ELEKTROFORESIS GEL
I.TUJUAN
1. Mempelajari teknik elektroforesis gel untuk mengetahui ukuran
fragmenDNA tanaman, darah dan plasmid.2.Mengetahui dan memahami
prinsip kerja elektroforesis gel.
II.TEORI
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat
berdasarkan perbedaan ukuran.Elektroforesis merupakan metode yang
paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi
molekuler (Bowen 2000: 1).Elektroforesis gel adalah teknik
memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada
makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel dibantu
dengan tenaga listrik (Anonim ?: 1).Prinsip kerja elektroforesis
gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan
pada medium berisi tenaga listrik.Molekul-molekul tersebut akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan
muatan yang terkandung di dalamnya (Bowen 2000: 1).Molekul-molekul
yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif
(anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation)
akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings
1994: 215).Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi
mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam
nukleat.Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk
digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk
menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu
(Fairbanks & Andersen 1999: 280).Aplikasi elektroforesis dapat
digunakan dalam uji paternitas dan identifikasi pelaku kejahatan
(DNAfingerprinting).Elektroforesis juga berperan dalamhuman genome
project(Anonim ?: 3).Elektroforesis gel memisahkan makromolekul
berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh
medan listrik.Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul
DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA
dengan panjang yang sama (Campbelldkk.2002: 396--397).Ada tiga
jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA,
yaitu:1.Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan
penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi
primer.2.Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA
yang berukuran besar.3.Gel agarosa formaldehid denaturasi,
berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan
untuk fraksi RNA pada ukuran standar.(Davisdkk. 1994: 151).Dalam
proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:1.Ukuran Molekul DNAMolekul
yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena
hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul
berukuran besar.2.Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi
agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati
molekul-molekul DNA.Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa
yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih
besar.3.Bentuk molekulMolekul yang memiliki bentuk elips atau
fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk
bulat.4.Densitas muatan yaitu muatan per unit volume
molekul.Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih
cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang
rendah.5.Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan,
semakin lambat pergerakan molekul DNA.6.VoltaseSemakin tinggi
tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul
DNA.7.LarutanbufferelektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi
akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi
DNA.(Wolfe 1993: 127;Bowen 2000: 3-4).Markeradalah segmen DNA yang
spesifik dan telah diketahui ukurannya.Markerberfungsi sebagai
acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.MarkerDNA yang
terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda
posisi pasangan basa dari molekul DNA yang
bermigrasi.Marker-markerDNA tersebut merupakan marker yang telah
dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah
satu contohmarkerDNA adalah lambdaHindIII.Markertersebut memiliki
delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130
pb.Penggunaan DNAmarkertersebut dikarenakan molekul DNA yang akan
diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110--20.000 pb.(Birren
& Lai 1993: 82; Martin 1996: 77).Elektroforesis gel memiliki
beberapa komponen yang terdiri dari:1.Comb: digunakan untuk
membentukwellpada gel agarosa.2.Tray: digunakan untuk sebagai
cetakan gel agarosa.3.Chamber: digunakan sebagai wadah gel
agarosa.4.Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses
elektroforesis.Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan
sepert Etidium Bromidayang bersifat karsinogenik danBrom Fenol
Blue.Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya
fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkanBrom
Fenol Blueberfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan
molekul DNA pada gel (Birren & Lai 1993: 79--81).Manfaat
elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA
dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang
berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian
atau purifikasi DNA.Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk
berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari
spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom,
DNAfinger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab
kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan
jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas
gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas
gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari
evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam
populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat
molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik,
menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR,
mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu,
dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan
plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500--501; Fairbanks &
Andersen 1999: 278).
III.ALAT, BAHAN DAN CARA KERJA
A.ALAT
Alat yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah
aparatus elektroforesis yang terdiri daritray, comb, chamberdan
sumber listrik; sarung tangan karet; mikropipet dan tips; alat
dokumentasi gel (gel doc) merek BIORAD tipe XR.
B.BAHAN
Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah
bubuk agarosa 1 gr;running buffer;loading buffer; parafilm; sampel
DNA (produk PCR); Etidium bromida (EtBr); DNA marker (lambda
DNA/Hind III).
C.CARA KERJA
1.Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan
campuran 2 gr agarose + 200 ml 1x TBE, dididihkan dan ditambahkan
etidium bromida 2L dicampur dengan baik, kemudian dituangkan ke
dalam cetakan yang telah disiapkan dengancombnya dan dibiarkan
sampai mengeras.2.Gel dimasukkan kedalamelectrophoresis chamberdan
ditambahkan larutanrunning bufferserta etidium bromida.3.Sampel DNA
hasil PCR dicampurkan denganloading bufferkemudian dimasukkan ke
dalamwellpada gel dengan menggunakan mikropipet.4.Marka DNA
dimasukkan.5.Penutupelectrophoresischamberdipasang danpower
supplydinyalakan.6.Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung
gel, gel dikeluarkan dan dilihat dengan sinar UV.
IV.HASIL PENGAMATANA.SAMPEL DNA TANAMAN
Agarose 0,8%, 100 volt, 1l/ml EtBr
Keterangan :A. DNA MarkerB. WellC. DNA tanamanD. Gel
B. SAMPEL DNA DARAH
Agarose 1%, 100 volt, 1l/ml EtBr
Keterangan:A. DNA MarkerB. DNA darahC. WellD. Gel
C.SAMPEL DNA PLASMID
Gal Agarose 1%, 100 volt, 0,1l/ml EtBr
Keterangan:A. DNA MarkerB. DNA plasmidC. WellD. Gel
V.PEMBAHASAN
Praktikum elektroforesis gel menggunakan gel agarosa.Gel agarosa
diperoleh dari rumput laut dan biasanya digunakan dalam konsentrasi
0,5--2%.Alasan memakai agarosa dibandingkan poliakrilamida adalah
agarosa mudah untuk disiapkan karena proses pembuatannya mudah.Gel
agarosa dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan
larutanbuffer, kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras.Gel
agarosa juga bersifat non-toxic(Bowen 2000: 1).Selain itu praktikum
elektroforesis gel juga menggunakan alat-alat yang mempunyai fungsi
dan peranan masing-masing.Alat-alat tersebut adalah mikropipet,
apparatus elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung
tangan lateks.Mikropipet berfungsi untuk memindahkan sampel dan
larutan lainnya daritubeke dalamwell-wellpada aparatus
elektroforesis.Apparatus elektroforesis terdiri atascomb(sisir)
yang membentukwell(sumur) pada gel agarosa,trayyang merupakan wadah
cetakan gel, danchamberyang merupakan medium tempat berlangsungnya
proses elektroforesis.Power Supply (DC)sebagai sumber energi untuk
aparatus elektroforesis.Sumber Sinar UV berfungsi untuk membantu
mengamati hasil band yang tampak sehingga terlihat lebih jelas.
Sarung tangan lateks berfungsi untukmelindungi tangan agar tidak
bersentuhan langsung dengan etidium bromida yang bersifat
karsinogenik atau penyebab kanker (Birren & Lai 1993:
79--81).Praktikum elektroforesis gel dimulai dengan pembuatan gel
agarosa.Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarosa karena
dilakukan oleh asisten praktikum.Secara umum, proses pembuatan gel
agarosa dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan
larutanbuffer, dipanaskan di dalammicrowave, tambahkan etidium
bromida, dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan
dengancomb-nya dan tunggu sampai mengeras.Bubuk agarosa yang
digunakan sebanyak 1 gr dan larutanrunning bufferTBE (Tris- Borate-
EDTA) sebanyak 100 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari
fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Bowen 2000:
3).Penambahan etidium bromida dilakukan dengan tujuanmewarnai asam
nukleat.Etidium bromida adalah mutagen dan harus ditangani dengan
hati-hati.Penanganannya harus dilakukan dengan sarung tangan karet
(Bowen 2000: 4).Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang
elektroforesis dan dilakukan penambahanrunning
buffer.Penambahanrunning bufferdilakukan dengan tujuan mempermudah
pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner et al. 1991:
?).Runningelektroforesis dilakukan pada tegangan 80 Volt selama 30
menit.Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan
elektroforesis.Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat
dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Bowen 2000: 4).Tahap
selanjutnya adalah mencampurkan DNA hasil amplifikasi lewat proses
PCR denganloading bufferyang memiliki fungsi membantu sampel turun
ke dalamwell dan membantu memonitor berapa lama proses
elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol
biru (Bowen 2000: 3).DNA amplifikasi yang dipindahkan hanya DNA
khamir dan plasmid.Hal tersebut berkaitan dengan terbatasnya jumlah
well yang ada.Pemindahan sampel DNA hasil amplifikasi dilakukan
oleh dua orang praktikan secara bergantian.Proses pemindahan
dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara
hati-hati agar campuran DNA denganloading buffertidak meluber ke
bagianwellyang lain.DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung
gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif
(Martin 1996: 9).Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup
ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik.Gel dikeluarkan
dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna dan
dilihat dengan sinar UV.Hasil dokumentasi dilakukan dengangel
doc.Gel docadalah alat yang digunakan untuk mengamati dan
mendokumentasikan hasil elektroforesis.Gel docyang digunakan
bermerek BIORAD tipe XR.Komponengel docterdiri dari lampu UV,
kamera dan komputer.Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam
darigel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan
komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat
bantuansoftware(Davisdkk.1994: 157--158)DNA marker yang digunakan
saat praktikum adalahlambdaDNA/Hind III.DNA marker tersebut
mencakup delapan fragmen DNA (125 bp-23130bp) dan digunakan dengan
alasan dapat melihat pasangan basa yang lebih banyak dibandingkan
DNA marker yang lain(Davisdkk.1994: 157--158).Hasil pengamatan
elektroforesis pada sampel darah praktikan tidak memperlihatkan
adanyaband-bandmeskipun telah dirunningberulang kali, namun pada
sampel darah yang diambil dari asisten
memperlihatkanband-band.Sampel 1 sampai sampel 4 merupakan sampel
darah asisten, sedangkan sampel 5 sampai sampel 8 merupakan sampel
darah praktikan.Hasil elektroforesis DNA tanaman dengan gel agarosa
1% tidak menunjukkan adanyaband, baik paralel 1 maupun paralel 2
sehingga asisten melakukanloadingulang dengan gel agarosa 0,8% dan
dijadikan dalam satu gel dengan ukurancombyang lebih kecil.Hasil
perlakuan tersebut memperlihatkanbandberada di atasmarkernamun
tampak kurang jelas.Hasil elektroforesis DNA plasmid
terlihatbandhanya pada sampel DNA plasmid kelompok 3 dan 4,
sedangkan pada sampel DNA plasmid kelompok lainnya tidak
menunjukkan adanyaband-bandHasil elektoforesis gel yangband-bandnya
tidak terlihat dan kurang jelasnyaband-bandyang terbentuk
menyebabkan hasil tersebut tidak dapat digunakan untuk mengukur
ukuran fragmen DNA.Hal tersebut kemungkinan dikarenakan banyak
faktor, antara lain proses pengisolasian yang tidak benar, proses
PCR yang kurang bekerja, keterbatasan fasilitas yang tersedia, dan
telah terkontaminasinya sampel DNA.Kekurang telitian praktikan
dalam proses pengerjaannya pun menjadi faktor ketidakberhasilan
praktikum.
VI.KESIMPULAN
1. Ukuran fragmen DNA dapat diketahui dengan teknik
elektroforesis gel.2.Prinsip kerja elektroforesis adalah pergerakan
molekul organik dari kutubnegatif ke kutub positif berdasarkan
ukuran fragmen.III.DAFTAR ACUAN
Anonim. ?.Gel Electrophoresis. ?. www.bergen.org.27 April
2007,pk.17.10.Birren, B. & E. Lai. 1993.Pulsed field ge
electrophoresis: a practical guide.Academic Press, Inc.,San Diego:
xviii + 235 hlm.Bowen, R. 2000.Principles of gel electrophoresis. 3
Januari 2000: 4 hlm.http://www.vivo.colostate.edu.27 April 2007,
pk. 17.50.Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell.
2002.BIOLOGI. Ed ke-5. Terj.dariBIOLOGYoleh Lestari, R,dkk.
Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.ColoradoStateUniversity.
2000. Principle of gel electrophoresis.3 Januari2000:
1.http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbook/genetics/biotech/gels/principles.html,
16 Mei 2008, pk. 08.30.Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey.
1994.Basic methods: Molecular biology. 2nded. Appleton & Lange,
Norwola: xii + 777 hlm.Faibanks, D.J. & W.R. Andersen.
1999.Genetics: The continuity of life.Brooks/Cole Publishing
Company,New York: xix + 820 hlm.Gardner, E.J., M.J. Simmons, &
D.P Snustad. 1991. Principles of genetics.8th ed. John Wiley &
Sons Inc.,New York: xviii + 713 hlm.GenScript Corp.(?). Marker
LambdaHindIII. (?): 1
hlm.http://www.genscript.com/site2/images/MM1212.jpg,16 Mei 2008,
pk. 08.25.Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994.Concept of
genetics.4th ed. PrenticeHall, Englewood Cliffs: xvi + 773
hlm.Martin, R. 1996.Gel electroforesis: Nucleid acids.Bros
Scientific PublishersLtd.,Oxford: xiii + 173 hlm.Russell, P.J.
1994.Fundamentals of genetics.HarperCollinsCollegePublishers,New
York: xvi + 528 hlm.TerritorioScuola. (?).Gel electrophoresis
apparatus. (?): 1
hlm.http://commons/thumb/a/a6/Gel_electrophoresis_apparatus.JPG/288px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG,16
Mei 2008, pk. 08.40.Wolfe, S. L. 1995.Introduction to cell and
molecular biology. WardworthPublishing Company, Belmont: xvii + 820
hlm.
Tinjauan pustakaUntuk mengetahui kemampuan hidup mikroorganisme
dalam media yang mengandung logam berat, maka dilakukan
pengjitungan jumlah sel mikroorganisme yang diinokulasi pada media
cair dengan konsentrasi Cr(VI) 0 ppm dan 10 ppm selama 16 jam.
Biakan yang tumbuh diencerkan beberapa kali pengenceran 10-5 dan
10-6. hasil pengneceran ditumbuhkan pada media LB padat sebanyak
100 l, dan diinkubasi lagi selama 16 jam suhu 37 C. Koloni yang
tebentuk dihitung dengan colony counter dan dihitung jumlah sel
mikrooganisme dalam satuan sel/ml (Hadioetomo, 1993).Elektroforesis
dikatakan sebagai analisis yang ideal untuk memurnikan komponen
protein dari campuran sampel dengan cara penambahan medium yang
dapat mengikat protein selama elektroforesis. Metode terbaik dalam
pemurnian protein dengan tehnik elektroforesis adalah dengan bahan
polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Gel poliakrilamid
merupakan larutan dari akrilamid dan bisakrilamid (Hames, 1990;
Matsudaira, 1993; Davis,et.al, 1994).Protein marker digunakan untuk
mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida (Hames
& Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan memiliki
rentang berat molekul 212 kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis
terdapat sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan
berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna
yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap
variaetas disebut protein mayor (Wijaya & Rahman: 2005).
Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan
memecah struktur tiga dimensi dari protein, terutama ikatan
disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual.
SDS juga membungkus rantai protein yang tidak terikat dengan muatan
negatif yang sama membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS
protein mempunyai densitas muatan yang identik dan bergerak pada
gel hanya berdasarkan ukuran protein (Wijaya & Rohman,
2005).Alasan elektroforesis digunakan dalam penelitian ini karena
memiliki peran sangat penting dalam proses pemisahan
molekul-molekul biologi, khususnya protein. Karena disamping metode
tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer, tetapi juga sangat
sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup
kecil (Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam medium yang
menagndung medan listrik maka senyawa-senyawa yang bermuatan akan
bergerak dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas yang
berlawanan, maka mobilitas suatu molekul meupakan fungsi dari
bentuk, ukuran molekul, dan besar tipe
muatan.PembahasanElektroforesisElektroforesis adalah teknik
pemisahankomponenataumolekulbermuatanberdasarkan perbedaan
tingkatmigrasinyadalam sebuahmedan listrik. Medan listrik dialirkan
pada suatumediumyang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik
ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
padamakromolekul, misalnyaDNAyang bermuatan negatif. Jika molekul
yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian
dialiri arus listrik dari suatukutubke kutub yang berlawanan
muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada
nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengangaya Lorentz,
yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati
dan kondisi elektris lingkungan:F adalah gaya Lorentz, q adalah
muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.Secara umum,
elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA.Jenis elektroforesisPerangkat elektroforesis
gelElektroforesis kertasadalah jenis elektroforesis yang terdiri
dari kertas sebagai fase diam danpartikelbermuatan yang terlarut
sebagai fase gerak, terutama ialahion-ion kompleks.Pemisahan ini
terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem
pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan
atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan,
konsentrasielektrolit, kekuatan ion,pH, viskositas, dan
adsorpsivitas zat terlarut.Elektroforesis gel ialah elektroforesis
yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan
molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium
gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkanbiomolekulyang lebih
besar sepertiprotein-protein. Kemudian elektroforesis gel
berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel
media.Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein,
nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus yang dapat engion
sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion (-).
Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi
muatan.Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul
bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak
pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.
Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan
pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi
dengan densitometer. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang
besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul
biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik,
molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda
negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan
muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel
ini akan bergerak dalam medanlistrik. Pergerakan ini disebut
elektroforesis. Jika system koloid bermuatan negative, maka
partikel itu akan menuju electrode positifElektroforesis adalah
teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan
listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan
negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui
suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta
tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat
dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat
dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan:Fe = qE, F= gaya Lorentz, q= muatan yang dibawa oleh
objek, E adalah medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan
untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.
Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada
permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi
group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH
dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat
terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.Jenis
Elektroforesis1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis
yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan
yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks.
Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang
sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada
muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas,
dan adsorpsivitas zat terlarut.2. Elektroforesis gel ialah
elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan
dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan
biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian
elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan
poliakrilamida sebagai gel media.Medium PendukungElektroforesis
untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah
terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung
yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek
penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis
dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan
buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif
dalam zona tertentu.Meskipun medium pendukung relatif stabil
(inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi
elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran
molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.1.
Cellulose asetat2. Larutan BufferLarutan buffer (penyangga) ini
menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi
kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :- Komposisi
=> Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena
akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk
memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang
bermuatan listrik dengan karbohidrat.- Konsentrasi => Dengan
naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa
meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga
memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan
meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat,
biasanya dipilih 0,05 -0,10M.- Ph => Tingkat ionisasi asam-asam
organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk
basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga
terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa
seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa3. Medan
elektrikApabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus
ditentukan oleh tahanan dalam medium.- Voltase => Apabila jarak
antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara
keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m.
Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.-
Aliran listrik => Arus aliran listrik dalam larutan antara dua
elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion
dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang
dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion
akan sebanding dengan waktunya.- Tahanan => Medium elektroforesa
menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis
buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan
bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan
bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam
buffer.Dalam hasil praktikum yang dilakukan dihasilkan pembahasan
seperti iniPembuatan Jel HorisontalAlat dan bahan yang di butuhkan
seperti sisir, cetakan, tempat jel, tutup berventilasi, tegangan 25
volt, 50 volt, 100 volt, 135 volt.Pembuatan horizontal => bahan
yang digunakan dari agarosa (dari rumput laut/ agar2 yang telah dip
roses lagi) hal ini dilakukan menggunakan agarose karena padi dan
agar agar mudah retak atau patah. 0,8% sampai dengan 2% agarose (
tergantung berat molekul ) dibawah 0,8% mudah lunak sehingga perlu
di ekstrak. Etilium bromide( ditambahkan pada agarose atau washing
buffer pada akhir pembuatan jel ). Mencetak pada tempat cetakan
yang sudah di siapkan, mendiamkan 15 sampai 30 menit, sampai jel
membeku. Mengambil sisir dalam cetakan. Ambil jel dan meletakkan
pada tempatnya ( yang horizontal ). Memasukkan running buffer (
supaya tidak terbentuk gelembung udara pada sumuran). Apabila ada
gelembung udara, otomatis berpenggaruh pada pemasukan samprl.
Memesukan sampel pada sumuran ( pada loading sampel). Ditambahkan
pewarna BPB/BTB (ditambahkan pemberat agar turun kesumuran) hal ini
adalah teknik loading buffer. Ditambahkan marker di akhir pembuatan
jel. Menutup dan pasang arus listrik setelah running lepas tutup
dan ambil tempat jel. Masukan washing buffer ( kira kira selama 15
menit). Memasukan UVilluminator.Pembuatan jel vertikalAlat dan
bahan yang dibutuhkan plate(kaca) kecil 1mm, plate (kaca) besar 3mm
ada speacer. PAGE SDS PAGE, urea.Metodenya yang digunakan sparating
jel bagian bawah. stacking bagian atas (untuk sampel)Pembuatan
vertical => 10% sampai 12,5% atau 5% sampai 15% untuk pembuatan
jel vertical, stacking jel kosentrasinya 4% dimasukan. Merendam jel
membutuhkan larutan staning dan destining. Yang larutan staning
membutuhkan 12jam. Metodenya hampir sama dengan pembuatan jel yang
horizontal.Kesimpulan dan saranKesimpulan Elektroforesis adalah
teknik pemisahankomponenataumolekulbermuatanberdasarkan perbedaan
tingkatmigrasinyadalam sebuahmedan listrik. Elektroforesis kertas
adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Elektroforesis gel ialah
elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul.Saran Dalam praktikum setidaknya
penjelasan demi penjelasan harus diperhatikan, karna bagi kita
dalam praktikum ini masih banyak yang belum dimengerti.Daftar
PustakaPaper Electrophoresis. Image
fromhttp://www.funsci.comWijaya. S.K.S & Rohman, L. 2005.
Fraksinasi dan Karakterisasi protein Utama Biji Kedelai.Fakultas
MIPA Universitas JemberHadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar
dalam Praktek. Jakarta: UI PressBachrudin. Z. 1999. Petunjuk
Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. PAU
Bioteknologi: UGM Yogyakarta.Hames, B.D &Rickwood.1990. A
Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert
E Krieger Publishing CompanyMatsudaira, P. 1993. A Practical Guide
to Protein and Peptide Purification for Microsequencing. 2ndEd.
California: Academic Press. IncDavis, P.H dan V.H Heywood.
1963.Basic Methods in Molecular Biology. 2ndEd. Conecicut: Appleton
& Lange.Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies,
Nature Publishing
Group.http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.htmlhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular
TUJUAN1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan
metode elektroforesis.2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.DASAR
TEORI
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat
berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang
paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi
molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah
dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk
analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum,
urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip
elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein
bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan
penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung
pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul
protein (Jean and Francois G., 2010)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.
Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau
kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya
(Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion)
akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan
molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai
ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.
Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan
sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan
komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks
& Andersen, 1999).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.
Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi
pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan
panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis
DNA, yaitu:1.Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk
memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi
primer.2.Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA
yang berukuran besar.3.Gel agarose formaldehid denaturasi,
berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan
untuk fraksi RNA pada ukuran standar(Davis dkk. 1994).
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida
digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara
dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan
konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif
tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi
agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik
dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri.
Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam
padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak
lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena
memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda
positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan
resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan
pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak
terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi
lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang
sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada
fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih
cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel
yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten
untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor
utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari
kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan
kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan
resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan
itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb
dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee
& Bahaman, 2010).
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri
dari:1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.2.
Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.3. Chamber:
digunakan sebagai wadah gel agarose.4. Sumber listrik: digunakan
untuk memberi arus saat proses elektroforesis(Birren and Lai,
1993).
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium
Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal
tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi
dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue
berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada
gel (Birren and Lai, 1993).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran
fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil
digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga
untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain
membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui
susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada
atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit
tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan
tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai
tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi
perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular,
mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam,
menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA,
protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang
diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan
genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang
diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and
Andersen, 1999).
Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan
yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan
elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama
pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa.
Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang
tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau
banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan,
2011).
ALAT DAN BAHAN
ALAT1. Satu set alat elektroforesis2. Mikropipet dan tip3. Gel
Doc4. Power Supply5. ParafilmBAHAN1. DNA Marker2. Produk DNA3.
Ethidium Bromide (EtBr)4. dd H2O5. Gel Agarose6. Loading Buffer
(Loading dye)7. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)8. AkuadesCARA KERJA
Pembuatan Gel Agarose1. 0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50
ml Buffer TAE.2. Campuran tersebut dilarutkan dengan cara
dipanaskan.3. Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu
50C.4. Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.5. Larutan
agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan
hingga mengeras.6. Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat
diambil dan gel agarose siap untuk digunakan. Elektroforesis1. Gel
Agarose direndam dengan Buffer TAE.2. 1l loading dye dicampur
dengan 3l produk DNA pada parafilm yang telah tersedia dengan
bantuan mikropipet.3. Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well
pada gel agarose.4. Sedangkan untuk 3l DNA marker 1kb dituangkan
pada sumur/well yang berada pada paling tepi atas dan bawah.5.
Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power
supply.6. Power Supply ( 400mA, 90V) dinyalakan selama 30 menit.
Dokumentasi1. Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada
larutan EtBr selama 15 menit.2. Dilanjutkan dengan direndam dalam
akuades selama 15 menit.3. Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc
dan kemudian diambil gambarnya.HASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL
PEMBAHASAN
Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat
memahami secara baik dan mampu untuk melakukan salah satu
teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan Protein), yaitu metode
elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat
mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum
ini.
Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan
molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan
listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan
muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang
bermuatan negatif (Yuwono, 2005).
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif
(DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose,
kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui
membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).
Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang
yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti,
1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:1.
Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel
yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus
listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan
menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.2.
Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling
banyak digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas,
selulosa asetat, agarose atau poliakrilamid(Biosciences, 1999).
Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah
elektroforesis zona dan menggunakan teknik elektroforesis
horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat
elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk
analisais DNA.
Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia
selama proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan
cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong
plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai
untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di
lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan,
metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan
pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena
slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).
Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel
agarose 0,8%. Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8%
karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara umum, proses
pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk
agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di
dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah
disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose
yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE
(Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan
migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik
(Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam
ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer.
Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah
pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991).
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer
yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan
membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah
berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin,
2012).
Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan
produk DNA sebanyak 4l dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3l pada
sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb
dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses
pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan
secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak
meluber ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA
mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju
kutub positif (Martin, 1996).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui
ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran
DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang
elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari
molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan
marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan
basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII.
Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb
hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang
elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running.
Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan
arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat
dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan
oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar
akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang
kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari
ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna. Dokumentasi
dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994).
Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah
merendam gel agarose hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang
lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan
daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah
itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang
lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah
divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc.
Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan
mendokumentasikan hasil elektroforesis. Komponen gel doc terdiri
dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi
bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil
elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses
dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk, 1994).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang
mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1.Ukuran Molekul DNAMolekul yang berukuran lebih kecil akan
cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi
tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2.Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin
kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul
DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA
yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah
memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3.Bentuk molekulMolekul yang memiliki bentuk elips atau fibril
akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk
bulat.
4.Densitas muatanDensitas muatan yaitu muatan per unit volume
molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih
cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5.Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan,
semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6.VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin
cepat pergerakan molekul DNA.
7.Larutan buffer elektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi
akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi
DNA(Wolfe, 1993).
Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang
tersinari UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama
sekali, yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada sisi
tepi gel agarose. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh
terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada
praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit kesalahan dalam
penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang
mempengaruhi proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang
sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak bermigrasi
sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang
lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu
untai DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu, dimungkinkan karena
dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari
suhu penyimpanan.
Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang
fragmen dari suatu produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan
menggunakan suatu kurva regresi linier.
KESIMPULAN1. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel
agarose termasuk dalam jenis elektroforesis zona dengan menggunakan
teknik elektroforesis horizontal.2. Elektroforesis memiliki prinsip
kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri
listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis
melalui matriks membran gel agarose.3. Panjang fragmen DNA dapat
terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat didalamnya
disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan
tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur
menggunakan kurva regresi linier.4. Faktor yang mempengaruhi laju
migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah ukuran
molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan,
pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain
itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang mempengaruhi
laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan
faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan
produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan.
DAPUS
Biosciences, Amersham. 1999.Protein Electrophoresis. Amersham
Biosciences : USA.Birren, B., E. Lai. 1993.Pulsed field ge
electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San
Diego.Boffey, S. A. (1984).Isolation of high molecular weight DNA,
in Methods in Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J.
M., ed.), Humana, Totowa, NJ.Campbell, N.A., J. B. Reece & L.
G. Mitchell. 2002.BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta.Davis, L.,
M. Kuehl, & J. Battey. 1994.Basic methods: Molecular biology
2nded. Appleton & Lange, Norwola.Fairbanks, D.J., W.R.
Andersen. 1999.Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole
Publishing Company, New York.Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P
Snustad. 1991.Principles of genetics 8thed. John Wiley & Sons
Inc., New York.Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel
Electrophoresis Aplications in Clinical Chemistry.Journal of
Medical Biochemistry 2010; 29 (1).Klug, W.S., M.R. Cummings.
1994.Concept of genetics 4thed. Merrill Publishing Co. : Columbus,
Ohio.Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for
distinct DNA fragment analysis in agarose gel
electrophoresis.Tropical Biomedicine 27(2): 351-354
(2010).Lisdiyanti. 1997.Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah
Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor.Magdeldin, Sameh. 2012.Gel
Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka,
Croatia.Martin, R. 1996.Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros
Scientific Publishers Ltd., Oxford.Russell, P.J. 1994.Fundamentals
of genetics. Harper Collins College Publishers, New York.Tarigan,
Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen
Penyakit.WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.Wolfe, S. L.
1995.Introduction to cell and molecular biology. Wardworth
Publishing Company, Belmont.Diposkan14th May 2013olehPercy Ajis
Jackson