A fehérjék működése, ahogy a krisztallográfus látja ELTE Kémiai Intézet, Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium MTA-ELTE Fehérjemodellező Kutatócsoport Harmat Veronika tp://www.chem.elte.hu/departments/protnmr
A fehérjék működése, ahogy a krisztallográfus látja
ELTE Kémiai Intézet, Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium
MTA-ELTE Fehérjemodellező Kutatócsoport
Harmat Veronika
http://www.chem.elte.hu/departments/protnmr
Fehérjék röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálata: kémia a biológia mögött
Térszerkezet• Katalitikus mechanizmus• Molekuláris felismerés• Hajlékonyság, rugalmasság• Molekuláris motorok• Mutációk hatása• Gyógyszertervezés
Kémiai Nobel díj 2009 Riboszóma szerkezetvizsgálata V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, A. E. Yonath(több mint 120 szerkezet)30S alegység: ~35000 atom, 50S alegység:~64000 atom
Kémiai Nobel díj 1962 Globuláris fehérjék szerkezetvizsgálata M. F. Perutz, J. C. Kendrew
mioglobin:~1200 atom
Elektronsűrűségitérkép
Fehérjekrisztallográfia: lehetőségek és korlátok
Atomi pozíciókDiffrakciós mintázat
Kristály
Szerkezet-hatás összefüggések
Fehérje oldat
• A vizsgálathoz egykristály előállítása szükséges– Stabil konformációjú fehérjék vizsgálhatók (globuláris fehérjék)
– A konformáció az oldatban és a kristályban általában hasonló
• A kristálybeli elektronsűrűség térbeli és időbeli átlagát kapjuk meg• Időfelbontásos krisztallográfia: fotokémiai reakció vagy a reakció
befagyasztása
Szerin proteázokA fehérjék egy nagy csoportja:
katalizátorok (enzimek)
Kiindulási molekulák
Termék molekulák
Átmeneti állapot
Katalizátorral
Reakcióút
Ene
rgia
Szerin-proteázok:• Fehérjelánc elhasítása• Fontos a működés szabályozása/korlátozása• Katalízis:
A reaktív amonisav: szerin (Ser)
Katalitikus triád Ser-His-Asp
Szubsztrát
Prolil-oligopeptidáz család• Kb. 700 aminosav, két nagy szerkezeti egység: proteáz és propeller domén• Az aktív hely a két domén közötti üregben van
méret szelektivitás, oligopeptidázok (csak rövid, 20-30 aminosav hosszú molekulákat hasítanak)
Funkció: • Neuropeptidek szintjének szabályozása• Inkretinek lebontása – glükóz metabolizmus• Jelentőség a rákgyógyászatban
üreg
Kat. triád
propeller
proteáz
Fülöp et al, Cell 94, 161, 1998
„Csukott” szerkezet
Hogyan jut be a szubsztrát az aktív helyre?
1. Kristályszerkezetek zártak – oldatban kinyílik
Erre vonatkozó vizsgálatok:• Hajlékony rész a két domén határán és N-terminális (MD)• Kristályosítási műtermékben szétnyílt a két domén
pl. prolil oligopeptidáz, acilpeptid hidroláz
Shan et al, PNAS 102, 3599, 2005Fuxreiter et al, Proteins. 60, 504, 2005
Hogyan jut be a szubsztrát az aktív helyre?
2. Eleve van egy bejárat a domének között• Pl. dipeptidil peptidáz IV
Rasmussen et al Nat Struct Biol. 10, 19, 2003
Acilpeptid hidroláz szerkezetvizsgálata
csukott/csukott
Vad típus•Vad típus enzim/termék komplexek
nyitott/csukott
Vad típus•Asp/Ala mutáns•Asp/Asn mutáns
(csak üres szerkezetek)
nyitott/nyitott
Asp/Ala mutáns
(üres szerkezet)
• Szimmetrikus dimer
• A kristályszerkezetek zártak
Eredeti célkitűzés: • A katalitikus triádbeli Asp szerepének felderítése
• Vad típusú, Asp/Asn és Asp/Ala mutánsok összehasonlítása
Harmat et al, J Biol Chem, 286, 1987 2011
A szerkezetek kétállapotú rendszerre utalnak• A domének szerkezete nagyon
hasonlít a különböző szerkezetekben
• A monomerek konformációja független a másik monomer konformációjától
• A nyitott szerkezetek minden esetben egyforma mértékben vannak kinyílva
A szubsztrát bejutása lehetséges
Katalitikusan inaktív konformáció
nyitott
A katalitikus és szelektivitási funkció szétválik
Az aktív hely intakt, a reakció lejátszódhat
A szubsztrát nem tud bejutni az aktív helyhez
csukott
Mi változik a kinyílás során?
Stabil állapotok mozgékony régiókkal:
• A szerkezet kinyílása és a katalitikus hely „szétszerelődése” összefügg:
Ser
A His-hurok és vele kölcsönható hurok kinyíláskor destabilizálódik.
mozgékonymerev
Asp
● csukott szerkezet
His
His
Zárt szerkezetek: az Asp szerepe a katalízisbenAsp/Ala mutáns• Az Asp karboxilát csoportot vízmolekula helyettesíti• Ez a His oldallánc eltolódását okozza• A His – Ser kapcsolat kedvezőtlen a katalízis
szempontjából
Katalizátorként nem működik
● vad típusú szerkezet● propeller
● Ser● His hurok● Asp hurok
Mechanizmus: konformációs szelekció• Csak egyféle nyitott szerkezet• A nyitott szerkezetekben szétszerelődött aktív hely, His hurok átrendeződött• A csukott szerkezet lehet üres, vagy szubsztrát-kötött
Oldatban nyitott-csukott egyensúly, a szubsztrátkötés hatására a csukott állapot stabilizálódik
Együttműködők
ELTE Szerkezeti Kémiaés Biológia Laboratórium
Náray-Szabó Gábor
Karancsiné Menyhárd Dóra
Beke-Somfai Tamás
MTA Enzimológiai Intézet
Polgár László Domokos Klarissza Szeltner ZoltánSzamosi Ilona
MTA Kémiai Kutatóközpont
Palló Anna