ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Oleh: Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Asep Setiadi :
B1J008105 : IV :4 :Anriani Puspita Karunia Ning Widhi
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011
I.
PENDAHULUAN
A.
Latar Belakang
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam
biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA,
atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini,
molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya
oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan.
Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan
molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti
spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau
immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih
lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan
silang
(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan
kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran
kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi
berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan
silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan
ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang
lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah
dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan
ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan
penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel
tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah
pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan
negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk
menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium
hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat
berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan
deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat
protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses
pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat
dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie"
(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul
sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah
"diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar
ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif,
autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada
lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses
pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur"
gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir
elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam
gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya
berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau
penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran
berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam
pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di
gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut
dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.
Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma
ukuran molekul. .
B.
Tujuan
Tujuan praktikum adalah untuk mengetahui cara kerja dan prinsip
kerja elektroforesis.
II.
MATERI DAN METODE
A.
Materi
Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu DNA marker,
misalnya DNA yang dipotong dengan HindIII, DNA produk PCR, agarosa,
larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat
glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga
1000 ml), Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene
cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM), akuades, larutan
Etidium Bromid (EtBr). Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini
adalah gelas ukur 1000 ml, labu erlenmeyer 50 ml, seperangkat
mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific), tabung
mikrosentrifuga, kertas parafilm, seperangkat alat elektroforesis,
sarung tangan, kaca mata UV, UV transluminator, kamera digital.
B.
Matode
Praktikum ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: No.
Keterangan Gambar
1. Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%, timbang 0,2 g agarosa
(sudah disiapkan asisten) 2. Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20
mL
3. Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat jernih.
4. Biarkan larutan agarosa mendingin (55C) dan tambahkan 1 uL
etidium bromida (10 mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke dalam
pencetak gel
5. Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke dua ujung pencetak
gel dan menempatkan sisir pada salah ujung pencetak gel
6. Tuangkan
larutan
agarosa
ke
dalam
pencetak gel.
7. Setelah gel memadat, pindahkankan gel agarosa beserta
pencetak gel ke dalam tangki elektroforesis. Sebelum dipindahkan ke
tangki
elekstroforesis, selotip pada kedua ujung pencetak gel dilepas
terlebih dahulu 8. Masukkan 10 L sampel DNA yang telah dicampur
dengan 2 uL loading dye (6X) ke dalam sumur (well) gel agarosa 9.
Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda warna (biru) bermigrasi
di atas gel agarose bagian bawah.
10. Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel agarosa di atas
UV transillumitor dan tutup kaca pelindung dan amati pita DNA
11. Dokumentasikan pita DNA yang tampak menggunakan kamera .
III.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
B. Pembahasan Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk
memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan
struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain
agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk
memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga
20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di
dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju
kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah
laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan
dengan memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah
diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah
paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam
pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk
melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan
etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Teknik
gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12
tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide
Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi
akrilamida dan bisakrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran
DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi
elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini
masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran
yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom
tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda. (
Pratiwi, 2001). Metode Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada
pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil
di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah
gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa
digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar
dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan
elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan
secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan
untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Prinsip pemisahan dalam
elektroforesis didasarkan atas perbedaan migrasi komponen pada fase
pendukung, karena adanya perbedaan muatan dan masa molekul ( Zubay,
1989).
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam
sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub
negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan
buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju
migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa
DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk
DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu
memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk
visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan
masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA
akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan
dengan membandingkannya dengan pita DNA standar ( Pratiwi, 2001).
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan
listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti
protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel
dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun
dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya
difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
bemigrasinya molekulmulekul biologi. Media penyangganya
bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan
dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai elektroforesis
antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. dalam Gel
poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat ( Zubay,
1989). Menurut Soedarmadji (1996), beberapa faktor mempengaruhi
kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: 1. Ukuran molekul
protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat
daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat
daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi
tinggi.
3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium
pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion
sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi
dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi
maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein.
Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga
aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein
sangat lambat. 4. Medium penyangga Medium pendukung ideal untuk
elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif
stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai
migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul
seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996). Jika ukuran pori dari
medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil
akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan
molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya
pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel
poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid. 5. Kekuatan
voltase Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi
molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Voltase
yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat
secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM
rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan
bolak balik). 6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis
berlangsung. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen
DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti
memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel
elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan
kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa,
sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di
dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda)
dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan
elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan
loading buffer (dye), yang berfungsi untuk menambah densitas,
sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; pewarna untuk
memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, agar dapat
bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga
dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa
digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain
itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan
ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA
standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah
DNA (Suharsono dan Widyastuti , 2006). Jika temperatur tinggi akan
mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika
temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.
Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari
elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak
tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya.
Semakin rendah berat molekulnya maka
semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi.
Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak
pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Sumitro et
al., 1996). Hasil praktikum menunjukkan bahwa DNA sampel terbaca,
namun DNA marka tidak terbaca malainkan terjadi penumpukan. Hal ini
terjadi mungkin karena kurang tepat dan kurang hati-hati dalam
memasukkan DNA marka ke dalam sumuran, sehingga DNA marka terlalu
banyak dan hingga memenuhi sumur sebelahnya. Hasil elektroforesis
akan didapatkan pita-pita protein yang
terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita
yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau
banyaknya protein yang
mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita
yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul
bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah
pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama
akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan
(Soedarmadji, 1996).
Fungsi dari alat dan bahan yang digunakan dalam elektroforesis
gel agarosa: a. Aquades b. Etidium bromide c. Baki gel agarosa d.
UV Transiluminator e. TAE : sebagai pelarut : sebagai pewarna DNA :
sebagai cetakan gel agarosa : untuk melihat pita-pita DNA :
Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH, a. Asam Asetat Glasial
sebagai elektrolit gram, b. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid)
sebagai pe-non aktif DNA-se DNA marka : DNA penanda Sisir
elektroforesis : untuk membuat sumuran pada gel agarosa Tangki
elektroforesis : untuk running DNA Loading dye : sebagai pemberat
DNA : untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye
: untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye :
Melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA
f. g. h. i.
j. Mikropipet k. Kertas Parafilm l. Sarung tangan
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat
disimpulkan : 1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen
atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya
dalam sebuah medan listrik . 2. Hasil yang didapat dilihat dari
perpendaran pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis, DNA
marka mengalami degradasi atau mengumpul tetapi DNA sampel dapat
terbaca. Hal ini terjadi karena beberapa kemungkinan antara lain
kesalahan dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumur gel, waktu yang
kurang atau voltase naik turun.
B. Saran Sebisa mungkin semua praktikan melakukan percobaan,
kalau tidak buat apa di bikin kelompok yang terdiri dari -+ 5
praktikan.
DAFTAR REFERENSI
Anonim, 2011.
http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/
Anonim. 2011 http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume
XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI,
Jakarta Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi
Pertama Liberty. Yogyakarta. Suharsono dan Widyastuti, U. 2006.
Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat
Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB. Sumitro, S. B,
Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus
Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Brawijaya. Malang Zubay, G.L. 1989. Biochemistry 2nd
Edition. Mcmillan Publishing Coorporation. New York.