Transcript
Trichomoniasis'de Parazitolojik Tanı
Trichomoniasis
Dünya Sağlık Örgütü’nün verilerine göre yılda 250 milyondan fazla kişinin infekte olduğu tahmin edilmektedir.
İnfeksiyon sıklıkla vajinit, üretrit ve prostatit’e sebep olmakta aynı zamanda pelvik inflamatuvar hastalık ve tubal infertilite riskini arttırabilmektedir.
Gebelikte; erken doğum ve düşük doğum ağırlıklı bebek.
Servikal kanser, prostat kanseri oluşumunda predispozan etkisi olduğu bildirilmiştir.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda ise T.vaginalis’in özellikle HIV (Human Immunodeficiency Virus) Tip I’in geçişini arttırdığı ileri sürülmektedir.
Direkt Mikroskopi, Kültür, Hücre kültürü, PAP smear, Latex aglütinasyon, Floresan Antikor testi, Boyama Yöntemleri (Gram,
Akridin Oranj vs), ELISA, DNA prob, Xenostrip-Tv (Hızlı Test) PZR İmmunositokimyasal (ICC)
yöntem
T. vaginalis Tanısında Kullanılan Yöntemler
Direkt mikroskopi
(1000 parazit /ml )
kültür pozitif olguların
%60’ ı saptanabilmekte,
(D:%38 ile %82)
Hızlı
ucuz
Kolay
Duyarlılığı düşük
boyama
Giemsa,
May Grünwald ,
Akridin oranj,
leishman,
periodic asid schiff (PAS)
Fontana
Papanicolaou
Hızlı Kolay uygulanır İncelemesi kısa sürer Özel ekipman gerektirir Bekledikçe solar ve kalıcı kayıt kalmaz boya duyarlılık Özgüllük
giemsa 80 98,3
Akridin oranj 100 98
Bu çalışmada: T. vaginalis saptanması için idrardan hazırlanan yayma örnekleri farklı fiksatifler ve boyalar ile boyanmış ve karşılaştırılmış. Papanicolaou boyası ve fiksatif olarak da etanol kalıcı boyamada en iyi olarak yorumlanmış. Direkt bakı ile birlikte boyama yöntemlerinin kullanılması tanıyı kolaylaştırır.
Kültür (%75-96)
TYM CPLM Trichosel besiyeri (BBL) (100 parazit/ml)
Uygun örnek Ekim işlemi Üremenin saptanması HIV pozitif kadınlarda metronidazol tedavisi
sonrası aylarca saptanamayacak düzeyde kalabilir (Gatski et al., 2010; Peterman et al., 2009).
KÜLTÜR
Ekipman, zaman ve deneyim gerektirmektedir (2-7 gün)
Eğer:
Parazit sayısı az ise,
Defektli parazitler varsa,
Parazit kültürde çoğalmıyorsa,
Cansız parazitler,
kültürde saptama olasılığı bulunmamaktadır.
İmmunokromatografik yöntem (ICT) yöntemler
Bu testlerin avantajı,
10 dakika gibi kısa sürede sonuç vermesi,
yüksek sensiviteye sahip olması,
Araştırmada canlı parazitlere ihtiyaç duymaması ve
moleküler inceleme yöntemlerine göre daha ucuz olması olduğu bildirilmektedir.
PZR
Klasik PZR,
TaqMan real-time PZR,
Real-Time Roche LightCycler,
Nested PZR,
Multipleks PZR
Kadın
Erkek
Vajinal yıkama sıvısı
İdrar (sabah ilk)
Arka forniksden pamuklu eküvyonla alınan örnek
Prostat masajı sonrası alınan sekresyon
İdrar (sabah ilk)
Üretral yayma
(pamuklu eküvyonla alınan)
PAP smear örneği (eski ve yeni)
PZR çalışılabilecek örnekler
Ingersoll J, Bythwood T, Abdul-Ali D, Wingood GM, Diclemente RJ, Caliendo AM.Stability of
Trichomonas vaginalis DNA in urine specimens. J Clin Microbiol. 2008 May;46(5):1628-30.
İdrar örneği saklama şartlar? DNA stabilitesi
(gün)
Oda ?s?s?nda saklan?r ise (20-22 o
C) 1
+4 o
C’de saklan?r 3
Becton Dickinson urine preservative
transport (UPT) kit içine ilk 1 saat
içinde aktar?lan örnekler +4 o
C’de
30
T. vaginalis:
izolatlarının yüksek oranda
fenotipik varyasyon göstermesi
nedeniyle
genomik sekanslarında
farklılıklar gösterdiği ve
PZR bazlı tanı yöntemlerinin
geliştirilmesini zorlaştırdığı
bilinmektedir.
PRİMER SEÇİMİ
TV spesifik bölge
Sık tekrar
Seçilen sekansın değişik protozoon
(T. tenax, T. foetus, E. gingivalis, T. burucei, G.lamblia)
mantar (C. albicans), bakteri ve insan genomu ile
karşılaştırılarak farklı bir bölge seçilmektedir.
PRİMERLER
18 S Ribozomal gen bölgesinden seçilen primerler Tv1 5’ TAA TGG CAG AAT CTT TGG AG 3’ Tv2 5’ GAA CTT TAA CCG AAG GAC TTC 3’ TV spesifik 261- bp tekrarlayan bölümünü çoğaltır TVK3 (5’AT TGT CGA ACA TTG GTC TTACCC TC-
3’) TVK7 (5’-TCT GTG CCG TCT TCA AGT ATG C-3’) Bunların en duyarlı primerler olduğu bildirilmiştir. T. vaginalis spesifik genomun 98-bp fragmanı çoğaltır TVA5-1 (AT GTTCTA TCT TTT CAT TGT) TVA6 (GAT CAC CAC CTT AGT TTA CA)
β-tubulin genininden seçilen primerler
(βTUB; βtub1, βtub2 ve βtub3)
BTUB 9, 5’ CAT TGA TAA CGA AGC TCT TTA CGA T 3’
BTUB 2, 5’ GCA TGT TGT GCC GGA CAT AAC CAT 3’
AP65-1VE 2 ADESİN GENİ
“T.V’İN VAGİNAL EPİTELE ADERANSINI DÜZENLEYEN
GEN”
AP65 A, 5’ GAT TCC TCT TCA CAC ACC CAC CAG 3’
AP65 B, 5’ AAT ACG GCC AGC ATC TGT AAC GAC 3’
TV-E650-1
P 1: 5’ GAGTTAGGGTATAATGTTTGATGTG 3’
P 2: 5’ AGAATGTGATAGCGAAATGGG 3’
Ribozomal genler;
primer yapılarını iyi korudukları
Genom içinde çok sayıda tekrar
ettikleri için PZR için iyi bir
hedef bölge olarak tercih
edilmektedir.
β-tubulin genininden seçilen
primerlerin bazı suşları
saptayamadığı bildirilmiştir.
Tv1 ve Tv2 primerlerinin kullanıldığı ilk çalışmada;
PZR Duyarlılık (%)
Özgüllük
(%)
Vajinal örnekler
100 98
İdrar 100 99.7
Mayta H, “18S Ribosomal DNA-Based PCR for Diagnosis of Trichomonas vaginalis” Journal Of
Clınıcal Mıcrobıology, 2000, p. 2683–2687
330 bp
Yöntem Duyarlılık (%) Özgüllük (%)
97.0
97.8
PZR
BTUB 9/2
TVA 5-1/6 69.7 100
Kültür 69.7 100
DM 36.4 99.1
Madıco G, Quınn TC, Rompalo A, Mckee KT., Gaydos CA, Diagnosis of Trichomonas
vaginalis Infection by PCR Using Vaginal Swab Samples, Journal Of Clınıcal Mıcrobıology,
Nov. 1998, P. 3205–3210
“ Vajinal örnek N= 350 ”
Test Duyarlılık
(%)
Özgüllük
(%)
DM 48. 2 100
Xenostip 66.7 100
PZR 100 99
Pillay A. 2004 “Evaluation of Xenostrip-Tv, a Rapid Diagnostic Test for Trichomonas vaginalis
Infection” JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2004, p. 3853–3856
Test (n= 119) Duyarlılık (%95) Özgüllük (%95)
Kültür 43.6 (32.4- 55.3) 100 (91.4-100)
DM 43.6 (32.4- 55.3) 97.6 (87.1-99.9)
Klasik PCR
Vajinal yıkama sıvısı
İdrar
100 (94.6-100)
56.4 (44.7- 67.6)
100 (91.4-100)
97.6 (87.1-99.9)
Real-Time PCR
Vajinal yıkama sıvısı
İdrar
100 (95.4- 100)
76.7 (66.4- 85.2)
82.9 (67.9-92.8)
97.0 (84.2-99.9)
Pillay A, Radebe F, Fehler G, Htun Y, Ballard R C, Comparison of a TaqMan-based real-time
polymerase chain reaction with conventional tests for the detection of Trichomonas vaginalis. Sex
Transm Infect 2007;83:126–129.
Kaynak Primerler Örneğin tipi PZR
Duyarlılık/
Özgüllük
(%)
Riley et al.
(1992)
TR 7 ve 8, TV
A5 ve 6,
TR 5 ve 6, FE 1
ve 2
Kültürden elde
edilen izolatlar
Paces et al.
(1992)
TV-E650-1
Kültürden elde
edilen izolatlar
Kengne et al.
(1994)
TVK 3, 4 ve 7
Kültürden elde
edilen izolatlar
Katiyar and
Edlind (1994)
BTUB 9 ve 2
(betatubulin
geni)
Kültürden elde
edilen izolatlar
Alderete et al.
(1995)
AP651 ve -2
Kültürden elde
edilen izolatlar 100/97.8
Jeremias et al.
(1994)
TVA5 ve -6
Vajinal örnek 91.8/95.2
Heine et al.
(1997)
TVA5 ve -6
Vajinal örnek 100/100
Shaio et al.
(1997)
TV-E650-1
Vajinal örnek 96/98
Madico et al.
(1998)
BTUB 9 ve 2
Vajinal örnek 92.7/92.1
Paterson et al.
(1998
TVA5 ve -6
Tampon örneği 95.8/98.1
van der Schee
et al. (1999)
TVK3 ve -7
Vajinal örnek
idrar 100/97.4
Ryu et al.
(1999)
TV-E650-1
Vajinal örnek 100/96.8
REAL-TİME PZR
Avantajının:
PZR sonrası amplikonlar ile işlem uygulanmaması ve böylece amplikon kontaminasyonunun engellenmesi
2.5 saat gibi kısa bir zaman diliminde tamamlanabildiği
Kültür ve DM’ye karşın duyarlılığının yüksek
Dezavantajı:
İnhibisyonu saptayacak bir internal kontrolün olmaması bu nedenle yalancı negatif sonuçların olabileceği bildirilmektedir
PZR:
Analitik duyarlılıkta 3 paraziti saptadığı
görülmüştür.
Toxoplasma gondii, Leishmania spp,
Plasmodium vivax DNA örnekleri ile
reaksiyona girmedikleri saptanmıştır.
862/ 16 (%1,9) 862 /8 ( % 0,9) DM 862/14 ( %1,6) Kültür 14 izolat metronidazole duyarlı Genotiplendirme ( A, I, E)
Nested PCR
aktin gen bölgesi (1260 ve 1100 bp)
Tv8S (5′-TCTGGAATGGCTGAAGAAGACG-3′) Tv9R (5′-CAGGGTACATCGTATTGGTC-3′),
Tv10S (5′-CAGACACTCGTTATCG-3′) Tv11R (5′-CGGTGAACGATGGATG-3′)
Primer: AP 65
Bu çalışmada ilk kez T. vaginalis tanısında kullanılmak amacı ile test edilmiş ve başarılı olduğu bildirilmiştir.
615 örnekte Prestoplus testi ile MOLBIOL LightMix Kit Trichomonas vaginalis tanısında karşılaştırılmış
Uyumsuz örnekler Qiagen® Microbial DNA qPCR TV
Her iki test benzer sonuçlar vermiş (McNemar p > 0.05).
ICC
1 parazit/ml
HIV pozitif hamilelerde özellikle tercih edilebilir
Asemptomatikleri saptamada daha etkili
Ucuz, pratik ?
Pozitif kontrol Negatif kontrol
HIV + vajinal sekresyon
Her bölgede en azından Üniversite Hastanelerinde
referans merkezleri oluşturulup bu merkezlerde
referans testler çalışılabilir.
Beni dinlediğiniz için Teşekkür Ederim…
top related