Elektroforesis gel

Pengertian• Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau

molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Prinsip• Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan.

• Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz

F = gaya Lorentz, q = muatan objek, E = medan listrik

How will you do if :

• You’re holding a small plastic tube with some clear liquid in it

• You’ve been told that the liquid contains DNA strands of several different lengths

• Your job is to figure out what those lengths are

Apa Itu Elektroforesis Gel?

Metode Elektroforesis yang digunakan untuk

memisahkan dan menganalisis fragmen-

fragmen makromolekul (asam nukleat dan

protein)

Menggunakan gel sebagai “saringan”

Kapan Kita MenggunakanElektroforesis Gel?

Jenis-Jenis Elektroforesis Gel

Elektroforesis DNA/RNA :• Elektroforesis gel agarose : horizontal

• Elektroforesis gel poliakrilamida : vertikal

Elektroforesis Protein :• PAGE (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis)

Sistem yang digunakan dalam PAGE- Flat Bed- Rod atau Column- Vertical Slab- Capillary

• SDS PAGE

• Blue Native PAGE (BN-PAGE)

• Zymogram PAGE

• Isoelectric Focusing (IEF)

• 2-D Electrophoresis

Komponen

Elektroforesis Gel

Gel

1. Berfungsi sebagai matriks Penyaring molekul

2. Pemilihan gel bergantung pada ukuran

molekul yang akan di elektroforesis

3. Biasanya terdiri dari

• Agarose : digunakan secara horizontal

• Poliakrilamida : digunakan secara vertikal

Agarose ditujukan pada berat molekul lebih dari 100 kb dan untuk

poliakrilamida untuk molekul –molekul 1-300 pasang basa, bahkan

mampu membedakan molekul-molekul dengan selisih panjang 1

nukleotida

Agarose Gel

1. Dimurnikan dari polisakarida alga Rhodophyla.

2. Gelidian dan Glaucaria adalah komponen yang dimodifikasi residu galaktosanya. Didalam hubungan dengan polisakarida, agropefin dibentuk agar.

3. Agarose larut pada buffer (TAE) yang mendidih dan ditunggu untuk dingin, Hasil ini dicetak pada cetakan gel yang ditempatkan pada suhu ruang.

Struktur Agarose Gel

Gambar SEM struktur agarose gel 2%(a) 70 oC (b) 40 oC (c) 30 oC (d) 20 oC

Resolusi Gel Agarose

Resolusi : kemampuan memisahkan molekulsehingga dapat terbaca dengan jelas

Gel Poliakrilamida

Poliakrilamida dibentuk dari akrilamida dan N,N’-methyle-bis-akrilamida yang dihubungkan dengan reaksipolimerisasi dengan penambahan ammonium perisulphate dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED). TEMEDadalah katalis yang dibentuk dari radikal bebas ionperisulfate dan diinisiasi polymerization dari acrilamida.

Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai polimer yang netral, kationik, anionik, atau amfoter dengan sifat fisika dan kimia, panjang dan berat molekul yang bervariasi

Polimerisasi Akrilamida

Hasil SEM polyacrilamide gelFrom :Journal of material chemistry website

• Fungsi : menjaga kesetimbangan pH, memberikan ion untuk konduktivitas,

• Elektroforesis DNA :Buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), atauTBE (Tris-borate-EDTA ) Loading buffer

• Elektroforesis Protein :Buffer Tris

Buffer

Bagaimana caranya?

Membuatmatriks gel

Proses

elektroforesis

Visualisasi(staining)

Gel Documentation System

Visualisasi Elektroforesis DNA

• Etidium Bromida disinari lampu UV berpendar

Staining

Dilakukan agar pemisahan elektroforesisdapat teramati.

Staining untuk elektroforesis DNA :

• Etidium bromida (penambahan EtBrmengurangi laju migrasi sebesar 15% )

• SYBR Gold, SYBR Green, Crystal Violet, Methyl Blue

Staining untuk elektroforesis protein:

• Coomasie Blue

• Silver Staining

Elektroforesis Protein

Protein Molecular Weight Markers

Autoradiografi DNA

Seperti apa hasilnya?

• Elektroforesis DNA (EtBr Staining)

• elektroforesis protein

Elektroforesis protein

• Silver staining

Migrasi Molekul DNA Pada Gel• Molekul DNA yang bermuatan negatif

karena adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis

• Fragmen DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama

• Topologi DNA yang dipisahkan menentukan elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat karena strukturnya sangat kompak. Topologi molekul DNA

hasil Elektroforesis.

• Konsentrasi gel agarose---->

• Pengaruh Voltase : makintinggi voltase, migrasifragmen yang lebih besarakan lebih cepat

• Buffer Elektroforesis

• Efek Etidium Bromida

Faktor yang mempengaruhi pemisahankomponen pada elektroforesis DNA

Faktor yang mempengaruhi pemisahankomponen pada elektroforesis protein

• Densitas molekul : berbeda diantara pH media dan pl molekul

• Pengaruh buffer :

• Bentuk dan ukuran molekul

• Media pendukung: • Restriksi pada mobilitas

• Pengaruh difusi

• Elektroendosmosis

• Mikro-heterogenitas molekuler spesies