Harmat Veronika - Fehérjék működésének vizsgálata krisztallográfiával - Budapest Science Meetup Május

A fehérjék működése, ahogy a krisztallográfus látja

ELTE Kémiai Intézet, Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium

MTA-ELTE Fehérjemodellező Kutatócsoport

Harmat Veronika

http://www.chem.elte.hu/departments/protnmr

Fehérjék röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálata: kémia a biológia mögött

Térszerkezet• Katalitikus mechanizmus• Molekuláris felismerés• Hajlékonyság, rugalmasság• Molekuláris motorok• Mutációk hatása• Gyógyszertervezés

Kémiai Nobel díj 2009 Riboszóma szerkezetvizsgálata V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, A. E. Yonath(több mint 120 szerkezet)30S alegység: ~35000 atom, 50S alegység:~64000 atom

Kémiai Nobel díj 1962 Globuláris fehérjék szerkezetvizsgálata M. F. Perutz, J. C. Kendrew

mioglobin:~1200 atom

Elektronsűrűségitérkép

Fehérjekrisztallográfia: lehetőségek és korlátok

Atomi pozíciókDiffrakciós mintázat

Kristály

Szerkezet-hatás összefüggések

Fehérje oldat

• A vizsgálathoz egykristály előállítása szükséges– Stabil konformációjú fehérjék vizsgálhatók (globuláris fehérjék)

– A konformáció az oldatban és a kristályban általában hasonló

• A kristálybeli elektronsűrűség térbeli és időbeli átlagát kapjuk meg• Időfelbontásos krisztallográfia: fotokémiai reakció vagy a reakció

befagyasztása

Szerin proteázokA fehérjék egy nagy csoportja:

katalizátorok (enzimek)

Kiindulási molekulák

Termék molekulák

Átmeneti állapot

Katalizátorral

Reakcióút

Ene

rgia

Szerin-proteázok:• Fehérjelánc elhasítása• Fontos a működés szabályozása/korlátozása• Katalízis:

A reaktív amonisav: szerin (Ser)

Katalitikus triád Ser-His-Asp

Szubsztrát

Prolil-oligopeptidáz család• Kb. 700 aminosav, két nagy szerkezeti egység: proteáz és propeller domén• Az aktív hely a két domén közötti üregben van

méret szelektivitás, oligopeptidázok (csak rövid, 20-30 aminosav hosszú molekulákat hasítanak)

Funkció: • Neuropeptidek szintjének szabályozása• Inkretinek lebontása – glükóz metabolizmus• Jelentőség a rákgyógyászatban

üreg

Kat. triád

propeller

proteáz

Fülöp et al, Cell 94, 161, 1998

„Csukott” szerkezet

Hogyan jut be a szubsztrát az aktív helyre?

1. Kristályszerkezetek zártak – oldatban kinyílik

Erre vonatkozó vizsgálatok:• Hajlékony rész a két domén határán és N-terminális (MD)• Kristályosítási műtermékben szétnyílt a két domén

pl. prolil oligopeptidáz, acilpeptid hidroláz

Shan et al, PNAS 102, 3599, 2005Fuxreiter et al, Proteins. 60, 504, 2005

Hogyan jut be a szubsztrát az aktív helyre?

2. Eleve van egy bejárat a domének között• Pl. dipeptidil peptidáz IV

Rasmussen et al Nat Struct Biol. 10, 19, 2003

Acilpeptid hidroláz szerkezetvizsgálata

csukott/csukott

Vad típus•Vad típus enzim/termék komplexek

nyitott/csukott

Vad típus•Asp/Ala mutáns•Asp/Asn mutáns

(csak üres szerkezetek)

nyitott/nyitott

Asp/Ala mutáns

(üres szerkezet)

• Szimmetrikus dimer

• A kristályszerkezetek zártak

Eredeti célkitűzés: • A katalitikus triádbeli Asp szerepének felderítése

• Vad típusú, Asp/Asn és Asp/Ala mutánsok összehasonlítása

Harmat et al, J Biol Chem, 286, 1987 2011

A szerkezetek kétállapotú rendszerre utalnak• A domének szerkezete nagyon

hasonlít a különböző szerkezetekben

• A monomerek konformációja független a másik monomer konformációjától

• A nyitott szerkezetek minden esetben egyforma mértékben vannak kinyílva

A szubsztrát bejutása lehetséges

Katalitikusan inaktív konformáció

nyitott

A katalitikus és szelektivitási funkció szétválik

Az aktív hely intakt, a reakció lejátszódhat

A szubsztrát nem tud bejutni az aktív helyhez

csukott

Mi változik a kinyílás során?

Stabil állapotok mozgékony régiókkal:

• A szerkezet kinyílása és a katalitikus hely „szétszerelődése” összefügg:

Ser

A His-hurok és vele kölcsönható hurok kinyíláskor destabilizálódik.

mozgékonymerev

Asp

● csukott szerkezet

His

His

Zárt szerkezetek: az Asp szerepe a katalízisbenAsp/Ala mutáns• Az Asp karboxilát csoportot vízmolekula helyettesíti• Ez a His oldallánc eltolódását okozza• A His – Ser kapcsolat kedvezőtlen a katalízis

szempontjából

Katalizátorként nem működik

● vad típusú szerkezet● propeller

● Ser● His hurok● Asp hurok

Mechanizmus: konformációs szelekció• Csak egyféle nyitott szerkezet• A nyitott szerkezetekben szétszerelődött aktív hely, His hurok átrendeződött• A csukott szerkezet lehet üres, vagy szubsztrát-kötött

Oldatban nyitott-csukott egyensúly, a szubsztrátkötés hatására a csukott állapot stabilizálódik

Együttműködők

ELTE Szerkezeti Kémiaés Biológia Laboratórium

Náray-Szabó Gábor

Karancsiné Menyhárd Dóra

Beke-Somfai Tamás

MTA Enzimológiai Intézet

Polgár László Domokos Klarissza Szeltner ZoltánSzamosi Ilona

MTA Kémiai Kutatóközpont

Palló Anna