04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan1
Kromatografi : GC dan HPLC
Kimia Analitik
Semester Genap 2012/2013
Esti Widowati,S.Si.,MP
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan2
Gas Chromatography Basics
Gas Liquid Chromatography (GLC)Gas Solid Chromatography (GSC)Mobile phase does not interact with analyteSeparation occurs by interaction of analyte
differentially w/liquid stationary phase and temperature
GC preferred method, only applicable to volatile substances derivatization
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan3
Aspek-aspek percobaan GLC
Gas Pembawa (pengemban/pengangkut) dan Pengatur Aliran
Sistem Injeksi Sampel Jenis-jenis Detektor : - Konduktivitas Termal - Pengionan Nyala Karakteristik Detektor : - Detektor Integral
- Detektor Diferensial - Kepekaan - Stabilitas - Kelinieran - Keserbagunaan - Waktu Respons Kolom : - Kolom Isian
- Kolom Kapiler - Pemilihan Fasa Cair
Materials
Microliter syringe Capillary tube A tank of He/N gas
Depending on the instrument used Vaporization chamber Oven Detector Electric/chart recorder Integrators (if available)
04/10/234 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan5
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan6
Gas pembawa
Gas yang telah digunakan dalam GLC : Hidrogen, helium, nitrogen, argon, karbon dioksida, dan uap air.
Gas pembawa yang cocok bergantung pada karakteristik detektor tersebut.
Gas hidrogen dan helium digunakan pada detektor konduktivitas termal sedangkan nitrogen digunakan pada detektor pengionan nyala.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan7
Carrier Gas Supply
Must be at a constant flow rate so that retention times and retention volumes may be equated
Choice of detector will often Dictate the gases that
are used, need to be inert Ex. FID used H2, air, and He
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan8
Sistem pengambilan sampel
Sampel-sampel cair : diinjeksikan melalui suatu karet septum dengan memakai suntikan syringe.
Sampel-sampel gas : diinjeksikan atau dimasukkan dengan memakai bermacam-macam alat pengambilan sampel gas yang dirancang untuk kromatograf komersial
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan9
Injection Port
Heated so sample virtually instantly turns into a vapor as sample plug goes onto column
Septum Split/ Splitless
Want to reproducibly get in and get out Sample focus
Gas Chromatography Inject sample Control temperatures to
vaporize sample Mix with carrier gas Enters column
04/10/2310 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan11
Flow rate Measurement
Why is a known flow rate critical?
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan12
Kolom
Kolom Kapiler - Merupakan tabung yang panjang dan tipis dari kaca atau bahan lainnya seperti baja tahan karat. - Hanya dapat menangani sampel-sampel yang sangat kecil, dan penggunaannya secara luas menunggu pengembangan detektor yang sangat sensitif.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan13
Kolom IsianFasa stasioner dalam GLC adalah cairan, tetapi cairan itu tidak boleh dibiarkan bergerak-gerak di dalam tabung.
Cairan tersebut harus diimobilisasi, biasanya dalam bentuk suatu lapisan tipis dengan luas permukaan besar.
Ini paling lazim dilakukan dengan mengimpregnasi suatu bahan padat dengan fase cair kolom diisi.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan14
Pemilihan fasa cair
- Fasa cair stasioner harus dipilih dengan mempertimbangkan masalah pemisahan tertentu.
- Fasa cair harus stabil secara termal pada temperatur kolom (kecuali dalam kasus-kasus khusus), tidak bereaksi secara kimia dengan komponen-komponen sampel, memiliki daya pelarut yang cukup untuk sampel.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan15
GC Columns
Capillary:
- have i.d. <1mm
- have wide unrestricted flow through center and inner surface is coated with liquid stationary phase
Variety of functional groups have been blended into polysiloxane chain to provide different polarity and selectivity
GC Procedurecolumn
Packed columns 1.5 – 10 m long 2-4 mm diameter Glass, stainless steel Solid packing
Capillary columns 25-60 m long Less 1 mm diameter
04/10/2316 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan17
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan18
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan19
HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-OH
polyethylene glycol
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan20
Karakteristik Detektor
Detektor Integral
Memberikan suatu pengukuran setiap saat dari jumlah total bahan yang dielusi yang telah melewatinya sampai waktu itu.
Detektor Diferensial
Menghasilkan kromatogram familiar yang terdiri dari puncak-puncak dan bukan langkah-langkah. Dibagi menjadi - detektor yang mengukur konsentrasi zat terlarut dengan memakai beberapa sifat fisika dari aliran gas buangan
- detektor yang merespons secara langsung zat terlarut dengan demikian berarti mengukur laju alir massanya.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan21
Kromatogram yang diperoleh dengan detektor Integral
Kromatogram yang diperoleh dengan detektor diferensial
Detector
Flame ionization detector Destructive H and air is mixed with
sample Ignited Collector electrode
Thermal conductivity detector Universal Nondestructive
Non-selective vs selective detectors
04/10/2322 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan23
Kepekaan detektor menunjukkan suatu batasan yang paling penting pada jumlah zat terlarut yang paling kecil yang dapat ditentukan dengan GLC
Stabilitas
Garis dasar suatu kromatogram dimaksudkan untuk fluktuasi jangka pendek dari suatu sifat yang sangat acak yang disebut noise.
Noise dapat dihubungkan dengan kepekaan, tingkat noise dan batas deteksi.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan24
Keserbagunaan Waktu Respons
Waktu respons keseluruhan untuk suatu kromatograf adalah fungsi bukan hanya dari detektor itu sendiri, tetapi juga kelembaman komponen-komponen lain. Misalnya perekam.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan25
Jenis-jenis detektor
Detektor Konduktivitas Termal
- Detektor yang banyak digunakan untuk GLC. Alat ini mengandung : filamen logam yang dipanaskan maupun suatu termistor.
- Gas pembawanya adalah hidrogen
dan helium
- Detektor ini relatif sederhana,
tidak mahal, memiliki kepekaan
yang cukup bagi banyak kegunaan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan26
Detektor Pengionan Nyala
Prinsip dasar :
1. Energi kalor dalam hidrogen menyebabkan banyak molekul untuk mengionisasi
2. Gas efluen dari kolom dicampur dengan hidrogen dan dibakar pada ujung jet logam dalam udara berlebih.
3. Potensial diberikan antara jet dan elektroda kedua yang bertempat di atas atau sekitar nyala itu.
4. Ketika ion-ion dibentuk dalam nyala, ruang gas antara kedua elektroda menjadi lebih konduktif, dan arus yang meningkat mengalir dalam sirkuit.
5. Arus melewati resistor, tegangan terbentuk yang dikuatkan untuk menghasilkan isyarat yang diterima perekam.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan27
Gambar Detektor Pengionan Nyala
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan28
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan29
Temperature
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan30
Grafik isotermal
Standards for GC
Calibration – typically preformed with a known volatile compound/mixture
Attenuation – controlling the height of the peaks.
04/10/2331 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan32
Koefisien distribusiSuatu tetapan tanpa dimensi, K yang
diperoleh dari hukum henry dengan menggantikan tekanan parsial dan fraksi mol suatu zat terlarut dengan dua suku konsentrasi yang sama satuannya.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan33
Kesetimbangan dalam perpindahan massa
Suatu faktor pelebaran pita dalam kromatografi yang disebakan oleh terhingganya waktu yang diperlukan oleh suatu zat terlarut untuk keseimbangan
Dapat dituliskan dari hukum Henry
Cl=KCg .... (1)
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan34
Resolusi
Disebut separasiDua zat terlarut yang didasarkan pada waktu-
waktu retensi dan lebar pita
Results
Retention time (Rt)• The time required for the compound to
pass through the column
• Rt is a characteristic value and independent of the presence of any other compound
04/10/2335 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
Peak A
Peak B
Speed of the chart paper is 2 cm per second
Calculate Rt
04/10/2336 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan37
Penerapan GLC
Identifikasi Senyawa Keserbagunaan GLC Pirolisis Kromatografi Gas Analisis Kuantitatif
Bergantung pada hubungan antara jumlah suatu zat terlarut dan ukuran dari pita elusi yang
dihasilkan. Analisis Kualitatif
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan38
Analisa Kualitatif Dasarnya adalah waktu retensi atau
volume retensi suatu senyawa. Membandingkan t atau V senyawa dalam
sampel yang dianalisis dengan t atau V suatu senyawa standar (yang telah diketahui)
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan39
Analisis Kuantitatif Metode pengukuran tinggi puncak
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram tersebut.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan40
Metode pengukuran luas puncakDapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu :
Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain menggunakan rumus :
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan41
Results
An easy way to calculate the area under the curve without integral calculus is to measure the height and the width at half of the height
04/10/2342 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
Calculate Area
Peak A
Peak B
04/10/2343 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
Percentage of Compounds
A percentage can be calculated by dividing the area of the peak by the total area and multiplying by 100%
04/10/2344 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
Ratio
With the area’s, a ratio can be calculated
A ratio of 1.88:1 of compound B to compound A
04/10/2345 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan46
Metode gunting dan timbangKromatogram yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya, kemudian guntingan-guntingan kertas kromatogram ini ditimbang. Berat dari masing-masing guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan47
Metode IntegratorIntegrator adalah peralatan elektronik yang sering dijumpai pada peralatan kromatografi yang modern. Alat ini akan mengubah tanda-tanda listrik dari detektor menjadi suatu gambaran kromatogram sekaligus menghitung luas kromatogram yang dibentuk secara elektronik.
Results
Quantitative measurement• Two Type of Peaks
• Asymmetric peak • Cut the area under the peak out of the read
out and mass the weight. For this to be accurate the GC must be calibrated.
• Symmetric peak• Measure the height and the width at half of
the height
04/10/2348 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
Forensic Analysis using Gas Chromatography Determination of explosives
If a forensic scientist can identify the type of explosive then he/she could possibly identify the source
Ammonium nitrate Water analysis
04/10/2349 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
Speed Resolution Qualitative analysis Quantitative analysis Sensitivity Simplicity Inexpensive
04/10/2350 S1-Ilmu dan Teknologi Pangan
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan51
H P
igh
erformance
L iquid
C hromatography
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan52
H P
igh
ressure
L iquid
C hromatography
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan53
H P
igh
riced
L iquid
C hromatography
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan54
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan55
Partitioning
Separation is based on the analyte’s relative solubility between two liquid phases
Stationary PhaseMobile Phase
Solvent Bonded Phase
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan56
HPLC - Modes
Normal Phase.- Polar stationary phase and non-polar solvent.
• Reverse Phase.- Non-polar stationary phase and a polar solvent.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan57
Common Reverse Phase Solvents
Methanol CH3OH
• Acetonitrile CH3CN
• Tetrahydrofuran
• Water H2O
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan58
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Peralatan HPLC secara prinsip terdiri dari : Tempat pelarut Pompa Tempat injeksi sampel Kolom Detektor Rekorder
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan59
04/10/2304/10/23 S1-Ilmu dan Teknologi PanganS1-Ilmu dan Teknologi Pangan 6060
InstrumentationInstrumentation
Pump
Injector
ColumnDetector
Mobile Phases
Gradient Controller
•
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan61
1. Fasa mobile (pelarut)pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing untuk mengeluarkan gas terlarut yang tidak diinginkan.2. Sistem pompaada dua jenis pompa, yang mendasari pemakaiannya yaitu : tekanan tetap dan volume tetap.3. Flow controller (pengendali aliran)untuk menstabilkan aliran fasa mobile akibat adanya perubahan tekanan gas, temperatur dan viskositas.4. KolomTidak memerlukan temperatur yang tinggi, karena sifat ikatan kimia terhadap fasa stasioner sangat sensitif terhadap temperatur yang tinggi.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan62
5. Detektorkarakteristik detektor untuk HPLC- sensivitasnya tinggi- respon yang menyeluruh terhadap sampel- tidak meruska sampel- tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan aliran fasa mobile- dapat beroperasi secara terus menerus.
6. RekorderMengeluarkan output berupa kromatogram.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan63
Columns
• Analytical - Performs the separation.
Solid Support - Backbone for bonded phases. Usually 10µ, 5µ or 3µ silica or polymeric particles.
Bonded Phases - Functional groups firmly linked (chemically bound) to the solid support. Extremely stable Reproducible
Guard - Protects the analytical column: Particles Interferences Prolongs the life of the analytical column
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan64
Bonded Phases
C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3
•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN
• C-18C-18 Octadecyl SilylOctadecyl Silyl -Si-(CH -Si-(CH22))1717--
CHCH33
•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan65
Detectors
UVSingle wavelength (filter) [610, 8330]Variable wavelength (monochromator) [8316,
8325]Multiple wavelengths (PDA) [555]
Fluorescence [610] Electrochemical [605] Mass Spectrometric [8325]
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan66
Chromatograms
Restek® ULTRA C-18 and CN Columns (250mm x 4.6mm, 5µ),
Mobile Phase: (1:1 Methanol:Water), 1.5 mL/min.
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan67
Chromatograms
Supelcosil LC-PAH Columns. A BConditions: A: 150mm x 4.6mm, 5µ.
Flow Rate: 1.5 mL/min
Conditions: B: 50mm x 4.6mm, 3µ.
Flow Rate: 3.0 mL/min
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan68
Keuntungan HPLC
CepatResolusiSensitivitas detektorKolom yang dapat digunakan kembali Ideal untuk zat bermolekul besar dan
berionikMudah rekoveri sampel
04/10/23S1-Ilmu dan Teknologi Pangan69
Pertanyaan Apa perbedaan adsorbsi pada kromatografi dan
spektrofotometri ? Apa fase diam dari GLC ? Kapan menggunakan GLC dan HPLC ? Menurut anda, mana yang lebih unggul
kromatografi atau spektrofotometri ? Pada fase normal dan fase terbalik, bagaimana
kondisi analit ? Bagaimana pengaruh diameter kolom dan flow
rate pada kromatogram ?