KROMATOGRAFI KOLOM

KROMATOGRAFI KOLOM

Pertemuan ke-3Kimia Analisis Instrumen

Definisi Umum• Kromatografi kolom merupakan salah satu cara

pemisahan dimana fase diam ditempatkan dalam suatu matriks penyangga khusus berbentuk silinder/ kolom.

• Fase diam berupa zat padat yang ditempatkan dalam suatu kolom atau cairan yang terserap (teradsorpsi) sebagai lapisan tipis pada permukaan butiran halus zat padat pendukung (solid support material).

• Perbedan bentuk/ukuran, polaritas, densitas, afinitas dan gaya interaksi dari setiap komponen menyebabkan terjadinya perbedaan kecepatan migrasi

Jenis Fase diam

Dalam kolom kromatografi adsorpsi, setiap komponen analit mengalami interaksi yang spesifik dengan fase diam. Hal tersebut sangat tergantung pada sifat alamiah, bentuk, ukuran, afinitas dan polaritas dari material adsorben tersebut.

PROSES PEMISAHAN• Mikhail Tswett (1906) separated six pigments in a pigment extraction from

leaves. He made a CaCO3 packed glass column as the stationary phase. CaCO3 column is a solid adsorbent. Mobile phase used was petroleum ether.

Cara penyimpanan fase diam

• disimpan dalam bentuk serbuk kering atau butiran-butiran halus.

• ditempatkan dalam suatu wadah berisi larutan buffer atau dalam pelarut organik.

• ditempatkan dlm tabung silinder/kolom yang sudah dijenuhkan dengan pelarut dan ditambahkan anti mikroba (ex. Natrium Azida)

Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan

• sifat alamiah, bentuk & ukuran fase diam

• afinitas dan polaritas material adsorben

• Keseragaman ukuran fase diam

• Jenis, komposisi dan polaritas fase gerak

• pH, suhu dan zat pengotor.

A + B + C O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O

O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O

Sampl e (A+ B+ C)

Col umn

Sol i d Part i cl es(packi ng mater i al - st at i onary phase)

El uant ( el uate)

D IA G R A M O F SI MPLE LI Q U ID CO LU MN CH R O MATO G R A PH Y

A

B

C

Sol vent ( mobi l e or movi ng phase)

4 jenis kromatografi cair berdasarkan jenis fase diam

• Liquid/Solid Chromatography (adsorption chromatography)

A. Normal Phase LSC

B. Reverse Phase LSC

• Liquid/Liquid Chromatography (partition chromatography)

A. Normal Phase LLC

B. Reverse Phase LLC

• Ion Exchange Chromatography

• Gel Permeation Chromatography (exclusion chromatography)

Kelebihan dan kekurangan

Kelebihan MURAH SIMPLE BAIK UNTUK ANALISA KUALITATIF/PREPARATIF

DAPAT DIGUNAKAN UNTUK SKALA BESAR

Kelemahan

LAMBAT RESOLUSI RENDAH

TIDAK KUANTITATIF TIDAK REPRODUCIBLE

LIQUID SOLID CHROMATOGRAPHY (Kromatografi cair padat)

• Mekanisme Pemisahan KCP : perbedaan kemampuan adsorpsi analit oleh fase diam pada sisi aktif permukaan (contoh : silika gel)

Si - O - H

Normal phase LS Reverse phase LS

Silica Gel

Contoh KCP fase normal

Si - OH

HEXANE

OH

C-CH3

CH3

CH3- CCH3

CH3

OH

OH

CH3

CH3

WATER-SOLUBLE VITAMINS

1. Niacinamide 2. Pyridoxine

N

CONH2

N

CH2OHCH2OH

HO

H3C

3. Riboflavin

N

NNH

NCH2

HOCHHOCHHOCHCH2OH

O

OH3C

H3C

ClN

S

N

NH3C

CH2

NH2

CH3

CH2CH2OH

4. Thiamin

LIQUID-LIQUID CHROMATOGRAPHY (Kromatografi Cair-cair)

• The stationary solid surface is coated with a 2nd liquid (the Stationary Phase) which is immiscible in the solvent (Mobile) phase

ODPN(oxydipropionylnitrile)

Normal Phase LLC Reverse Phase LLC

NCCH3CH2OCH2CH2CN(Normal)CH3(CH2)16 CH3 (Reverse)

Kromatografi penukar ion

• Kromatografi penukar ion adalah salah satu bentuk kromatografi adsorpsi.

• didasarkan pada interaksi elektrostatik reversible antara komponen analit dengan fase diam yang berbeda muatan.

• Kromatografi penukar ion menggunakan mekanisme pertukaran ion untuk memisahkan komponen analit.

• dua tipe KPI berdasarkan jenis fase diamnya yaitu resin penukar kation dan resin penukar anion.

Mekanisme pemisahan KPI

Karakter Resin Penukar Ion• Resin penukar ion dibuat dari suatu bahan yang tidak larut, membentuk

matriks tiga dimensi dan secara kimia mengandung suatu gugus bermuatan yang terikat pada permuakaan matriks tersebut.

• Resin yang mengandung gugus bermuatan negative disebut resin penukar kation sedangkan resin yang mengandung gugus bermuatan positif disebut resin penukar anion

Anion exchangers Functional groupdiethyl-aminoethyl (DEAE) -OCH2CH2N+H(CH2CH3)2

quaternary aminoethyl (QAE) -OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

quaternary ammonium (Q) -CH2N+(CH3)3

Cation exchangers Functional groupcarboxymethyl (CM) -OCH2COO-

sulfopropyl (SP) -CH2CH2CH2SO3-

methylsulfonate (S) -CH2SO3-

Beberapa tipe resin penukar ion

Faktor-faktor penentu pemisahan KPI

• Pemilihan resin (pahami sifat dan karakteristik molekul yang akan dipisahkan).

• Kapasitas pengikatan ion pada resin (afinitas)• Pengunaan range pH untuk menghindari denaturasi dan

pengendapan (isoelektrik)• Pemilihan Buffer : pH untuk larutan buffer bergantung

pada (1) stabilitas makromolekul yang akan dipisahkan dan (2) kekuatan ionik dari larutan buffer agar tidak terjadi kompetsisi antar komponen analit dengan larutan buffernya.

Penyiapan Resin Penukar Ion• Baca instruksi dan cara preparasi matriks kolom secara

mendetail yang ada dalam catalog/manual.

• Hindari kesalahan preparasi resin penukar ion pada saat pertama kali akan digunakan

• Aktifasi gugus fungsi ionik (asam/basa)

• Pencucian dan penyaringan (aquades)

• Pemisahan komponen ion logam/pengotor (EDTA)

• Penyimpanan dalam larutan buffer.

• Penmbahan zat antimikroba (bentuk cair)

Contoh aplikasi pemisahan KPI• Pemisahan asam amino• Pemisahan protein

SO3-

SO3-

Na+

COO-

H3N+

Na+

COOHH3N

+

pH2

pH4.5

Ion-exchange Resin

PEMISAHAN PROTEIN DENGAN KPI

SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY(KROMATOGRAFI GEL FILTRASI)

• Kromatografi gel filtrasi (sering disebut kromatografi eksklusi atau gel permeation chromatography) lebih merujuk kepada perbedaan sifat fisik (ukuran/bobot molekul) dari komponen analit.

• Pemisahan yang terjadi disebabkan oleh perbedaan bentuk dan ukuran molekul (BM) dari setiap komponen analit yang terdapat dalam suatu campuran.

• Teknik kromatografi gel filtrasi mampu memisahkan molekul dari ukuran 100 Da hingga 150.000 kDa.

Prinsip Pemisahan KGF• Pengamatan secara mikroskopis terhadap partikel fase diam yang

digunakan dalam gel filtrasi memiliki pola yang mirip dengan spon pembersih.

• Larutan yang terdiri dari campuran analit dengan berbagai ukuran BM dan fase geraknya dilewatkan kedalam kolom yang mengandung partikel berpori tersebut.

Komponen dengan ukuran molekul yang lebih besar dari ukuran pori tidak mampu terserap ke bagian dalam fase diam sehingga akan terelusi lebih cepat, Sebaliknya, komponen yang ukurannya lebih kecil dari pori-pori fase diam akan masuk dan terdifusi di dalam matriks fase diam sehingga waktu elusinya semakin lama.

Mekanisme pemisahan KGF

Beberapa istilah dalam kromatografi gel filtrasi

• Limit Ekslusi : ukuran dari massa molekul terkecil dari suatu komponen analit yang tidak mampu berdifusi ke dalam pori-pori fase diam. Misalnya, limit ekslusi dari Sephadex G-50 adalah 30.000 Da.

• Fractional range : Sephadex G-50 memiliki range pemisahan antara 1500 – 30.000 Da. Komponen yang masuk dalam range ini akan terpisah dengan baik dalam suatu fraksifraksi pemisahan yang linier.

• Water regain and bed volume : Berat air yang digunakan untuk melarutkan 1 g gel kering dikenal dengan water regain. Untuk G-50, nilainya adalah 5.0 + 0.3 g. Sedangkan bed volume merujuk pada jumlah volume akhir ketika 1 g gel kering dilarutkan dalam air.

• Gel particle shape and size : Idealnya partikel gel harus memiliki ukuran dan bentuk yang seragam dengan densitas pori-pori yang relative tinggi. Ukuran partikel pori biasanya ditulis dalam satuan mesh atau diameter pori (m).

• Elution volume : ukuran volume larutan buffer yang digunakan untuk mengelusi komponen analit hingga keluar dri kolom.

Karakteristik media gel filtrasi

Aplikasi kromatografi gel filtrasi• Desalting dan pemurnian : pemisahan garam-garam anorganik,

pelarut organik dan mineral-mineral kecil dalam purifikasi makromolekul (protein/asam nukleat) dapat dilakukan dengan teknik yang sederhana, cepat dan ekonomis.

• Penentuan BM : Volume elusi untuk beberapa komponen analit dalam suatu campuran dapat ditentukan secara proporsional dan nilainya berbanding lurus dengan ukuran molekul.

• Untuk menetukan nilai BM suatu senyawa, biasanya digunakan molekul standar sebagai pembanding lalu dibuat kurva kalibrasi dengan memetakan log Mi (BM) dengan volume elusi.

KROMATOGRAFI AFINITAS• Kromatografi kolom yang digunakan untuk pemisahan

molekul yang spesifik.• Interaksi spesifik ligan-molekul target mirip dengan interaksi

spesifik enzim substrat/antibodi-antigen.

Principle of Affinity Chromatography• Inject a sample into an initially equilibrated affinity chromatography

column(AFpak).• Only the substances with affinity for the ligand are retained in the column.• Other substances with no affinity for the ligand are eluted from the

column.• The substances retained in the column can be eluted from the column by

changing pH or salt or organic solvent concentration of the eluent.

Jenis Ligan dan Aplikasi

Product code

Product name Ligand Applications

F7118954F7118945F7118946F7113050F7118959

AFpak ADS-894 AFpak AHR-894 AFpak APA-894 AFpak APG-894 AFpak AWG-894

Dextran sulfateHeparinProtein AProtein GWheat germ agglutinin (WGA)

Lipoproteins, blood coagulation factorsLipoproteins, blood coagulation factorsHuman IgG, immune complexesHuman IgG, immune complexesGlycoproteins, polysaccharides

F7118964 AFpak ACH-494 Choline oxydase, acetylcholine esterase

Choline, acetylcholine