07.04.2014 1 HPLC Litt om Hva, Hvordan Vannringens Seminar, 4.4.2014, Molde HPLC Rudolf Schmid Rudolf Schmid, Institutt for kjemi NTNU, Norges teknisk‐naturvitenskapelige universitet 2 HPLC : •High Pressure Liquid Chromatography (historisk) • High Performance Liquid Chromatography (korrekt i dag) •High Price Liquid Chromatography (av og til korrekt også) Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid HPLC : på Norsk (bokmål) de facto: ca. Høytoppløsende (instrumentell) kolonne‐væskekromatografi
24
Embed
HPLC-foredr-Molde-Vannringen 20140403 fin p · 2015-03-24 · HPLC Litt om Hva, Hvordan ... -"normal fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = polar jfr. Tsvett mobil fase (MF)
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
07.04.2014
1
HPLCLitt om Hva, Hvordan
Vannringens Seminar, 4.4.2014, Molde HPLC Rudolf Schmid
Rudolf Schmid, Institutt for kjemi NTNU, Norges teknisk‐naturvitenskapelige universitet
2
HPLC : • High Pressure Liquid Chromatography (historisk)
• High Performance Liquid Chromatography (korrekt i dag)
• High Price Liquid Chromatography (av og til korrekt også)
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
HPLC : på Norsk (bokmål) de facto:
ca. Høytoppløsende (instrumentell) kolonne‐væskekromatografi
07.04.2014
2
3
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
Definisjon : IUPAC (1993) :
"Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) moves in a definite direction. "
International Union of Pure and Applied Chemistry, Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993). Pure & Appl. Chem. 65, 819 (1993)
" Kromatografi er en fysikalsk separasjonsmetode der komponentene som skal separeres fordeles mellom to faser, hvorav den ene er stillestående (den stasjonære fasen) mens den andre forflytter seg i en bestemt retning (den mobile fasen). "
(Uautorisert norsk oversettelse v. Rudolf Schmid, 2008)
4
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
• Kromatografi: barn av det 20. århundre
• Omkring 1905: Teknikk og navn introdusert ved Michail Semenovitsj Tsvett (1872-1919, russisk botanikker).
• Tswett systematisk brukte adsorpsjons-kolonne-kromatografi til analyse/karakterisering av plantepigment-ekstrakter.
mobil fase (MF) = upolar"separerer etter polaritet"
- "omvendt fase"-kromatografi: stasjonær fase (SF) = upolarmobil fase (MF) = polar
"separerer etter hydrofobisitet"
10
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
• Den mobile fasen er en væske !!
• … de fleste separasjonsmekanismer er i bruk, der
prøve-komponenter separeres v.h.a.
• Adsorpsjon (Adsorption, LSC),
• Fordeling (Partition, LLC),
• Ionebytting (Ion-exchange, IEC),
• Eksklusjon (Size exclusion, SEC),
• de viktigste, pluss litt til
Valget bestemmes av prøven - separasjonsproblemet:
07.04.2014
6
11
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
• Adsorpsjon (Adsorption) og fordeling (Partition), finnes
- med Normal fase (Normal phase = NP ) og - med Omvendt fase (Reverse(d) phase = RP )
Kontakten med stasjonærfasen (= SF) er ved ….
Fordeling, gjennom ABsorpsjon Ved adsorpsjon gjennom ADsorpsjon
Fra: James M. Miller "Chromatography, Concepts & Contrasts" , Wiley (2005 )
12
Et konstruert (?) eksempel • Takker Youtube.com , og Phenomenex (video clip produsent)• http://www.youtube.com/watch?v=mPO7Tv2mIJU
Hoste- og forkjølelses-medisin analysert ved HPLC:
1. chlorpheniramine maleate(antihistamin)
2. aspirin (smertedempende)
3. dextromethorphan HBR (hostedempende)
07.04.2014
7
13
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
Grunnleggende : 2 hovedfaktorer for vellykket separasjon:
• (Forskjell i) vandrings-lengde/-hastighet /-tid av analyttene:
(forskjell i) retensjon
• Hvor samlet (eller hvor spredd) analytten er etter separasjonen:
sonespredning
• Sammen beskriver de "oppløsningsevnen" for separasjonen av to topper.
14
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
Kolonne-kromatogram
Separasjon alene(viser kun retensjon, antyder
"separasjonspotensialet")
Separasjon med sonespredning
(viser faktisk mulig oppløsning / separasjon)
Typisk for reelle topper (med sonespredning): Bredden øker med økende retensjonstid (ved konstante analysebetingelser)
07.04.2014
8
15
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
• (Forskjell i) vandrings-lengde / hastighet /-tid av analytter: retensjon - utrykkes som :
• retensjonstid tR , • som retensjonsvolum VR , eller som • retensjonsfaktor k (analytt-eluering uavh. av hastighet & dim.; målt i forh.t. MF-"eluering")
• Hvor samlet (eller hvor spredd) analytter er etter separasjonen: sonespredning - måler spredning (som toppbredde) i forhold til retensjonen
• Som 'platehøyde', H (= prop. (bredde/ret.-tid)2 , eller
• Som 'platetall', N (= prop. (ret.-tid/bredde)2 )
• Samlet beskriver de "oppløsningsevnen" i en separasjon, RS (eng.: Resolution):numerisk:
RS = ∆tR / ½(wb,A+ wb,B) = toppavstand delt med toppbredde (gjennomsnitt)
i eksempelet over: RS = ca. 2 N.B.: ang. RS og platetall:
16
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
• For god oppløsning kan vi :
• Øke separasjonen for analyttene -mest mulig ulike tR, VR, k
Tiltak: endring av analyttenes fordeling mellom MF og SF ("kjemiske endringer" (mest))
• Reduseres sonespredningen (høyest mulig N, lavest mulig H)
Tiltak: endring av stoffspredningen under elueringen (fysiske parametere i kolonnen (mest))
For øvrig:Oppløsningen RS øker med N½ , d.v.s. det trengs 4 x større N for å doble RS .
↑2 topper "basislinje-separert"
(ved RS = 1,5 )
07.04.2014
9
17
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
• Krav om god oppløsning viktigere når :
• Topper har ulik størrelse Vanskelig identifisere og (særlig kvantifisere den minste av toppene
Haledannelse, 'tailing' 'Fronting'
• Topper er asymmetriske
• haledannelse - "tailing" el.
• "fronting"
18
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
• Sonespredning (og asymmetri) er alltid uønsket
Smalere topper gir
• større sikkerhet ved identifisering,
• Enklere, sikrere kvantifisering
• mindre fare for topp-overlapp
• Å bekjempe spredning koster innsats: kunnskap og 'cash'
07.04.2014
10
19
HPLC : High Performance / High Pressure LC
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
Viktigste parametere som har effekt på sonespredning:
Diameter av SF-partiklene: mindre spredning med mindre partikler.
Mobilfase-hastighet (lineær hastighet), u • avhengighet jfr. van Deemter kurver (rød)
Diffusjonskonstanten, D, av analytten i MF og i SF : 2 sprikende effekter, hhv. ved høy og ved lav hastighet.(ofte lite å gjøre med D)
20
HPLC :
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
Balansering mellom 'High Performance' og 'High Pressure', i HPLC :
For HPLC: partikler på 3-5 μm (10 μm "på vei ut")
- HPLC : opptil ca. 350 bar kolonneinngangstrykk.
For UHPLC (Ultra HPLC) : partikler på 1,5 – 2,5 μm- UHPLC: > 1000 bar inngangstrykk, teknisk/praktisk noe mer krevende.
• Diameter av SF-partiklene: Enda en fordel :
• Mindre partikler tillater høyere elueringshastigheter
Løsningsmiddel: Valget sterkt avhengig av separasjonsproblemet: prøve & kolonne
Generelle ønskede egenskaper: • Rene: partikkelfrie, ikke forstyrrende i detektoren• Lav viskositet• Miljø- og HMS-messig akseptable• Kjemisk inert under analysebetingelsene • Fri for gass (luft) • Nøyaktig blandet, hvis MF er en blanding. • Riktig pris• Evt. temperert
• Skal levere separasjon med passe (ikke for stor retensjon / retensjonstid / retensjonsvolum).
Kanskje mest brukt : Vann, acetonitril, metanol, ("omvendt fase–løsningsmidler")
Pumpe(r ): avhengig av bruken: (konstant MF (=isokratisk analyse), eller varierende MF (gradient analyse)
Typisk brukt i dag: • ("resiprokerende") stempelpumper (rel. lite slagvolum, mye mindre enn retensjonsvolumet) • sprøytepumper (stort volum i forhold til retensjonsvolm, brukt for små trange kolonner)
Generelle ønskede egenskaper: • Tåler de fleste aktuelle mobilfaser (polar, upolar, sur, basisk, salt)• Presise, driftssikre, pulserer lite • Lett regulerbare / programmerbare • Stort reguleringsområde for pumpehastighet og kan pumpe mot høyt trykk • Lite dødvolum• Riktig pris.• Eventuelt med avgasser / fjerner luft fra MF, og mikser (blander blandinger homogent)
Konstruksjon i rustfritt stål (evt. titan), teflon, PEEK-plast, bl.a.
Injektor: (i dag praktisk alltid en ventil-injektor) • Doserer prøvemengde i en rørstrekning "off-line (en "loop"), • som så svitsjes in i MF-strømmen (som tar med prøven) til kolonna.
Loop-volum kan velges tilpasset analysen. "Lading av loop" Injeksjon til kolonna
i automatiske prøvegivere ("Autosamplere"), er ventilinjektoren innebygget. Den ordner prøve-dosering, -injeksjon og analysestart automatisk, også for lange serier. Ventil-svitsjing skjer som regel elektrisk.
Loopen kan fylles delvis (< 50% av loopen) (volum-kontroll gjennom sprøyta), eller
loppen kan fylles/skylles med prøve (> 200%) (fast volum bestemt av loopens interne volum)
"Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004Filtrering: Systemet tåler ikke partikler: • Filtrering av MF før bruk• Filtrering av prøver før injeksjon • Inntaksfiltre for MF til pumpen (beskyttelse av pumpa),• Ofte in-line filtre mellom injektor og kolonna (evt. erstattet med beskyttelseskolonne).
Partikler av kritisk størrelse kan akkumuleres på kolonna, evt. delvis trenge inn i kolonnepakningen og plugge den igjen over tid (trykkøkning)
Termostatering ("kolonneovn"): I dag ganske vanlig: temperaturkontroll for HPLC-kolonna (f.eks. v. Peltier-elementer). Mest normalt med noe økt temperatur : • Reduserer viskositeten av MF – mindre mottrykk • Kan for noen analytter øke løseligheten i MF • Kan forbedre analysen: reduserer retensjonen (retensjonsfaktoren minker med økende temp.) • Kan forbedre analysen: endret relativ retensjon for analytter ved endret temp.
"Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004Detektor: Skal detektere analyttene : • Finnes som selektive og som generelle/universelle.• Finnes i variert følsomhet (i dag typisk uttrykt v.hj.av deteksjongrense)• Finnes som robuste og mer delikate (f.eks. ikke kompatible med gradient) • Finnes som relativt enkle billige, og som avanserte kostbare (f.eks. MS-detektor)
Andre vanlige HPLC-detektorer: o Brytningsindeks-detektor univ.o Elektrokjemisk e detektorer selekt.o Ledningsevne-det. selekt.o Fluorescens-det. selekt.o Fordampings-lysspredn.-det. univ.o M.fl.
Mest vanlig brukt detektorermed noe selektivitet: Mest brukt / kjent: UV-detektoren: detekterer bare UV-absorberende stoffer.
UV/Vis.-"Photo Diode Array"-detektor for HPLC:Detekterer ved flere λ samtidig, svitjser λ veldig fort, tar opp hele UV-spektrum kontinuerlig.
Detektor: Mer avansert: spektroskopiske detektorer - her spesielt massespektrometri
Gir tilleggs-identifikasjon for kromatografiske topper: karakterisering ved MS-data i tillegg.
MS er mye brukt som detektor i dag fordi ……den er ofte er både selektiv, gir identifikasjonshjelp fra MS data OG har høy følsomhet.
MS kan være ganske/veldig selektiv : • vurdering av selektive masser(-områder) eller • fragmenterings-reaksjoner (masse-overganger , v. MS/MS)
Alternativt: MS kan skanne bred og registrere total-ionestrøm (som er relativ universell deteksjon).
Mest vanlig MS-ioniseringsmetode for HPLC : ESI (elektrospray-ionisering). Mest brukte masseanalysatorer for LC/MS: enkel-kvadrupol (lineær el. ionefelle), trippel-kvadrupol MS/MS, Time-Of-Flight.
Rel. avansert programvare • kontrollerer instrumentet (ønskelig for større nøyaktighet og pålitelighet) og • samler inn, • lagrer og • analyserer data (etter digitalisering av kromatogrammet).
Mulighet for, langt på vei, automatisk kvantifisering av (rutine-) analyseserier.
Viktig med etterkontroll av integrering og kalibreringer m.m.
Ett rør (stål, PEEK) • med SF-pakningsmaterialet inn i• med end-koblinger med sinterplater ("filter-skiver" ,holder pakningsmaterialet på plass) og for tilkobling av ledninger.
Dimensjoner typisk: • Lengde inntil ca. 25-30 cm, men nyere ned til 3-5 cm• Diameter klassisk 4,6 mm i.d. (1/4" o.d.), men nyere ned til 3 - 2,5 mm i.d.• Ekstra-tynne: "micro-bore"-kolonner (ca. 1 mm) og kapillærkolonner (< 0,2-0,5 mm)
Inneholdet: pakningsmaterial:
Kjemisk egenskaper : avhengig av separasjon-mekanisme
Patron-kolonner (Cartridge columns) Sparer penger og ressurser
dyrt kolonne-"innpakkingsmaterial" (spesielt end-koblingene)kan brukes om igjen når pakningsmaterialet blir dårlig (uten å måtte pakke kolonnen om selv).
Forkolonner (Guard columns)plasseres mellom injektor (el. ”in-line”-filter) og hovedkolonna: brukes for å beskytte hovedkolonnen (Den Kostbare) :
Små korte (1 - 3 cm) rel. effektive kolonner med lignende eller lik pakningsmaterial som hovedkolonnen,
som kobles mellom injektoren og (hoved-) kolonnen.
Silika – O – Si(R’)2 – n-C18 H37 (R' = vanligvis methyl)
Popularitet skyldes : • rask ekvilibrering, • gradient-dugandes, • greit (grov-)regulerbar retensjon , • rel. lett forutsigbar retensjon (kan vurderes ut fra analyttens: andel hydrofobisk
overflateareal, eller fra dens vannløselighet). • lite uønsket kraftige interaksjoner med analytter. Viktig ! Silikagel er kjemisk labil i basisk miljø (pH < ca. 5-7) går i oppløsning !!
Eluering med basiske MF må unngås hvis mulig.
Omvendt-fase-silka finnes som "monomer", ”oligomer”, "polymer", "end-capped" (s.n.).
Teoretisk modellerte (del-)strukturforslag for polymere C18-faser (på silikaoverflate, (nederst i figurene), her med litt atypisk mye orden (p.g.a. høy C18-tetthet) i kontakt med organiske MF-komponenter (i fra MF-blandingen med vann). (Pemberton &al. Anal.Chem.(2003), 75, p.3360ff; strukturene baserte på ”Molecular Mechanics”-regninger)
Strukturer av SF (på eksempelet "polymer oktadekyl-silika fase")
SF-lagets sammensetning, og tykkelse, varierer med
type og andel organisk modifikator i den vandige MF,
modifikator som løser seg i/assosierer seg med ”RP-ligand-fasen”,
• Retensjon er sterkt avhengig av ”mengde” organiske substituenter
• RP-ligandens kjedelengde (f.eks. C8, C18, C30) bestemmer også retensjonen, • og litt selektiviteten: • Retensjonen øker med økende kjedelengde (omtrent inntil kjeden er lengre enn de analytten).
• Ulik alkylgruppe-tetthet (bl.a. monomer- vs. polymer-faser) skaper selektivitet m.h.t.stereokjemi: (særlig tydelig for polysyskliske aromater.
• Rest-silanolgruppe-mengde er også medbestemmende for selektiviteten av RP-SF’en.
• Porestørrelsen kan også bestemme om eksklusjonseffekter må vurderes Typisk : 100 Å-porer for normal HPLC (”små” molekyler),
ANALYSIS time : 10 sec (net) / at 90° C ANALYSIS time : 45 sec (net) / at 90° C
1,8 mL/min (t0 = ca. 1,5 s ), gradient‐analyse (ulike gradienter for (a) og (b)), kolonne 50 mm lang, 2,1 mm i. diameter, 1.7 μm partikler
07.04.2014
24
47
Extreme High Resolution LC :Proteomics : E-Coli proteom
• 41,5 timers hour analysis (gradient) !
• Identified: 16.000 peptides and 2.200 proteins in one single analysis - by LC/MS, i.e. with some extra help from mass spectrometry for the identification job in addition to the HPLC separation.
• Using a ”monolithic porous/packed” capillary column for LC : 0,1 mm i. diam., 35 cm long.
"1st dimension" column (x-axis): slow separation (nearly 6 hrs). Separation principle: polar/special interaction (argentation) between silver ions and C-C double bonds (Ag+ on a Cation-Exchanger; separates by number of double bonds, unsaturation)
"2nd dimension" column (y-axis): fast separation (every 1.0 min). Separation principle: Reversed phase LC (non-polar SP; separates according to (non-)polarity; for these TAG analytes: approxi-mately. according to molecular weight/no. of methylene groups (homologous series).
Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid
Example: Comprehensive 2‐D HPLC of triglycerides (TAC, triacylglycerols) :
Fig. 6. Contour plots of corn oil constructed on the basis of the TIC chromatogram. Dots represent peaks detected automatically by the software. (a) Total contour plot. Dots remaining unlabeled correspond to peaks that could not be identified by manual inspection of the MS. Dashed lines refer to the PN, numbers at the bottom to the DB number; (b) expansion of contour plot in (a). First-dimension from 97.5–115 min, second-dimension from 0.84–1.18 min. Lines linking dots indicate peaks that were pooled by the merging algorithm and are considered to originate from the same compound. Numbers after the name of the TAG correspond with the molecular weight of the TAG.
Adapted from: Van der Klift & al, Journ. Chromatography A 1178, 43‐55 (2008)