ 52 4.1.3) Composição e Perfil de Carotenóides _________________________________ 53
4.2) PRÉ-AVALIAÇÃO DO PROCESSO ENZIMÁTICO _____________________ 55 4.2.1) Determinação do Tempo Reacional e Seleção das Enzimas ________________ 55 4.2.2) Pré-avaliação dos Parâmetros do Planejamento Experimental _____________ 57
4.2.2.1) Temperatura _________________________________________________ 57 4.2.2.2) Relação Óleo/Água ____________________________________________ 57 4.2.2.3) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimática) ______________________ 58
4.3) OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA ________________________ 63 4.3.1) Planejamento Experimental do Óleo Bruto de Buriti _____________________ 63
4.3.1.1) Lipozyme TL IM______________________________________________ 63 4.3.1.2) Lipozyme CALB L ____________________________________________ 66 4.3.1.3) Lipase de Yarrowia lipolytica ____________________________________ 68
4.3.2) Planejamento Experimental do Óleo Refinado de Buriti___________________ 70 4.3.2.1) Lipozyme TL IM______________________________________________ 70 4.3.2.2) Lipozyme CALB L ____________________________________________ 73 4.3.2.3) Lipase de Yarrowia lipolytica ____________________________________ 75
4.3.3) Resumo das Condições Ótimas na Hidrólise dos Óleos de Buriti ____________ 77 4.3.4) Otimização ______________________________________________________ 78
4.3.4.1) Quantidade de Enzima _________________________________________ 78 4.3.4.2) Agitação ____________________________________________________ 79 4.3.4.3) Tempo Reacional _____________________________________________ 79
4.4) DESACIDIFICAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE β-CAROTENO ___________ 80
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4.4.1) Recuperação da Alumina ___________________________________________ 80 4.4.2) Métodos de Desacidificação ________________________________________ 81
e toranja (Citrus paradisi), enquanto o ζ-caroteno está presente em pequenas quantidades em
grande número de plantas, sendo que apenas na carambola (Averrhoa carambola) e no
maracujá (Passiflora alata) este adquire maior importância, aparecendo como seu principal
pigmento. Outros carotenos como o fitoflueno e fitoeno são incolores e provavelmente mais
largamente distribuídos do que o reportado (Isler,1971; Britton et al,1995).
Dentre os carotenos cíclicos, o que mais se destaca é o β-caroteno, presente em
cenoura (Daucus carota), manga (Mangifera indica), acerola (Malpighia glabra), damasco
(Prunus armeniaca), nêspera (Mespilus germanica) e frutos da família Palmae/Arecaceae. O
α-caroteno e o γ-caroteno estão geralmente em menor concentração que o β-caroteno, sendo
o primeiro encontrado em cenouras e abóboras (Cucurbita sp.), e o último em rosa silvestre
(Rosa canina) e pitanga (Eugenia uniflora). O δ-caroteno é menos freqüente, mas encontrado
em tomate e pupunha (Bactris gasipaes) (Goodwin, 1976; Rodriguez-Amaya, 2001).
Figura 4 - Principais xantofilas
6
Dentre as xantofilas hidroxiladas, as principais são derivadas do α- e β-caroteno, como
a β-criptoxantina, luteína e zeaxantina. β-criptoxantina é o principal pigmento de frutos
alaranjados, como pêssego (Prunus persica), caqui (Diospyros kaki) e cajá-mirim (Spondias
mombin). Luteína é o carotenóide predominante em folhas, vegetais verdes e flores amarelas,
e a zeaxantina é o principal no milho (Zea mays) e no piquiá (Cariocar villosum). As
xantofilas epoxidadas como a violaxantina e a anteraxantina são os produtos da degradação
de outros carotenóides, como a zeaxantina, e subestimadas nos alimentos, como a manga, por
exemplo (Goodwin, 1976; Rodriguez-Amaya, 2001).
Há algumas xantofilas incomuns como a capsantina, presente em pimenta malagueta
(Capsicum frutescens), bixina, principal pigmento do urucum (Bixa orellana) e a crocetina,
que é predominante no açafrão (Crocus sativus) (Isler,1971; Britton et al,1995).
Embora folhas verdes contenham hidroxicarotenóides não esterificados, quando o
fruto amadurece, estes são esterificados com ácidos graxos. Mas em alguns frutos como kiwi
(Actinidia chinensis), que permanecem verdes mesmo quando maduros, estes compostos não
são esterificados (Rodriguez-Amaya, 2001; Bouvier et al, 2005).
2.1.2) Biossíntese
Os precursores dos metabólitos especiais presentes nos óleos vegetais, e o próprio óleo
são intermediários no metabolismo primário, que se inicia a partir da fotossíntese, onde a
glicose é gerada para depois ser consumida na respiração e produzir água e CO2, sendo que
esta ocorre em 3 etapas: glicólise, ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa. De uma
forma resumida, a Figura 5 mostra a formação destes metabólitos visando principalmente nos
insaponificáveis (Berg et al, 2004).
7
Figura 5 - Biossíntese resumida dos insaponificáveis (Simões et al, 2003)
A biossíntese dos carotenóides segue o padrão usual da síntese de terpenóides, que
segue a via do ácido mevalônico, onde este é descarboxilado gerando o pirofosfato de
isopentenila (IPP) – principal bloco construtivo dos isoprenóides. O esquema geral da
biossíntese de terpenóides pode ser visto na Figura 6 (Bouvier et al, 2005).
FPP
IPP
IPP
GGPP
Figura 6 - Esquema geral de b
iossíntese de terpenóides (Dewick, 2002)
8
A passagem do intermediário fitoeno para o licopeno (Figura 7) ocorre através de
enzimas que promovem a desidrogenação, envolvendo a remoção de pares de átomos de
hidrogênio de forma alternada (Dey & Harborne, 1997; Fraser & Bramley, 2004; Bouvier et
al, 2005).
Após a formação do licopeno, ocorre a ciclização através da licopeno ciclase, podendo
gerar δ-caroteno (anel ε) ou γ-caroteno (anel β), que são os precursores do α-caroteno e do β-
caroteno, respectivamente. Estes carotenos formados podem ser modificados para geração de
outros carotenóides como luteína e zeaxantina (Figura 8) e outras xantofilas, através de
hidroxilases, epoxidases, cetolases e sintases.
PD
ZDCRTISO
ZD
PD
Figura 7 - Biossíntese de licopeno. PD: fitoeno desaturase; ZD, ζ-caroteno desaturase; CRTISO, carotenóide isomerase (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).
9
LCE LCB
LCB LCB
CHB1, CHB2 CHB1, CHB2
CHE CHB1, CHB2
Figura 8 - Biossíntese de carotenóides a partir do licopeno. LCE, licopeno ε-ciclase; LCB, licopeno β-ciclase; CHB1, carotenóide β-hidroxilase non-heme-di-ferro monooxigenase; CHB2, carotenóide β-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450; CHE, carotenóide ε-hidroxilase ligada ao núcleo heme do citocromo P450 (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).
2.1.3) Propriedades e modificações
A presença de ligações duplas conjugadas na estrutura dos carotenóides contribui para
sua pigmentação, absorção de radiação na faixa de UV-VIS e atividade antioxidante, mas
também são a principal razão da sua instabilidade química, pois as ligações duplas conjugadas
são muito suscetíveis à oxidação e à isomerização geométrica.
Alguns fatores como calor, luz, ácidos, refluxo em solvente orgânico, fusão de cristais
e tratamento com iodo, podem promover a isomerização cis-trans dos carotenóides (Figura 9).
A isomerização de trans-carotenóides, que é a configuração usual dos carotenóides na
natureza, para a forma cis aumenta a solubilidade e diminui a intensidade da cor, o ponto de
fusão e a atividade de pró-vitamina A (Goodwin, 1976; Britton et al, 1995; Rodriguez-
Amaya, 2001; Schiebe & Carle, 2005).
10
Figura 9 - Principais isômeros cis do β-caroteno
A oxidação, o principal mecanismo de degradação dos carotenóides, é acelerada pela
luz, calor, presença de ácidos graxos insaturados, peróxidos, metais como ferro, cobre e
manganês, e exposição a solventes orgânicos e enzimas (lipoxigenases, fenoloxidases e
peroxidases) (Goodwin, 1976; Britton et al, 1995; Rodriguez-Amaya, 2001).
Os principais derivados da degradação de carotenóides são os epoxicarotenóides
(Figura 10), apocarotenóides (Figura 11) e compostos voláteis, que apesar de terem sua
atividade pró-vitamímica A muito reduzida, ainda podem ser aproveitados como corantes
alimentícios, no caso de alguns apocarotenóides, ou como aromatizantes naturais, no caso dos
compostos voláteis (Rodriguez & Rodriguez-Amaya, 2007; Uenojo et al, 2007).
Figura 10 - Epoxicarotenóides derivados do β-caroteno
11
Estes derivados são formados em vários tipos de processamento de alimentos, como
cozimento, fritura, pasteurização, extrusão e desidratação, com perdas em torno de 25-35%
parcialmente o perfil dos mesmos nos óleos. Assim, a faixa operacional foi delimitada entre 1
e 50 U para o planejamento experimental, mantendo sempre o volume reacional de 8 mL.
01020304050607080
1U 10U 50U 100U 250U
%AG
L
0
1020304050607080
1U 10U 50U 100U 250U
%A
GL
(b)(a)
Figura 30 – Avaliação da quantidade de enzima sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti
0
500
1000
1500
2000
2500
1 U 1
Caro
tenó
ides
(ppm
)
Figura 31 – Avaliação da quantidade d
0 U 50 U 100 U 250 U
Oleo BrutoOleo Refinado
e enzima sobre a concentração de carotenóides
58
4.2.3) Pré-avaliação dos Aditivos 4.2.3.1) Emulsificantes
A adição de emulsificantes a este sistema reacional poderia aumentar a área interfacial
entre a fase oleosa e a aquosa, facilitando a atuação lipásica na hidrólise. Na Figura 32 é
apresentado o rendimento em ácidos graxos encontrado quando alguns emulsificantes (goma
arábica, Tween 80 e Span 20) foram adicionados na concentração de 5% em peso pelo
volume de água presente. Para uma melhor comparação, foi realizado um experimento sem
adição de emulsificantes (branco). Nenhum dos emulsificantes promoveu um aumento em
ácidos graxos livres comparativamente ao branco, e também não alterou significativamente o
teor de carotenóides presentes com as três lipases testadas.
0
5
10
15
20
25
30
Branco Gomaarabica
Tween Span
% A
GL
Yarrowia TL CalB
0
5
10
15
20
25
30
Branco Gomaarabica
Tween Span
% A
GL
Yarrowia TL CalB
(b)(a)
Figura 32 – Avaliação de emulsificantes sobre a hidrólise enzimática dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti
4.2.3.2) Cálcio A adição de íons cálcio a esse sistema reacional poderia: na forma solúvel, estabilizar
a lipase, dependendo da estrutura tridimensional da enzima, além de possibiltar a formação de
sabão (interação entre íons cálcio e os ácidos graxos gerados); ou ainda na forma insolúvel,
atuando como adsorvente dos ácidos graxos formados, deslocando o equilíbrio da reação no
sentido da hidrólise.
Na Figura 33 é apresentado o re
adicionado substituindo a água por uma so
de CaCO3 em concentrações de 5% em pes
ndimento em ácidos graxos quando o cálcio é
lução aquosa de CaCl2 a 0,01 e 0,05M ou na forma
o pelo volume de óleo presente.
59
Para uma melhor comparação, foi feito um experimento sem adição de cálcio (branco).
A adição de CaCO3 gerou um aumento (2 vezes) no rendimento em ácidos graxos com todas
as lipases avaliadas, mas ao mesmo tempo, este reduziu a concentração de carotenóides em
20%, além de necessitar de um maior número de centrifugações para sua separação da fase
orgânica.
A adição de solução de CaCl2 apresentou um pequeno aumento no rendimento em
ácidos graxos quando foram utilizadas enzimas livres, não sendo este aumento porém muito
siginificativo. No caso da Lipozyme TL, a adição de CaCl2 teve efeito negativo na hidrólise
dos óleos de buriti, principalmente no óleo refinado. Isso pode ter ocorrido pela formação de
sabão e possível oclusão dos poros do suporte.
0
10
20
30
40
50
60
Branco CaCl20,05M
CaCl20,01M
CaCO3 5%
% A
GL
Yarrowia TL CalB
0
10
20
30
40
50
60
Branco CaCl20,05M
CaCl20,01M
CaCO3 5%
% A
GL
Yarrowia TL CalB
(a) (b)
Figura 33 - Avaliação da adição de cálcio sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti
4.2.3.3) Adsorventes Foram testados dois adsorventes nesta etapa, um inorgânico (alumina básica, pH entre
9-10, para cromatografia em coluna, com diâmetro de partícula de 0,05-0,15 mm e área
superficial de 155 m²/g) e um polimérico (amberlita XAD2, uma resina de poliestireno-
divinilbenzeno, com diâmetro de partícula de 0,25 – 0,80 mm e área superficial de 300 m²/g).
A alumina foi selecionada dada a sua gra
Hordern, 2004), inclusive com ácidos gra
tipos de compostos hidrofóbicos até massa
de ácidos graxos, deslocando o equilíbrio d
nde interação com ácidos carboxílicos (Kasprzyk-
xos (Queiroz 1996). Já a amberlita adsorve vários
molar de 20 kDa, o que possibilitaria a adsorção
a reação no sentido da reação de hidrólise.
60
Inicialmente ambos os adsorventes foram adicionados em concentrações de 5% em
peso por volume de óleo. Ambos os adsorventes apresentam rendimentos em ácidos graxos
similares (Figura 34), sendo facilmente removidos por centrifugação após a hidrólise. A
concentração de carotenóides se manteve inalterada no caso da amberlita e apresentou uma
redução de 9% quando a alumina é utilizada. Mas, entre estes dois adsorventes, há uma
grande diferença em relação aos seus custos. A alumina básica tem um custo de US$37 / kg, e
amberlita XAD2 apresenta um custo bem maior: US$116 / kg.
0
10
20
30
40
50
60
Branco Amberlita Alumina
% A
GL
Yarrow ia
TL
CalB
0
10
20
30
40
50
60
Branco Amberlita Alumina
%A
GL
Yarrow iaTLCalB
(b)(a)
Figura 34 – Avaliação de adição de adsorventes sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti
Por isso, alumina foi escolhida para fazer os testes alterando sua concentração no meio
reacional, como é apresentado nas Figuras 35 e 36. O aumento da concentração de alumina na
hidrólise enzimática levou a uma maior adsorção dos carotenóides, como no caso da
utilização de 20% de alumina onde houve a redução de 15% no óleo bruto e de 35% no óleo
refinado, sendo esta adsorção preferencial por apocarotenóides. Até a concentração de 10% de
alumina, esta adsorção de carotenóides é menos evidenciada, e apresenta um alto rendimento
em ácidos graxos (superior a 60%), sendo por isso a quantidade de alumina escolhida para ser
usada no planejamento experimental.
61
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 5 10 20% Alumina no óleo
% A
GLYarrowiaTLCalB
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 5 10 20% Alumina no óleo
% A
GL
YarrowiaTLCalB
(b)(a)
Figura 35 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 1 5 10 20% Alumina no óleo
Caro
tenó
ides
(ppm
)
Yarrowia TL CalB
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 1 5 10 20% Alumina no óleo
Caro
tenó
ides
(ppm
)
Yarrowia TL CalB
(b)(a)
Figura 36 - Avaliação da quantidade de alumina sobre a concentração de carotenóides durante a hidrólise dos óleos bruto (a) e refinado (b) de buriti
4.2.3.4) Tampão Fosfato A utilização de uma solução tampão neste sistema reacional poderia manter o pH de
melhor atuação lipásica durante a hidrólise, promovendo um aumento da produção de ácidos
graxos. A substituição da água por uma solução tampão fosfato de sódio 0,05 e 0,2M
promoveu um ligeiro aumento no rendimento em ácidos graxos, mas não muito
representativo, como visto na Figura 37, sem alterações na concentração de carotenóides. Por
isso, a água foi mantida para o planejamento experimental.
05
10152025303540
Branco 0,05M 0,2M
%A
GL
Yarrowia TL CalB
25303540
Yarrowia TL CalB
(b)(a)
Figura 37 - Avaliação da substituição da água prefina
05
101520
Branco 0,05M 0,2M
%A
GL
or tampão fosfato sobre a hidrólise dos óleos bruto (a) e
do (b) de buriti
62
4.3) OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
4.3.1) Planejamento Experimental do Óleo Bruto de Buriti Os resultados obtidos durante o planejamento experimental são apresentados na
Tabela 13 referente à hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti, sendo destacados em
negrito os melhores rendimentos em ácidos graxos livres para cada lipase utilizada.
Tabela 13 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti utilizando planejamento composto central
Lipozyme TL IM Lipozyme CALB L Lipase de Y. lipolytica Ensaios %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm)
4.3.1.1) Lipozyme TL IM Na Figura 38 são apresentados os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos
livres e aos carotenóides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da
atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos e o termo quadrático da temperatura, no caso
dos carotenóides. O coeficiente de correlação, R², para os ácidos graxos livres foi igual a 0,75,
e para os carotenóides foi de 0,74, tendo baixo ajuste ao modelo.
63
(a)
(b)
Figura 38 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)
Na Figura 39, o intervalo ótimo (com maior desirability) foi determinado em 10 - 35U
de atividade enzimática, 1,9 - 2,9 de relação óleo/água e 27 - 36°C de temperatura. As
condições ótimas encontradas foram: temperatura de 31,2°C, atividade enzimática de 21,6U e
relação óleo/água de 2,33. Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta
(ácidos graxos livres e carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de
regressão resultando em 64,48% e 1749 pp
m, respectivamente.
64
Figura 39 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação
óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme TL IM
65
4.3.1.2) Lipozyme CALB L Na Figura 40 são apresentados os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos
livres e aos carotenóides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da
atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos; e o termo linear da temperatura, no caso dos
carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos graxos livres foi calculado como
0,70, e para os carotenóides 0,77, tendo baixo ajuste ao modelo.
(a)
(b)
Figura 40 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)
Na Figura 41, o intervalo ótimo (com maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade
enzimática, 1,0 - 1,6 de relação óleo/água
encontradas foram: temperatura de 45°C, a
1,6. Com estas condições foram calculada
carotenóides) através do modelo utilizan
18,80% e 2067 ppm, respectivamente.
e 25 - 45°C de temperatura. As condições ótimas
tividade enzimática de 50U e relação óleo/água de
s as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e
do os coeficientes de regressão resultando em
66
Figura 41 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação
óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por Lipozyme CalB L
67
4.3.1.3) Lipase de Yarrowia lipolytica Na Figura 42 são apresentados os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos
livres e aos carotenóides, sendo estatisticamente significativo os termos linear e quadrático da
atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos; e o termo linear da relação óleo/água, o
termo quadrático da temperatura e a interação entre atividade enzimática e a temperatura, no
caso dos carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos graxos livres foi de 0,92,
e para os carotenóides foi de 0,88, tendo melhor ajuste ao modelo do que aquele obtido nos
ensaios empregando as demais lipases.
(a)
(b)
Figura 42 – Diagrama de Pareto para avaliação lipolytica sobre ácidos g
Na Figura 43, o intervalo ótimo (co
enzimática, 1,0 - 1,3 de relação óleo/água
encontradas foram: temperatura de 42,4°C,
da hidrólise do óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia raxos livres (a) e carotenóides (b)
m maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade
e 40 - 45°C de temperatura. As condições ótimas
atividade enzimática de 47,6U e relação óleo/água
68
de 1,0. Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e
carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de regressão resultando em
34,56% e 1861 ppm, respectivamente.
Figura 43 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação
óleo/água sobre a hidrólise de óleo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica
69
4.3.2) Planejamento Experimental do Óleo Refinado de Buriti Os resultados obtidos durante o planejamento experimental foram distribuídos na
Tabela 14 referente a hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti, sendo destacados em
negrito os melhores rendimentos em ácidos graxos livres para cada lipase utilizada.
Tabela 14 – Comparação dos resultados (ácidos graxos livres e carotenóides) da hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti utilizando planejamento composto central
Lipozyme TL IM Lipozyme CALB L Lipase de Y. lipolytica Ensaios %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm) %AGL Carotenóides (ppm)
4.3.2.1) Lipozyme TL IM Na Figura 44 são apresentados os diagramas de Pareto referentes às variáveis-resposta,
ácidos graxos livres e carotenóides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear
da atividade enzimática, no caso dos ácidos graxos livres; e a interação entre a temperatura e a
relação óleo/água, no caso dos carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos
graxos livres foi de 0,80, e para os carotenóides foi de 0,81.
70
(a)
(b)
Figura 44 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme TL
IM sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)
Na Figura 45, o intervalo ótimo (com maior desirability) foi de 25 - 40U de atividade
enzimática, 1,0 - 1,8 de relação óleo/água e 25 ou 45°C de temperatura. As condições ótimas
encontradas foram: temperatura de 45°C, atividade enzimática de 31,2U e relação óleo/água
de 1,8. Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e
carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de regressão resultando em
75,86% e 878 ppm, respectivamente.
71
Figura 45 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação
óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme TL IM
72
4.3.2.2) Lipozyme CALB L Os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos livres e aos carotenóides para a
enzima Lipozyme CalB L são apresentados na Figura 46, sendo estatisticamente significativo
o termo linear da atividade enzimática e da relação óleo/água, no caso dos ácidos graxos; e o
termo linear da atividade enzimática, o termo quadrático da relação óleo/água e a interação
entre a atividade enzimática e a relação óleo/água, no caso dos carotenóides. O coeficiente de
correlação R² para os ácidos graxos livres foi de 0,83, e para os carotenóides foi de 0,84.
(a)
(b)
Figura 46 – Diagrama de Pareto para avaliação da hidrólise do óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L sobre ácidos graxos livres (a) e carotenóides (b)
Na Figura 47, o intervalo ótimo
atividade enzimática, 1,2 - 2,0 de relação ó
ótimas encontradas foram: temperatura d
óleo/água de 1,667.
(com maior desirability) foi obtido em 50U de
leo/água e 25 - 30°C de temperatura. As condições
e 25°C, atividade enzimática de 50U e relação
73
Com estas condições foram calculadas as variáveis de resposta (ácidos graxos livres e
carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de regressão resultando em
28,55% e 792 ppm, respectivamente.
Figura 47 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação
óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por Lipozyme CalB L
74
4.3.2.3) Lipase de Yarrowia lipolytica Os diagramas de Pareto referentes aos ácidos graxos livres e aos carotenóides para a
ação de hidrólise de Yarrowia lipolytica são apresentados na Figura 48. O termo linear da
atividade enzimática e da temperatura, o termo quadrático da temperatura e a interação entre
temperatura e atividade enzimática mostraram-se estatisticamente significativos, no caso dos
ácidos graxos; e o termo linear e quadrático da temperatura, o termo linear da atividade
enzimática e as interações entre a atividade enzimática e a relação óleo/água, e também com a
temperatura, no caso dos carotenóides. O coeficiente de correlação R² para os ácidos graxos
livres foi de 0,94, e para os carotenóides foi de 0,92, tendo um bom ajuste ao modelo.
(a)
(b)
Figura 48 – Diagrama de Pareto para avaliaçYarrowia lipolytica sobre ácid
Na Figura 49, o intervalo ótimo (co
de 40 - 50U de atividade enzimática, 2
temperatura.
ão da hidrólise do óleo refinado de buriti por lipase de os graxos livres (a) e carotenóides (b)
m maior desirability) foi determinado no intervalo
,5 - 3,0 de relação óleo/água e 25 - 28°C de
75
As condições ótimas encontradas foram: temperatura de 29°C, atividade enzimática de
50U e relação óleo/água de 3,0. Com estas condições foram calculadas as variáveis de
resposta (ácidos graxos livres e carotenóides) através do modelo utilizando os coeficientes de
regressão resultando em 30,80% e 708 ppm, respectivamente.
Figura 49 – Curvas de nível fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, atividade enzimática e relação
óleo/água sobre a hidrólise de óleo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica
76
4.3.3) Resumo das Condições Ótimas na Hidrólise dos Óleos de Buriti Para uma melhor comparação dos resultados obtidos neste planejamento experimental,
foram dispostos nas Tabelas 15 e 16 os dados referentes às condições ótimas e os rendimentos
em ácidos graxos livres e carotenóides previstos pelos modelos da hidrólise enzimática dos
óleos bruto e refinado de buriti, respectivamente.
Tabela 15 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti Condição Ótima Rendimento Enzimas
T (°C) Ativ (U) Óleo/Agua % AGL Carotenóides (ppm) Lipozyme TL 31,2 21,6 2,33 64,48 1749 Lipozyme CalB L 45 50 1,6 18,80 2067 Lipase de Y. lipolytica 42,4 47,6 1,0 34,56 1861
Tabela 16 – Comparação das condições ótimas para hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti
Lipozyme TL 45 31,2 1,8 75,86 878 Lipozyme CalB L 25 50 1,67 28,55 792 Lipase de Y. lipolytica 29 50 3,0 30,80 708
Os rendimentos em ácidos graxos tão distintos podem ser explicados pelas diferentes
estruturas tridimensionais dos sítios ativos das lipases utilizadas (Gutierrez-Ayesta et al,
2007) ou também pela possível hiperativação ocasionada pelo método de imobilização usado
na produção da Lipozyme TL IM, que deixaria o sítio ativo sempre exposto e ativado (Cunha,
2007). Devos et al (2006) fez uma comparação entre 12 lipases na hidrólise de fosfolipídeos
de biomassa algal, mostrando que a Lipozyme TL IM também gerou rendimentos em ácidos
graxos saturados e monoinsaturados de 75%, apesar de utilizar maior tempo reacional (24 h),
maior agitação (24 h), maior quantidade de enzima (1% p/v) e maior proporção entre fase
orgânica e aquosa (1/10). Já a lipase imobilizada de Candida antarctica apresentou resultados
abaixo dos 20% de ácidos graxos livres, valor próximo ao obtido na hidrólise do óleo bruto de
buriti.
77
As lipases de Candida antarctica e Yarrowia lipolytica não possuem um histórico em
reações de hidrólise de óleos vegetais na literatura, e sim na resolução de misturas racêmicas
(Guieysse et al, 2004; Ong et al¸ 2006), na síntese de novas moléculas (Fantin et al, 2001;
Yoshida et al, 2006) ou em outras modificações de óleos e gorduras (Hérnandez-Martín &
Otero, 2008). Por isso, a obtenção de baixos rendimentos em ácidos graxos não foi
surpreendente, mas o estudo foi necessário, justamente pela falta de dados na literatura.
4.3.4) Otimização Em ambas as hidrólises enzimáticas, tanto do óleo bruto como do óleo refinado de
buriti, o maior rendimento em ácidos graxos livres (até 75%) foi obtido quando utilizou-se a
Lipozyme TL IM com pequenas perdas de carotenóides.
Em todos os diagramas de Pareto analisados foi verificado que a atividade enzimática
foi estatisticamente significativa na hidrólise dos óleos no que se refere à produção de ácidos
graxos livres. Porém, como a correlação dos dados experimentais com o modelo teve um
baixo ajuste na maioria das avaliações, decidiu-se testar este parâmetro isoladamente,
mantendo as outras condições ótimas previstas pelo modelo.
Ainda objetivando uma maior hidrólise do óleo, foram testadas diferentes velocidades
de agitação do sistema, de forma a aumentar a área interfacial, facilitando a atuação lipásica.
Também foi avaliada a cinética reacional de hidrólise da Lipozyme TL IM em intervalos de
tempo menores que os utilizados no item 3.4.2.1.
4.3.4.1) Quantidade de Enzima Na Figura 50, pode-se determinar como condições ótimas de atividade enzimática 25
U (0,47% p/v) e 35 U (0,66% p/v) de Lipozyme TL IM para o óleo bruto e refinado,
respectivamente, sendo obtidos os maiores rendimentos em ácidos graxos livres (próximo de
70%), sem perdas significativas de carotenóides.
78
01020304050607080
0 10 20 30 40 50 60 70Ativ Enz (U)
%A
GL
Óleo BrutoÓleo Refinado
0200400600800
100012001400160018002000
0 10 20 30 40 50 60 70Ativ Enz (U)
Car
oten
óide
s (p
pm)
Óleo BrutoÓleo Refinado
Figura 50 – Otimização da quantidade de enzima na hidrólise enzimática dos óleos de buriti
4.3.4.2) Agitação Mantendo as condições obtidas no item 4.3.3.1., a velocidade de agitação de 300 rpm
foi escolhida, pois gerou maiores incrementos nos rendimentos em ácidos graxos livres,
alcançando perto de 75%, com perdas de carotenóides ligeiramente inferiores aos obtidos a
400 rpm (Figura 51).
60
65
70
75
80
Óleo Bruto Óleo Refinado
% A
GL
200 rpm300 rpm400 rpm
0200400600800
10001200140016001800
Óleo Bruto Óleo Refinado
Car
oten
óide
s (p
pm) 200 rpm
300 rpm400 rpm
Figura 51 – Avaliação da velocidade de agitação sobre a hidrólise enzimática dos óleos de buriti
4.3.4.3) Tempo Reacional Tendo como condições iniciais para óleo bruto (25U de atividade enzimática, 2,33 de
relação óleo/água e 31,2°C de temperatura) e para o óleo refinado (35U de atividade
enzimática, 1,8 de relação óleo/água e 45°C de temperatura), além da velocidade de agitação
de 300 rpm, foi avaliada nesta última etapa a cinética reacional. Na Figura 52, observa-se que
a partir de 4 h de reação, a hidrólise tanto do óleo bruto como do refinado se estabiliza, sendo
então esta condição mantida como tempo reacional necessário ao processo.
79
Adicionalmente, o rendimento em ácidos graxos parece ter estabilizado em 75% fato
que pode ter ocorrido pela alteração do pH, que alcançou valores próximos a 5, pela formação
dos ácidos graxos livres, levando a uma possível inibição da lipase.
01020304050607080
0 1 2 3 4 5 6 7 8tempo (h)
% A
GL
Óleo BrutoÓleo Refinado
0200400600800
100012001400160018002000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (h)
Car
oten
óide
s (p
pm)
Óleo BrutoÓleo Refinado
Figura 52 – Otimização do tempo reacional na hidrólise enzimática dos óleos de buriti
4.4) DESACIDIFICAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE β-CAROTENO 4.4.1) Recuperação da Alumina
A alumina nos experimentos de hidrólise do óleo de buriti adsorveu cerca de 15% dos
ácidos graxos liberados e ainda 5% dos carotenóides presentes no caso do óleo bruto, e
próximo de 10% no caso do óleo refinado. Esse aumento da adsorção de carotenóides pela
alumina no óleo de refinado deve estar relacionado com a grande presença de
apocarotenóides, que apresentam grupos aldeídos ou carboxílicos, os quais possuem afinidade
com a alumina (Kasprzyk-Hordern, 2004). Para a recuperação da alumina, e, por conseguinte
dessorção dos ácidos graxos e carotenóides, foram utilizados alguns solventes orgânicos como
etanol, acetona e éter de petróleo, puros ou em mistura.
A mistura 1/1 (v/v) de etanol e acetona promoveu a dessorção de 60% dos
carotenóides em apenas uma extração no caso da alumina usada durante a hidrólise do óleo
bruto de buriti, e utilizando o álcool etílico em 2 extrações obteve-se a remoção de 50% ds
carotenóides da alumina referente a hidrólise do óleo refinado. A utilização de 3 extrações,
sendo duas iniciais de etanol e uma última sendo uma mistura 1/1 de álcool etílico e acetona
removeu 85% dos ácidos graxos adsorvidos da alumina referente a hidrólise de ambos os
óleos de buriti.
80
4.4.2) Métodos de Desacidificação 4.4.2.1) Partição com Etanol
Inicialmente foi avaliado o tempo de agitação para a partição dos ácidos graxos ao
etanol, verificando que em 15 min a concentração de ácidos graxos já se estabilizava em 10%.
Resultado superior foi obtido por Gonçalves & Meirelles (2004) onde 53% dos ácidos graxos
presentes na fase oleosa distribuíram-se para fase alcoólica, mas neste trabalho foi incluída
uma etapa de repouso de 24 h para que as fases atingissem o equilíbrio e quantidade de ácidos
graxos livres presentes em sua amostra era pequena, cerca de 4%.
Em relação aos carotenóides apenas 2% se distribuem para a fase etanólica quando é
utilizado o óleo bruto de buriti, e cerca de 8%, no caso do óleo de refinado, onde 90% são
apocarotenóides. Gonçalves et al (2007) verificaram que os carotenóides de óleo de palma se
distribuem para a fase alcoólica entre 1,6 a 2,7%, podendo incrementar essa proporção se a
quantidade de água no sistema for menor, por exemplo com a utilização de etanol anidro
aumenta a partição dos carotenóides para 13%.
Na Figura 53 observa-se a variação dos ácidos graxos livres e dos carotenóides desde a
finalização do processo enzimático (1), a separação da fase orgânica (carotenóides + ácidos
graxos) da fase aquosa (água + glicerol + alumina + enzima + ácidos graxos precipitados) (2),
e após 4 extrações sucessivas da fase orgânica com álcool etílico (3).
Com as extrações por etanol, houve uma perda de 4,4% de carotenóides quando a fase
orgânica do óleo bruto de buriti foi utilizada, e 18,5% de carotenóides referentes ao óleo
refinado. Pela tendência descendente de ácidos graxos livres presentes na fase orgânica,
demonstrada na figura 53, para se alcançar 5% de ácidos graxos livres (tendo como referência
a quantidade inicial de ácidos graxos livres do óleo refinado de buriti), seriam necessárias
mais 4 extrações sucessivas com etanol.
81
01020304050607080
1 2 3
% A
GL
Óleo BrutoÓleo Refinado
0
500100015002000250030003500
1 2 3
Car
oten
óide
s (p
pm)
Óleo BrutoÓleo Refinado
Figura 53 – Avaliação de ácidos graxos livres e carotenóides durante o pós-processamento do óleos bruto e
refinado de buriti, onde (1) representa a finalização do processo enzimático; (2), a separação das fases orgânica e aquosa e (3), a desacidificação com etanol em 4 extrações sucessivas
4.4.2.2) Saponificação A saponificação foi realizada com soluções aquosas e alcoólicas 0,5 M de NaOH. A
saponificação aquosa não obteve separação de fases em nenhum dos dois óleos de buriti,
gerando apenas sabão. A saponificação alcoólica só obteve separação de fases com o óleo
refinado de buriti, já que o óleo bruto se tornou uma fase homogênea com a soda alcoólica.
A saponificação alcoólica foi realizada por 2 vezes sucessivas no óleo refinado,
removendo mais de 90% dos ácidos graxos livres, e também 35% dos carotenóides presentes,
além da diminuição de 63% do volume da fase rica em carotenóides. Apesar desses fatores,
esta fase ainda manteve 1085 ppm de carotenóides com uma grande alteração no seu perfil
(Figura 54), se aproximando muito do perfil de carotenóides encontrado no óleo bruto, com
69% de β-caroteno e 5% de apocarotenóides.
Figura 54 – Perfil de carotenóides do óleo refinado após desacidificação com soda alcoólica
82
4.4.2.3) Winterização A winterização foi realizada apenas no óleo bruto, pois no óleo refinado de buriti não
ocorreu a formação de nenhum precipitado ao se resfriar a fase orgânica.
Após a winterização do óleo bruto, foram obtidas 2 fases: a primeira sólida com 43%
de ácidos graxos livres e 3186 ppm de carotenóides, enquanto a outra líquida obtendo 26% de
ácidos graxos livres e 3910 ppm de carotenóides.
83
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÃO • A caracterização do óleo bruto e refinado de buriti se mostrou coerente com os dados
referenciados na literatura. A presença de apocarotenóides em quantidades elevadas no
óleo refinado de buriti confirma que o processo de refino promove a degradação de
carotenóides e a diminuição do seu valor nutricional.
• A pré-avaliação do processo enzimático determinou os intervalos de alguns parâmetros
para o planejamento experimental, como temperatura (25 a 45°C), relação óleo/água (1/1 a
3/1) e atividade enzimática (1 a 50U) em um volume de mistura reacional de 8 mL. Além
disso, determinaram-se o tempo reacional (4 h), as lipases a serem utilizadas (lipase de
Yarrowia lipolytica, Lipozyme TL IM e CALB L) e o uso da alumina em concentração de
10% p/v como aditivo para aumentar a hidrólise enzimática dos óleos bruto e refinado de
buriti.
• O planejamento experimental composto central determinou que tanto para hidrólise do
óleo bruto como do óleo refinado de buriti a Lipozyme TL IM foi a enzima que gerou
melhor rendimento em ácidos graxos livres, com pequenas perdas em carotenóides. Mas
como os modelos obtidos neste planejamento obtiveram baixo ajuste aos dados
experimentais, e também devido à atividade enzimática se demonstrar estatisticamente
significativa, foram realizadas etapas adicionais de otimização para avaliação da influência
de outras quantidades de Lipozyme TL IM, tempo reacional e agitação sobre a hidrólise.
Com isso, concluiu-se que as condições ótimas para a hidrólise enzimática dos óleo de
buriti são: bruto - 25U de atividade enzimática, 2,33 de relação óleo/água e 31,2°C de
temperatura e refinado - 35U de atividade enzimática, 1,8 de relação óleo/água e 45°C de
temperatura, mantendo o tempo reacional em 4 horas e alterando a velocidade de agitação
para 300 rpm.
84
• Dos métodos de desacidificação realizados, a utilização de solução etanólica 0,5M NaOH
sobre a fase orgânica do óleo refinado de buriti removeu 90% dos ácidos graxos livres
presentes, além dos apocarotenóides, permitindo um perfil de carotenóides próximo ao do
óleo bruto de buriti.
• Já para o óleo bruto de buriti, a combinação dos métodos de winterização e partição com
etanol parece ser a melhor alternativa para a desacidificação, pois a winterização promove
uma grande concentração de carotenóides e o etanol remove gradualmente os ácidos
graxos livres.
85
CAPÍTULO 6 – SUGESTÕES • No caso do óleo refinado de buriti, poder-se-ia testar a remoção dos apocarotenóides por
processos com membranas, antes mesmo de se realizar a hidrólise enzimática.
• O óleo de palma também poderia ser utilizado como matéria-prima para obtenção de β-
caroteno através de hidrólise enzimática.
• A adição de óleo vegetal em matrizes vegetais ricas em β-caroteno, como a cenoura e a
batata-doce; em licopeno, como o tomate e a melancia, ou ainda em xantofilas de interesse
comercial, caso de luteína e zeaxantina para a extração dos carotenóides, seguida de uma
posterior hidrólise enzimática do óleo vegetal poderia ser uma alternativa interessante, a
ser investigada.
• Novas opções de processo, como: a combinação de duas lipases distintas, sendo que uma
delas com maior atuação em faixa mais ácida de pH; outros emulsificantes; outros
adsorventes; maiores velocidades de agitação; e outras lipases, sendo estas originadas de
microrganismos diferentes deveriam ser testadas visando o aumento no rendimento da
hidrólise.
• Outros métodos de desacidificação poderiam ser testados como a extração supercrítica, a
extração por solventes utilizando outros álcoois de cadeia curta (metanol, propanol e
butanol) puros, ou com concentrações variadas de água.
• Diferentes concentrações de NaOH poderiam ser testadas para verificar a quantidade
mínima de base para a remoção de ácidos graxos livres e apocarotenóides.
• A possibilidade de integrar os métodos de winterização e extração com etanol para
aumentar a eficiência do processo na remoção dos ácidos graxos livres e na concentração
de β-caroteno do óleo bruto de buriti também poderia ser verificada.
86
• Métodos mais focados na complexação ou na encapsulamento dos carotenóides, invés da
remoção dos ácidos graxos, poderiam ser testados como a utilização de ciclodextrinas e
uréia.
• A presença dos outros insaponificáveis (fitoesteróis e tocoferóis) durante o processamento
enzimático e desacidificação, para verificar seu aproveitamento futuro, deveria ser
analisada.
87
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBAS, H.; HIOL, A.; DEYRIS, V.; COMEAU, L.; Isolation and characterization of an
extracellular lipase from Mucor sp. strain isolated from palm fruit. Enzyme and Microbial Technology, 31 (7), 968-975, 2002.
ABIDI, S. L.; Chromatographic analysis of tocol-derived lipid antioxidants. Journal of Chromatography A, 881, 197-216, 2000.
ABRIMIC, M.; LESCIC, I.; KORICA, T.; VITALE, L.; SAENGER, W.; PIGAC, J.; Purification and properties of extracellular lipase from Streptomyces rimosus. Enzyme and Microbial Technology, 25, 522-529, 1999.
AL-BABILI, S.; BEYER, P.; Golden rice – five years on the road – five years to go? Trends in Plant Science, 10 (12), 565-573, 2005.
ALOULOU, A.; RODRIGUEZ, J. A.; PUCCINELLI, D.; MOUZ, N.; LECLAIRE, J.; LEBLOND, Y.; CARRIÈRE, F.; Purification and biochemical characterization of the LIP2 lipase from Yarrowia lipolytica. Biochimica et Biophysica Acta, 1771, 228-237, 2007.
AMARAL, P. F. F.; Produção de lipase de Yarrowia lipolytica em biorreator multifásico. Tese (Doutorado), Programa de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química, UFRJ, Rio de Janeiro, 2007.
ARORA, S.; MANJULA, S.; KRISHNA, A. G. G.; SUBRAMANIAN, R.; Membrane processing of crude palm oil. Desalination, 191, 454-466, 2006.
BATISTELLA, C. B.; MACIEL, M. R. W.; Recovery of carotenoids from palm oil by molecular distillation. Computers & Chemical Engineering, 22, S53-S60, 1998.
BERG, J.M.; TYMOCZKO, J.L.; STRYER, L.; Bioquímica, 5ª ed., Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004.
BHOSALE, P.; BERNSTEIN, P. S.; β-Carotene production by Flavobacterium multivorum in the presence of inorganic salts and urea. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 31, 565-571, 2004.
BHOSLE, B. M.; SUBRAMANIAN, R.; New approaches in deacidification of edible oils – a review. Journal of Food Engineering, 69, 481-494, 2005.
BORA, P. S.; NARAIN, N.; ROCHA, R. V. M.; MONTEIRO, A. C. O.; MOREIRA, R. A.; Characterization of the oil and protein fractions of tucumã (Astrocaryum vulgare Mart.) fruit pulp and seed kernel. Ciencia y Tecnología Alimentaria, 3 (2), 111-116, 2001.
88
BOUVIER, F.; RAHIER, A.; CAMARA, B.; Biogenesis, molecular regulation and function of plant isoprenoids. Progress in Lipid Research, 44, 357-429, 2005a.
BRIGIDA, A. I. S.; Estudo da imobilização de lipase tipo B de Candida antarctica utilizando fibra de casca de coco verde como suporte. Dissertação (Mestrado), Departamento de Engenharia Química, UFC, Fortaleza, 2006.
BRÍGIDA, A. I. S.; Amaral, P. F.; GONCALVES, L. R. B.; Coelho, M. A. Z.;. Characterization of an Extracellular lipase from Yarrowia lipolytica. In: European Congress of Chemical Engineering ECCE 6, 2007, Copenhagen. ECCE-6 Book of Abstracts. Denmark : Norhaven Book, v. 2, 2007.
BURKERT, J. F. M.; MAUGERI, F.; RODRIGUES, M. I.; Optimization of extracellular lipase production by Geotrichum sp. using factorial design. Bioresource Technology, 91, 77-84, 2004.
BUZZINI, P.; INNOCENTI, M.; TURCHETTI, B.; LIBKIND, D.; VAN BROOCK, M.; MULINACCI, N.; Carotenoid profiles of yeasts belonging to the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, and Sporidiobolus. Canadian Journal of Microbiology, 53, 1021-1031, 2007.
CALADO, V.; MONTGOMERY, D. C.; Planejamento de Experimentos usando o Statistica, E-papers Serviços Editoriais, Riode Janeiro, 2003.
CASTRO, H. F.; MENDES, A. A.; SANTOS, J. C.; Modificação de óleos e gorduras por biotransformação. Química Nova, 27 (1), 146-156, 2004.
CAVALCANTI, E. A. C.; Avaliação da atividade lipásica da semente dormente de Ricinus communis. Dissertação (Mestrado), Programa de Pós-Graduação de Ciência de Alimentos, Instituto de Química, UFRJ, Rio de Janeiro, 2006.
CHOO, Y. M.; Palm oil carotenoids. Food and nutrition bulletin, 15 (2), 130-137, 1994.
CHOUDHARI, S.; SINGHAL, R.; Media optimization for the production of β-carotene by Blaskelea trispora: A statistical approach. Bioresource Technology, 99, 722-730, 2008.
CHUANG, M. H.; BRUNNER, G.; Concentration of minor components in crude oil palm. Journal of Supercritical Fluids, 37, 151-156, 2006.
89
COCERO, M. J.; GONZÁLEZ, S.; PÉREZ, S.; ALONSO, E.; Supercritical extraction of unsaturated products. Degradation of β-carotene in supercritical extraction processes. Journal of Supercritical Fluids, 19, 39-44, 2000.
CUNHA, A. G.; Purificação e imobilização de lipases microbianas em suportes com diferentes graus de hidrofobicidade. Dissertação (Mestrado), Programa de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ, 2007.
DANIELI, F.; O óleo de abacate (Persea americana Mill) como matéria-prima para indústria alimentícia. Dissertação (Mestrado), Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, ESALQ, USP, Piracicaba, 2006.
DELLA PENNA, D.; POGSON, B. J.; Vitamin synthesis in plants: tocopherols and carotenoids. Annual Review of Plant Biology, 57, 711-738, 2006.
DE ROSSO, V. V.; MERCADANTE, A. Z.; Carotenoid composition of two Brazilian genotypes of acerola (Malpighia punicifolia L.) from two harvests. Food Research International, 38, 1073-1077, 2005.
DE ROSSO, V. V.; MERCADANTE, A. Z.; Identification and quantification of carotenoids, by HPLC-PDA-MS/MS, from Amazonian fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 5062-5072, 2007.
DEVOS, M.; POISSON, L.; ERGAN, F.; PENCREAC’H, G.; Enzymatic hydrolysis of phospholipids from Isochrysis galbana for docosahexaenoic acid enrichment. Enzyme and Microbial Technology, 39, 548-554, 2006.
DEWICK, P. M.; Medicinal Natural Products: A biosynthetic approach, 2nd ed., John Wiley & Sons, Nova York, 2002.
DEY, P. M.; HARBORNE, J. B.; Plant Biochemistry, Elsevier, Amsterdã, 1997.
DUFOSSÉ, L.; GALAUP, P.; YARON, A.; ARAD, S. M.; BLANC, P.; MURTHY, K. N. C.; RAVISHANKAR, G. A.; Microorganisms and microalgae as sources of pigments for food use: a scientific oddity or an industrial reality? Trends in Food Science & Technology, 16, 389-406, 2005.DESTAIN, J.; ROBLAIN, D.; THONART, P.; Improvement of lipase production from Yarrowia lipolytica. Biotechnology Letters, 19 (2), 105-107, 1997.
DURÃES, J. A.; DRUMMOND, A. L.; PIMENTEL, T. A. P. F.; MURTA, M. M.; BICALHO, F. S.; MOREIRA, S. G. C.; SALES, M. J. A.; Absorption and photoluminescence of Buriti oil/polystyrene and Buriti oil/poly(methyl methacrylate) blends. European Polymer Journal, 42, 3324-3332, 2006.
EASTMOND, P. J.; GRAHAM, I. A.; Re-examining the role of the glyoxylate cycle in oilseeds. Trends in Plant Science, 6 (2), 72-77, 2001.
90
EASTMOND, P. J.; Cloning and characterization of the acid lipase from castor beans. The Journal of Biological Chemistry, 279 (44), 45540-45545, 2004.
FANTIN, G.; FOGAGNOLO, M.; GUERRINI, A.; MEDICI, A.; PEDRINI, P.; FONTANA, S.; Enantioselective hydrolysis with Yarrowia lipolytica: a versatile strain for esters, enol esters, epoxides and lactones. Tetrahedron: Assymetry, 12, 2709-2713, 2001.
FERNANDES, M. L. M.; KRIEGER, N.; BARON, A. M.; ZAMORA, P. P.; RAMOS, L. P.; MITCHELL, D. A.; Hydrolysis and synthesis reactions catalysed by Thermomyces lanuginosa lipase in the AOT/Isooctane reversed micellar system. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 30 (1), 43-49, 2004.
FERNANDEZ R., X. E.; SHIER, N. W.; WATKINS, B. A.; Effect of alcali saponification, enzymatic hydrolysis and storage time on the total carotenoid concentration of Costa Rican crude palm oil. Journal of Food Composition and Analysis, 13, 179-187, 2000.
FIRESTONE, D.; Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists’ Society, 5th ed, AOCS Press, Champaign, 1997.
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO). Food Outlook, 22-27, November 2007.
FRANÇA, L. F.; MEIRELES, M. A. A.; Extraction of oil from pressed palm oil (Elaes guineensis) fibers using supercritical CO2. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 17 (4), 384-388, 1997.
FRANÇA, L. F.; REBER, G.; MEIRELES, M. A. A.; MACHADO, N. T.; BRUNNER, G.; Supercritical extraction of carotenoids and lipids from buriti (Mauritia flexuosa), a fruit from the Amazon region. Journal of Supercritical Fluids, 14, 247-256, 1999.
FRASER, P. D.; BRAMLEY, P. M.; The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids. Progress in Lipid Research, 43, 228-265, 2004.
GAMA, M. F. C. P. J. S.; Purificação e carcaterização de lipases de Penicillium restrictum. Dissertação (Mestrado), Programa de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ, Rio de Janeiro, 2000.
GARCÍA-GONZÁLEZ, M.; MORENO, J.; MANZANO, J. C.; FLORENCIO, F. J.; GUERRERO, M. G.; Production of Dunalliela salina biomasa rich in 9-cis-β-carotene and lutein in a closed tubular photobioreactor. Journal of Biotechnology, 115, 81-90, 2005.
GARCIA-QUIROZ, A.; MOREIRA, S. G. C.; MORAIS, A. V.; SILVA, A. S.; ROCHA, G. N.; ALCANTARA, P.; Physical and chemical analysis of dieletric properties and
GERHARTZ, W.; Enzymes in Industry: Production and Applications; VCH Publishers, Nova York, 1990.
GIULIANO, G.; AQUILANI, R.; DHARMAPURI, S.; Metabolic engineering of plant carotenoids. Trends in Plant Science, 5 (10), 406-409, 2000.
GOBBI, C. N.; Cultivo de Dunaliella salina: Impacto das Condições Operacionais. Dissertação (Mestrado), Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química/UFRJ, Rio de Janeiro, Campinas, 2006.
GODOY, H. T.; RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.; Buriti (Mauritia vinifera Mart.), uma fonte riquíssima de pró-vitamina A. Arquivos de Biologia e Tecnologia, 38 (1), 109-120, 1995.
GONÇALVES, C. B.; MEIRELLES, A. J. A.; Liquid-liquid equilibrium data for the system palm oil + fatty acids + ethanol + water at 318.2 K. Fluid Phase Equilibria, 221, 139-150, 2004.
GONÇALVES, C. B.; PESSOA FILHO, P. A.; MEIRELLES, A. J. A.; Partition of nutraceutical compounds in deacidification of palm oil by solvent extraction. Journal of Food Engineering, 81, 21-26, 2007.
GOODWIN, T. W.; Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, vol. 1 e 2, 2nd ed., Academic Press, Londres, 1976.
GÜÇLÜ-ÜSTÜNDAG, Ö.; TEMELLI, F.; Correlating the solubility behavior of minor lipids components in supercritical carbon dioxide. Journal of Supercritical Fluids, 31, 235-253, 2004.
GUIEYSSE, D.; SANDOVAL, G.; FAURE, L.; NICAUD, J. M.; MONSAN, P.; MARTY, A.; New efficient lipase from Yarrowia lipolytica for the resolution of 2-bromo-arylacetic acid esters. Tetrahedron: Assymetry, 15, 3539-3543, 2004.
GUNSTONE, F. D.; PADLEY, F. B.; Lipid Technologies and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1997.
GUNSTONE, F. D.; Vegetable Oils in Food Technology: Composition, Properties and Uses, Blackwell Publishing/CRC, Oxford, 2002.
92
GUNSTONE, F. D.; HARWOOD, J. L.; DIJKSTRA, A. J.; The Lipid Handbook, 3rd ed, CRC Press, Boca Raton, Estados Unidos, 2007.
GUTIÉRREZ-AYESTA, C.; CARELLI, A. A.; FERREIRA, M. L.; Relation between lipase structures and their catalytic ability to hydrolyse triglycerides and phospholipids. Enzyme and Microbial Technology, 41, 35-43, 2007.
HASAN, F.; SHAH, A. A.; HAMEED, A.; Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, 39, 235-251, 2006.
HEJAZI, M. A.; WIJFFELS, R. H.; Effect of light intensity on β-carotene production and extraction by Dunaliella salina in two-phase bioreactors. Biomolecular Engineering, 20, 171-175, 2003.
HERNÁNDEZ-MARTÍN, E.; OTERO, C.; Different enzyme requirements for the synthesis of biodiesel: Novozym ® 435 and Lipozyme® TL IM. Bioresource Technology, 99, 277-286, 2008.
HIANE, P. A.; BOGO, D.; RAMOS, M. I. L.; RAMOS FILHO, M. M.; Carotenóides pró-vitamínicos A e composição em ácidos graxos do fruto e da farinha do bacuri (Scheelea phalerata Mart). Ciência e Tecnologia de Alimentos, 23 (2), 206-209, 2003.
http://aliceweb.desenvolvimento.gov.br/, acessado no dia 29/12/07.
http://www.corporate.basf.com/en/innovationen/felder/ernaehrung/fotos/?id=V00-ngerLBbcNbcp02I, acessado no dia 30/12/07.
http://www.cotecportugal.pt/index.php?option=com_content&task=view&id=70#06, acessado no dia 07/05/06.
http://www.fao.org/ag/agn/jecfa-additives/details.html?id=699, acessado no dia 04/01/08.
http://www.fao.org/docrep/v0784e/v0784e0c.htm#buriti, acessado em 06/01/08.
http://www.sbaf.org.br/SBAF/_noticias/200503_Carotenoide.htm, acessado no dia 07/05/06.
http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/listabl.asp?c=548&z=p&o=2, acessado em 06/01/08.
http://www.waters.com/WatersDivision/pdfs/WA30000.pdfT, acessado em 13/06/2006.
IKAN, R.; Natural Products: A laboratory guide, 2nd ed., Academic Press, San Diego, 1991.
JAEGER, K. E.; DIJKSTRA, B. W.; REETZ, M. T.; Bacterial biocatalysts: Molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipases. Annual Reviews of Microbiology, 53, 315-351, 1999.
KASPRZYK-HORDERN, B.; Chemistry of alumina, reactions in aqueous solution and its application in water treatment. Advances in Colloid and Interface Science, 110, 19-48, 2004.
KIM, S. W.; KIM, J. B.; JUNG, W. H.; KIM, J. H.; JUNG, J. K.; Over-production of β-carotene from metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnology Letters, 28, 897-904, 2006.
KUZINA, V.; CERDÁ-OLMEDO, E.; Ubiquinone and carotene production in the Mucorales Blakeslea and Phycomyces. Applied Microbiology and Biotechnology, 76, 991-999, 2007.
LAU, H. L. N.; CHOO, Y. M.; MA, A. N.; CHUAH, C. H.; Production of refined carotene-rich palm oil from palm mesocarp (Elaeis guineensis) using supercritical carbon dioxide. Journal of Food Lipids, 14, 396-410, 2007.
LÉON, R.; MARTÍN, M.; VIGARA, J.; VILCHEZ, C.; VEGA, J. M.; Microalgae mediated photoproduction of β-carotene in aqueous-organic two phase systems. Biomolecular Engineering, 20, 177-182, 2003.
LESUISSE, E.; SCHANCK, K.; COLSON, C.; Purification and preliminary characterization of the extracellular lipase of Bacillus subtilis 168, an extremely basic pH-tolerant enzyme. European Journal of Biochemistry, 216 (1), 155-160, 1993.
LIETZ, G.; HENRY, C. J. K.; A modified method to minimise losses of carotenoids and tocopherols during HPLC analysis of red palm oil. Food Chemistry, 60 (1), 109-117, 1997.
LÓPEZ, N.; PERNAS, M. A.; PASTRANA, L. M.; SÁNCHEZ, A.; VALERO, F.; RÚA, M. L.; Reactivity of pure Candida rugosa lipase isoenzymes (Lip 1, Lip 2 and Lip 3) in aqueous and organic media. Influence of the isoenzymatic profile on the lipase performance in organic media. Biotechnology Progress, 20 (1), 65-73, 2004.
MALDONADE, I. R.; RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.; SCAMPARINI, A. R. P.; Carotenoids of yeasts isolated from the Brazilian ecosystem. Food Chemistry, 107, 145-150, 2008.
MALDONADO, R. R.; Produção, purificação e caracterização da lipase de Geotrichum candidum obtida a partir de meios industriais. Dissertação (Mestrado), Programa de Engenharia de Alimentos, FEA/UNICAMP, Campinas, 2006.
MANHÃES, L. R. T.; Caracterização da polpa de buriti (Mauritia flexuosa, Mart.): um potente alimento funcional. Seropédica: UFRRJ, 2007. 78p. Dissertação (Mestrado
94
em Ciência e Tecnologia de Alimentos). Instituto de Tecnologia, Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2007.
MARÍA, P. D.; SÁNCHEZ-MONTERO, J. M.; SINISTERRA, J. V.; ALCÁNTARA, A. R.; Understanding Candida rugosa lipases: An overview. Biotechnology Advances, 24, 180-196, 2006.
MARIATH, J. G. R.; LIMA, M. C. C.; SANTOS, L. M. P.; Vitamin A activity of buriti (Mauritia vinifera Mart) and its effectiveness in the treatment and prevention of xerophthalmia. The American Journal of Clinical Nutrition, 49, 849-853, 1989.
MARINHO, H. A.; CASTRO, J. S.; Carotenóides e valor de pró-vitamina A em frutos da região amazônica: pajurá, piquiá, tucumã e umari. Anais do XVII Congresso Brasileiro de Fruticultura, 2003KANICKY, J. R.; SHAH, D. O.; Effect of degree, type, and position of unsaturation on the pKa of long-chain fatty acids. Journal of Colloid and Interface Science, 256, 201-207, 2002.
MARTINS, T. S. M.; Produção e purificação de lipases de Yarrowia lipolytica (IMUFRJ50682). Dissertação (Mestrado), Departamento de Fármacos, Faculdade de Farmácia, UFRJ, Rio de Janeiro, 2001.
MARTY, C.; BERSET, C.; Factors affecting the thermal degradation of all trans-β-carotene. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38, 1063-1067, 1990.
MATISSEK, R.; SCHNEPEL, F. M.; STEINER, G.; Análisis de los alimentos: Fundamentos, Métodos y Aplicaciones, Editorial Acribia, S. A.; Zaragoza, 1998.
MEHTA, B. J.; SALGADO, L. M.; BEJARANO, E. R.; CERDÁ-OLMEDO, E.; New mutants of Phycomyces blaskeleeanus for β-carotene production. Applied and Environmental Microbiology, 63 (9), 3657-3661, 1997.
MEIRELLES, F. V. P.; Produção de lipases por Yarrowia lipolytica (IMUFRJ50682). Tese (Doutorado), Programa de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ, Rio de Janeiro, 1997.
MOJAAT, M.; FOUCAULT, A.; PRUVOST, J.; LEGRAND, J.; Optimal selection of organic solvents for biocompatible extraction of β-carotene from Dunaliella salina. Journal of Biotechnology, in press, 2007.
MORAES, E. B.; MARTINS, P. F.; BATISTELLA, C. B.; ALVAREZ, M. E. T.; MACIEL FILHO, R.; MACIEL, M. R. W.; Molecular distillation: A powerful technology for obtaining tocopherols from soya sludge. Applied Biochemistry and Biotechnology, 129-132, 1066-1076, 2006.
95
MOREAU, R. A.; WHITAKER, B. D.; HICKS, K. B.; Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods: structural diversity, quantitative analysis, and health-promoting uses. Progress in Lipid Research, 41, 457-500, 2002.
MOREAU, R. A.; POWELL, M. J.; HICKS, K. B.; Evaluation of a commercial enzyme-based serum cholesterol test kit for analysis of phytosterol and phytostanol products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 6663-6667, 2003.
MORETTIN, P. A.; BUSSAB, W. O.; Estatística Básica, 5ª ed., Editora Saraiva, São Paulo, 2002.
NIIZU, P. Y.; Fontes de carotenóides importantes para saúde humana. Dissertação (Mestrado), Ciência dos Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP, Campinas, 2003.
NOOR, I. M.; HASAN, M.; RAMACHANDRAN, K. B.; Effect of operating variables on the hydrolysis rate of palm oil by lipase. Process Biochemistry, 39, 13-20, 2003.
OGINO, H.; NAKAGAWA, S.; SHINYA, K.; MUTO, T.; FUJIMURA, N.; YASUDA, M.; ISHIKAWA, H.; Purification and characterization of organic solvent-stable lipase from organic solvent-tolerant Pseudomonas aeruginosa LST-03. Journal of Bioscience and Bioengineering, 89 (5), 451-457, 2000.
OLIVEIRA, A. L. A.; GIOIELLI, L. A.; OLIVEIRA, M. N.; Hidrólise parcial enzimática da gordura de babaçu. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 19 (2), 270-276, 1999.
ONG, A. L.; KAMARUDDIN, A. H.; BHATIA, S.; LONG, W. S.; LIM, S. T.; KUMARI, R.; Performance of free Candida antarctica lipase B in the enantioselective esterification of (R)-ketoprofen. Enzyme and Microbial Technology, 39, 924-929, 2006.
OOI, C. K.; CHOO, Y. M.; YAP, S. C.; BASIRON, Y.; ONG, A. S. H.; Recovery of carotenoids from palm oil. Journal of American Oil Chemists’ Society, 71 (4), 423-426, 1994.
OSAWA, C. C.; GONÇALVES, L. A. G.; Titulação potenciométrica aplicada na determinação de ácidos graxos livres de óleos e gorduras comestíveis. Química Nova, 29 (3), 593-599, 2006.
OUYANG, J. M.; DAUN, H.; CHANG, S. S.; HO, C. T.; Formation of carbonyl compounds from β-carotene during palm oil deodorization. Journal of Food Science, 45, 1214-1217, 1980.
QUEIROZ JR., P. C.; Hidrólise enzimática de óleo de babaçu em reatores agitados. Dissertação (Mestrado), Programa de Engenharia Química, COPPE, UFRJ, Rio de Janeiro, 1996.
96
PACKER, L.; HIRAMATSU, M.; YOSHIKAWA, T.; Antioxidants Food Supplements in Human Health, Elsevier, Amsterdã, 1999.
PADILHA, M. E. S.; AUGUSTO-RUIZ, W.; Hidrólise enzimática de óleo de pescado. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 27 (2), 285-290, 2007.
PALOZZA, P.; SERINI, S.; DI NICUOLO, F.; PICCIONI, E.; CALVIELLO, G.; Prooxidant effects of β-carotene in cultured cells. Molecular Aspects of Medicine, 24, 353-362, 2003.
PARK, Y. K.; PASTORE, G. M.; ALMEIDA, M. M.; Hydrolysis of soybean oil by a combined lipase system. Journal of American Oil Chemists’ Society, 65, 252-254, 1988.
PAUST, J.; Herstellung und anwendung von carotinoiden. Chimia, 48, 494-498, 1994.
PERRY, R. H.; GREEN, D. W.; Perry’s Chemical Engineers’ Handbook, 7th ed., McGraw Hill Companies, Nova York, 1999.
PFEFFER, J.; RICHTER, S.; NIEVELER, J.; HANSEN, C. E.; RHLID, R. B.; SCHMID, R. D.; RUSNAK, M.; High yield expression of lipase A from Candida antarctica in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and its purification and characterization. Applied Microbiology and Biotechnology, 72, 931-938, 2006.
PINHEIRO-SANT'ANA, H. M.; STRINGHETA, P. C.; BRANDÃO, S. C. C.; PÁEZ, H. H.; QUEIRÓZ, V. M. V.; Evaluation of total carotenoids, α- e β-caroteno in carrots (Daucus carota L.) during home processing. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 18(1), 39-44, 1998.
RAMACHANDRAN, K. B.; AL-ZUHAIR, S.; FONG, C. S.; GAK, C. W.; Kinetic study on hydrolysis of oils by lipase with ultrasonic emulsification. Biochemical Engineering Journal, 32, 19-24, 2006.
REZENDE, M. J. C.; Uso de argila brasileira como catalisador na produção de Biodiesel. Tese (Doutorado), Programa de Química Orgânica, Instituto de Química, UFRJ, Rio de Janeiro, 2006.
RODRIGUES, M. I.; IEMMA, A. F.; Planejamento de Experimentos e Otimização de Processos, Casa do Pão Editora, Campinas, 2005.
RODRIGUEZ, E. B.; RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.; Formation of apocarotenals and epoxycarotenoids from β-carotene by chemical reactions and by autoxidation in model systems and processed foods. Food Chemistry, 101, 563-572, 2007.
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.; Assessment of the provitamin A contents of foods – Brazilian experience. Journal of Food Composition and Analysis, 9, 196-230, 1996.
97
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.; A Guide to Carotenoid Analysis in Food. ILSI Press, Washington, 2001.
RODRÍGUEZ-SAÍZ, M.; SÁNCHEZ-PORRO, C.; DE LA FUENTE, J. L.; MELLADO, E.; BARREDO, J. L.; Engineering the halophilic bacterium Halomonas elongata to produce β-carotene. Applied Microbiology and Biotechnology, 77, 637-643, 2007.
ROONEY, D.; WEATHERLEY, L. R.; The effect of reaction conditions upon lipase catalysed hydrolysis of high oleate sunflower oil in stirred liquid-liquid reactor. Process Biochemistry, 36, 947-953, 2001.
ROSSI, M.; GIANAZZA, M.; ALAMPRESE, C.; STANGA, F.; The effect of bleaching and physical refining on color and minor components of palm oil. Journal of American Oil Chemists’ Society, 78 (10), 1051-1055, 2001.
RUCKER, R. B.; SUTTIE, J. W.; McCORMICK, D. B.; MACHLIN, L. J.; Handbook of Vitamins, 3rd ed., Marcel Dekker, Nova York, 2001.
RUPÉREZ, F. J.; MARTÍN, D.; HERRERA, E.; BARBAS, C.; Chromatographic analysis of α-tocopherol and related compounds in various matrices. Journal of Chromatography A, 935, 45-69, 2001.
SALAS, J. J.; SÁNCHEZ, J.; RAMLI, U. S.; MANAF, A. M.; WILLIAMS, M.; HARWOOD, J. L.; Biochemistry of lipid metabolism in olive and other oil fruits. Progress in Lipid Research, 39, 151-180, 2000.
SANTOS, L. M. P.; Nutritional and ecological aspects of buriti or aguaje (Mauritia flexuosa Linnaeus filius): a carotene-rich palm fruit from Latin America. Ecology of Food and Nutrition, 44, 1-14, 2005.
SATOMURA, Y.; KIMURA, M.; ITOKAWA, Y.; Simultaneous determination of retinol and tocopherols by high-performance liquid-chromatography. Journal of Chromatography A, 625 (2), 372-376, 1992.
SAXENA, R. K.; SHEORAN, A.; GIRI, B.; DAVIDSON, S.; Purification strategies for microbial lipases. Journal of Microbiological Methods, 52, 1-18, 2003.
SCHIEBE, A.; CARLE, R.; Occurrence of carotenoid cis- isomers in food: Technological, analytical, and nutritional implications. Trends in Food Science & Technology, 16, 416-422, 2005.
SHARMA, R.; CHISTI, Y.; BANERJEE, U. C.; Production, purification, characterization and applications of lipases. Biotechnology Advances, 19, 627-662, 2001.
98
SHREVE, R. N.; BRINK JR., J. A.; Indústrias de Processos Químicos, 4a ed., Editora Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1997.
SHU, Z. Y.; YANG, J. K.; YAN, Y. J.; Purification and characterization of a lipase from Aspergillus niger F044. Chinese Journal of Biotechnology, 23 (1), 96-100, 2007.
SILVA, C.; CABRAL, J. M. S.; VAN KEULEN, F.; Isolation of a β-carotene over-producing soil bacterium, Sphingomonas sp.. Biotechnology Letters, 26, 257-262, 2004.
SILVA, C. R.; Bioativos tropicais com eficácia comprovada. Cosmetics & Toiletries (Ed. Português), 14 (1), 42-46, 2002.
SILVEIRA, C. S.; Estudo químico e farmacológico dos frutos de Syagrus oleracea (Mart.) Becc. (Guariroba) e Mauritia vinifera Mart. (Buriti). Dissertação (Mestrado), Pós-Graduação em Química de Produtos Naturais, NPPN, UFRJ, Rio de Janeiro, 2004.
SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R.; Farmacognosia, da planta ao medicamento, 5ª ed., Editora da UFSC/ Editora da UFRGS, Florianópolis/Porto Alegre, 2003.
SPOLAORE, P.; JOANNIS-CASSAN, C.; DURAN, E.; ISAMBERT, A.; Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering, 101 (2), 87-96, 2006.
SUBRAMANIAN, R.; NABETANI, H.; NAKAJIMA, M.; ICHIKAWA, S.; KIMURA, T.; MAEKAWA, T.; Rejection of carotenoids in oil systems by a nonporous polymeric composite membrane. Journal of American Oil Chemists’ Society, 78 (8), 803-807, 2001.
TAVARES, M.; AUED-PIMENTEL, S.; LAMARDO, L. C. A.; CAMPOS, N. C.; JORGE, L. I. F.; GONZALEZ, E.; Composição química e estudo anatômico dos frutos de buriti do Município de Buritizal, Estado de São Paulo. Revista do Instituto Adolfo Lutz, 62 (3), 227-232, 2003.
TINOI, J.; RAKARIYATHAM, N.; DEMING, R. L.; Simplex optimization of carotenoid production by Rhodotorula glutinis using hydrolyzed mung bean waste flour as substrate. Process Biochemistry, 40, 2551-2557, 2005.
UENOJO, M.; MARÓSTICA JR., M. R.; PASTORE, G. M.; Carotenóides: Propriedades, aplicações e biotransformação para formação de compostos de aroma. Química Nova, 30 (3), 616-622, 2007.
UHLIG, H.; Industrial Enzymes and their Applications, John Wiley & Sons, Inc.; Toronto, Canada, 1998.
99
VACEK, M.; ZAREVÚCKA, M.; WIMMER, Z.; STRÁNSKÝ, K.; KOUTEK, B.; MACKOVÁ, M.; DEMNEROVÁ, K.; Lipase-mediated hydrolysis of blackcurrant oil. Enzyme and Microbial Technology, 27, 531-536, 2000.
WANG, Y. J.; SHEU, J. Y.; WANG, F. F.; SAHW, J. F.; Lipase-catalyzed oil hydrolysis in the absence of added emulsifier. Biotechnology and Bioengineering, 31 (6), 628-633, 1988.
XU, W. L.; HUANG, Y. B.; QIAN, J. H.; SHA, O.; WANG, Y. Q.; Separation and purification of stigmasterol and β-sitosterol from phytosterol mixtures by solvent crystallization method. Separation and Purification Technology, 41, 173-178, 2005.
YAO, C.; TANG, S.; HE, Z.; DENG, X.; Kinetics of lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil in AOT/isooctane reverd micelles> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 35, 108-112, 2005.
YOSHIDA, Y.; KIMURA, Y.; KADOTA, M.; TSUNO, T.; ADACHI, S.; Continuous synthesis of alkyl ferulate by immobilized Candida antarctica lipase at high temperature. Biotechnology Letters, 28, 1471-1474, 2006.
YOU, L. L.; BAHARIN, B. S.; QUEK, S. Y.; ABDULLAH, M. A.; TAKAGI, S.; Recovery of palm carotene from palm oil and hydrolyzed palm oil by adsorption column chromatography. Journal of Food Lipids, 9, 87-93, 2002.
100
GLOSSÁRIO Cloroplasto: é uma organela presente nas células das plantas e algas, rico em clorofila,
responsável pela sua cor verde, e onde a fotossíntese é realizada. Cromoplasto: é uma organela presente nas células das plantas e algas, onde ocorre a
biossíntese de pigmentos. Distribuição t de Student: é uma distribuição de probabilidades referente a inferências de
médias de populações normalmente distribuídas, sendo a base para o popular teste t de Student onde se avalia a significância estatística da diferença entre 2 médias amostrais, e também os intervalos de confiança da diferença entre 2 médias populacionais (Morettin & Bussab, 2002).
Endosperma: é um tecido vegetal, que se encontra nas sementes de muitas angiospermas e
acumula reservas nutritivas, como amido, proteínas e óleo, utilizadas pelo embrião durante seu desenvolvimento.
Fitoesteróis: alcoóis cristalinos, neutros e de alto ponto de fusão, sendo que os principais são
β-sitosterol, campesterol e estigmasterol (figura 55, Moreau et al, 2002).
Figura 55 – Fitoesteróis
Log P: logaritmo do coeficiente de partição da substância de um sistema padrão bifásico 1-
octanol/água. Quanto maior o log P, mais apolar é o solvente ou a mistura (Mojaat et al, 2007).
Mecanismo Ping-Pong Bi Bi: mecanismo cinético de reações com múltiplos produtos e
substratos catalisadas por lipases, onde E é enzima; Es, éster; Al, álcool; Ac, ácido; W, água; F, enzima em outro estado conformacional (Cunha, 2007)
Pericarpo: é o tecido do fruto que envolve e protege a semente nas angiospermas, incluindo
três camadas: epicarpo (mais externa), mesocarpo (intermediária) e endocarpo (mais interna).
Retinóides: derivados de síntese de vitamina A, dentre eles retinal (figura 56), retinol e
tretinoína (Rucker et al, 2001).
101
Figura 56 – Retinal
Significância estatística: é a probabilidade máxima de se rejeitar acidentalmente uma
hipótese nula (a ser testada) verdadeira. Spray-drying: é um método em que o material a ser seco passa por um tubo até um vaso
vertical e cilindrico, onde é pulverizado na forma de pequena gotas (diâmetro em torno de 2 mm), e geralmente na direção contrária é alimentado uma grande vazão de ar ou vapor quente com energia suficiente para completa vaporização do líquido, em menos de 30 s (Perry & Green, 1999).
Terebintina: é o destilado obtido de resina de pinheiros, sendo geralmente composto de
terpenos, principalmnete de α-pineno e β-pineno. Tococromanóis: consistem principalmente de tocoferóis (α, β, δ, γ) e tocotrienóis (α, β, δ,
γ), consistindo de um anel cromano e uma longa cadeia saturada fitil no caso de tocoferóis, enquanto os tocotrienóis têm uma cadeia com insaturações. Os quatro isômeros (α, β, δ, γ) diferem apenas no número e na posição dos grupos metila (figura 57, Güçlü-Üstündag & Temelli, 2004).
α- R1 = CH3, R2 = CH3
β- R1 = H, R2 = CH3
γ- R1 = CH3, R2 = H
δ- R1 = H, R2 = H
Figura 57 - Tococromanóis: (A) Tocoferóis, (B) Tocotrienóis Torularodina: um dos carotenóides produzidos pela levedura Rhodotorula glutinis, sendo
um derivado carboxilado do toruleno (Figura 58).
Figura 58 – Toruleno (R = CH3) e Torularodina (R = COOH)
Xeroftalmia: é uma doença caracterizada pela não produção de lágrimas e por dificuldades
de visão, principalmente durante a noite.
102
APÊNDICE
Cinética de hidrólise enzimática do óleo bruto de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde os
tubos estão na seguinte seqüência temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h
Cinética de hidrólise enzimática do óleo refinado de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde
os tubos estão na seguinte seqüência temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h