7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
1/30
FILTRASI
Kelompok 3
Nur Azizah Ibnu Umaruddin
Rinaldi Anhari N Husnul Khotimah
Tatu Ruhamalia M Bayu Aji atrio
Dosen : Sandra Hermanto, M.Si
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
2/30
Apa itu Kromati!ra" #el$iltrasi%%%
&serin! disebut kromato!ra" eksklusi atau !el pe'hromato!raphy( merujuk kepada perbedaan siberupa ukuran*bobot molekul dari komponen a
kromato!ra" !el "ltrasi adalah metode kromatdimana pemisahan didasari perbedaan bentuk da
molekul &BM( dari setiap komponen analit dalam'ampuran+ kromato!ra" !el "ltrasi mampu mem
molekul dari ukuran ,-- .a hin!!a ,/-+---
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
3/30
Ba!aimana 0rinsip dasar Kromato!ra" #el $il
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
4/30
$ase #erak pada Kromato!ra" 1ks
$ase !erak 12 untukprotein dan polimer larut
air )ase !erak yan!
di!unakan disesuaikanden!an )ase diam yan!
di!unakan+
$ase !eraak 12 polimer polar dan p
larut dalm pelaor!ani'+
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
5/30
4enis Kolom pada Kromato!ra" 1ks
Bahan kolom seten!ahkaku ini merupakan
turunan dari polistirenyan! telah berikatan
silan! den!an di5inilbenzene+ 2ontoh )asediam yan! di!unakanuntuk kolom seten!ahpadat ini misalnya !el
styra!el dan !el TKuntuk memisahkan
Ko
bdi!
memse
laseb
di!
pe
Bahanuntuk
kolom kakuini terbuatdari sili'a
sertatersedia
dalamberba!ai
ukuran poridan
ber!aris
ten!ah
Kolom KakuKoKolom eten!ah
Kaku
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
6/30
$ase .iam dalam Kromato!ra" #el $il
Fase diam terdiri dari partikel inert yan! memiliki ukura
tertentu+
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
7/30
Komponen dalam Kromato!ra" $iltra
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
8/30
i)at $isik dalam Kromato!ra" #el $il
8imit1kslusi
$ra'tional
ran!e
9aterre!ain
and
bed5olume
#elparti'leshape
andsize
15
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
9/30
0reparasi #el dan 0enyimpanan
ebelum di!unakan !el dekstran dan akrilamid diredam
air selama 37: jam+ Untuk mendapatkan ikatan silan! yan!sempurna perendaman dilakukan ;< jam khususnya untuktipe 073-- atau #7
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
10/30
0reparasi khusus den!an men!!unakan pompa5akum dan 6ater aspirator ju!a bisa dilakukanuntuk men!hilan!kan !elembun!* !as pen!otor&biasanya , samapai < jam(+
0enambahan anti mi'robial ju!a perlu disebelum prose penyimpanan terutama unhydrated !el misalnya den!an penambahazida -+-
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
11/30
Kelebihan dan Kekuran!an K#$
Kromatograf gel memiliki beberapa keunt
dalam penggunaannya:
hanya terjadi masalah da
deakti5asi k
tidak kehilan!an'uplikan* reaksiselamapemisahan+
Har!a Trsesuai den!anukuran'uplikan+
6aktupemisahanmudahdiramalkan+
6aktu pemisapendek+
pita7pitasempit+
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
12/30
Kromatograf gel memiliki beberapa kelem
dalam penggunaannya:
Kelebihan dan Kekuran!an K#$
kapter
tidak dapatdi!unakan untukanalit den!an BMhampir sama+
prinsippemisahan
tidak sepertikromato!ra"
lain
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
13/30
Aplikasi Kromato!ra" #el $iltr
Analisis 'ampuran den!an BM berbeda
0emisahan asam7asam nukleat dannukleotida
0en!eluaran #aram
0emisahan polisakarida !ula danprotein dari senya6a den!an BMrendah
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
14/30
Purifkasi L-Asparaginase Dari BawangBombay (Allium cepa L.) Menggunakan
Kromatograf Filtrasi el Sephadex -!"
Ayu Sri Rahayu Setiawan, Wuryanti, Agustina Lina Nurul AminiLab !i"#imia, $urusan Kimia, Fa#ultas Sains %an Matemati#a,&ni'e
(i)"neg"r" $alan *r"+ S"e%art", Tembalang, Semarang -./, Tel0-.12/1/1/1 setiawanayu3gmail4"m
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
15/30
ABTRAKTelah dilakukan purifikasi L-asparaginase dari bawang bombay (Allium cepa L.). Tahapan pe
isolasi L-asparaginase menghasilkan ekstrak kasar yang selanjutnya difraksinasi dengan a
dialisis, dan kromatografi filtrasi gel sephade !-"## sehingga menghasilkan L-asparkemurnian lebih tinggi. Analisis L-asparaginase pada ekstrak kasar, hasil fraksinasi amonium
kromatografi filtrasi gel sephade !-"## dilakukan dengan penentuan aktifitas en$im dengan
dan penentuan kadar protein dengan metode Lowry sehingga dapat ditentukan aktifitas sp
analisis diperoleh ekstrak kasar L-asparaginase dari bawang bombay (Allium cepa L.) dengan
sebesar '#,# unit*mg protein. Aktifitas spesifik tertinggi dari fraksi amonium sulfat berad
"##) sebesar '#,'" unit*mg protein. + (#-"##) selanjutnya dimurnikan dengan kromato
sephade !-"## sehingga diperoleh aktifitas spesifik tertinggi berada pada fraksi "# sebesar
protein dengan tingkat kemurnian lebih dari ## kali dibandingkan dengan ekstrak kasar.
/ata kunci 0 Allium cepa L., L-asparaginase, uji aktifitas en$im, kromatografi filtrasi gel
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
16/30
0endahuluan
1n$im merupakan biokatalisator yang
mempercepat reaksi kimia dalam sistem
biologi. 1n$im bersifat spesifik terhadap
substratnya (Lehninger, "2).
1n$im L-asparaginase adalah en$im yang
mengkatalisis reaksi hidrolisis L-asparagin
menjadi L-aspartat dan amonia (&andler dan&ill, "23). L-asparaginase dapat menghambat
pertumbuhan sel kanker (/oneen4 dkk., ##5).
6ada penelitian ini d
pemurnian lebih lanjut L asparagi
bawang bombay meng
kromatografi filtrasi gel sephade
/romatografi filtrasi gel sephade
merupakan metode pemisahan
didasarkan atas perbedaan ukuran
(Lehninger, "2). L asparagina
akan diperoleh dari kromatograf
gel sephade !-"## diharapkan ja
murni dikarenakan L aspa
dipisahkan dari molekul prot
didasarkan perbedaan ukuran mol
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
17/30
M1T>.1 K1R4A
Alat : Alat-alat gelas laboratorium, Timbangan (/ern 555-5), p&meter (17T18& 9nstrum
"#), :lender (6hilip), ;entrifus (8entrific- ), /ulkas (;harp), 6engaduk magnet (emmert), /romatografi kolom sephade
dll.
Bahan : :awang bombay, bufer tris-hidroksimetil aminometan, amonium sulfat, membran
asparagin, Trichloro acetate (T8A), :o?ine serum albumin (:;A), +ollin ciocalteau, ;epha
"##, akuades, akuabides, dll.
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
18/30
2ARA K1R4A
Isolasi L!sparaginase
:awang bombay diiris-iris @bufer tris-hidroksimetilaminometan (#, > p& ,2)
Bi blender selama #menit.
&asil blender didiamkan "- jam pada suhu o8
disaring dan filtratnya disentrifus pada '5## rpm selama "menit
+iltrat yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar en$im L-
asparaginase.
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
19/30
2ARA K1R4AFraksinasi dengan "aram !monium Sul#at
Amonium sulfat yang telahditimbang dimasukkan ke
dalam ekstrak kasar sambildiaduk
8ampuran dibiarkansemalam dalam keadaan
dingin,
disentrifug
kecepatan '5## menit, dipe
fraksi #-#filtra
1ndapan dipisahkankemudian disuspensikan
dengan bufer.
+iltrat yang dihasilkandiperlakukan sama sehingga
didapatkan fraksi dengantingkat kejenuhan #-5#(+), 5#-# (+'), #-#
(+5), #-"## (+(+
&asil fraksinadidialisis
didapatkan bebas amo
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
20/30
2ARA K1R4A
$enentuan !ktiftas L!sparaginase
Lalu absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer 7=-=is pada ma 5#
#, mL filtrat diambil @ 5, mL akuades dan #, mL pereaksi %essler
diinkubasi pada suhu '3 o8 selama '# menit. ;etelah itu, ditambah #, mL larutan disentrifugasi.
;ebanyak "mL larutan L-asparagin #," >, @ #, mL en$im hasil fraksinasi, dan dibufer tris-hidroksimetil aminometan #, > p& ,2
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
21/30
2ARA K1R4A
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry
/adar protein hasil fraksinasi amonium sulfat
ditentukan dengan metode Lowry menggunakan
larutan :o?ine serum albumin (:;A) sebagai protein
standar.
Absorbansi larutan diukur dengan
spektrofotometer 7=-=is. /adar protein diukur
ditentukan secara regresi linier terhadap kur?a
standar :;A.
Pemurnian dengan
Kromatografi
Filtrasi Gel Sephadex G
+raksi amonium sulfat yang
aktifitas spesifik tertinggi diaplika
dalam kolom sephade !-"## (" cm
yang sebelumnya telah diekuilibra
bufer tris hidroksimetil aminometan ,2 dengan laju elusi yaitu # mL*jam
+raksi fraksi yang didapat
ditampung dan dianalisis kandunga
dan aktifitas en$im L-asparaginaseny
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
22/30
HAI8 .AN 01MBAHAAN
Lasparaginase pada Fraksi !monium Sul#at
1kstrak kasar 8ebih sedikit#ra"k kadar protein )raksi amoniu
8ebih banyak
$, sebesar ,
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
23/30
>enurut 8haplin (##5), protein yang mengandung asam-asam amino hi
mengendap pada konsentrasi garam yang lebih rendah dibandingkan protein yang meng
asam amino hidrofilik. &al tersebut dikarenakan pada tingkat kejenuhan garam amo
# ion-ion garam amonium sulfat berikatan dengan molekul air, sedangkan
mengandung asam amino hidrofobik paling banyak akan mengendap. 6rotein denga
hidrofilik tidak akan mengendap dan berada pada filtrat. 6rotein yang bersifat lebih
mengendap jika sudah berada pada tingkat kejenuhan garam tertinggi (#-"##).
6ada gambar 999. protein yang paling banyak mengendap berada pada kadar amo
# (+") yang bersifat lebih hidrofobik dibandingkan protein yang mengendap pa
garam #-"##.
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
24/30
)raksi yan! memiliki akti"tas enzim tin!!iadalah $, dan $/ den!an akti"tas enzimlebih dari
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
25/30
Lasparaginase Hasil KromatografFiltrasi "el Sephadex "%&&
/romatografi filtrasi gel yaitu me
protein yang berdasarkan per
molekul dari suatu protein. 6romenggunakan matriks gel berpor
dalam kolom dan dikelilingi oleh
yang mengandung campuran mo
kecil dilewatkan ke dalam k
protein yang lebih kecil dapat
dalam pori-pori butiran dan kar
selama aliran ke bawah kolom. >yang besar tidak dapat menembus
pori butiran dan melewati kolo
>olekul protein yang berukuran
mengalir ke bawah pada ke
tergantung pada kemampuann
butiran (Lehninger, "2).
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
26/30
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
27/30
+raksi "# memiliki aktifitas en$im yang tertinggi, yaitu sebesar ,#'' unit*mL, deng
protein terendah sebesar #,##5 mg*mL, sehingga aktifitas spesfiknya sangat tinggi, yait
#,# unit*mg protein. &al ini berarti fraksi "# mengandung L-asparaginase dengan kemur
tinggi dibandingkan dengan fraksi-fraksi sebelumnya. L-asparaginase pada fraksi "# m
peningkatan kemurnian lebih dari ## kali dibandingkan dengan data aktifitas spesifik eks
'#,# unit*mg protein. &al tersebut berarti hasil pemurnian Lasparaginase menggunakan kro
filtrasi gel sephadex !-"## lebih efektif dibandingkan dengan hasil pemurnian dengan
amonium sulfat.
Bari data tersebut tampak bahwa tiap-tiap fraksi hasil kromatografi filtrasi gel sepha
terdapat L-asparaginase meskipun besar aktifitas en$imnya berbeda-beda. &al ini bukan berarti
mengandung L-asparaginase dengan ukuran molekul yang berbeda-beda. Tiap-tiap fraksi meng
asparaginase mungkin dikarenakan molekul L-asparaginase menempel pada molekul-molek
lainnya yang memiliki ukuran molekul lebih besar daripada ukuran molekul dari L-asparaginas
aktifitas en$im L-asparaginase terukur di tiap fraksi. &al ini dibuktikan dari gambar 999. dan
menunjukkan fraksi " hingga fraksi 2 memiliki aktifitas en$im yang cukup tinggi, tetapi memil
spesifik yang sangat rendah dibandingkan dengan aktifitas spesifik fraksi "#. &al ini dikarenak
hingga fraksi 2 mengandung molekul-molekul protein selain L-asparaginase yang telah ditunj
profil kadar protein pada gambar 999..
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
28/30
KesimpulanL-asparaginase ekstrak bawang bombay (Allium cepa L.) difraksinasi dengan am
menghasilkan fraksi dengan aktifitas spesifik tertinggi berada pada + (#-"##) se
unit*mg protein. &asil tersebut selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi filtrasi g
!-"## sehingga didapat aktifitas spesifik tertinggi berada pada fraksi "# yaitu sebe
unit*mg protein dengan tingkat kemurnian lebih dari ## kali jika dibandingkan ekstra
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
29/30
.a)tar 0ustaka
:asha, %.;., Cekha, C., /omala, >., dan Cuby, ;., ##2, 6roduction of 1tracellular Antileukaemic 1n$yme L-aspar
>arine Actinomycetes by ;olid- state and ;ubmerged +ermentation0 6urification and 8haracterisation, Tropical
Pharmaceutical Research, (5), '
8haplin, >.+., :ucke 8., "22#,Enzyme Technology, -, 8ambridge 7ni?. 6r., %ewDork
Be?lin, Thomas >., "22', Textbook of Biochemistry with linical orrelations! edisi ke-', ', A Eohn Filey and ;oDork
1l-;ayed, 1l-;ayed, >., 1l-;ayed, ;.T., Fafaa, ;housa, !., ;hehata A.%., dan &anafy, ;.;., #"", 6urification, 8hara
Antitumor Acti?ity of L-asparaginase from 8hicken Li?er,Journal of American "cience , 3 ("), 55
&andler, 6., &ill, C.L., "23,Principles of Biochemistry! edisi ke-, 32-3'#, >c!raw- &ill /ogakusha, LTB., %ew D
/oneen4,6., /lejdus, :., &rstko?il, &., ##5, >onitoring The Asparaginase Acti?ity and Asparagine Le?els in 8hild
Acute Lymphoblastic Leukaemia Treated with Bifferent Asparaginase 6reparations, "cripta #edica $BR%&', 33 (),
Lehninger, A.L., "2,(asar)(asar Biokimia! Jilid * , 5-52, 6enerbit 1rlangga, Eakarta ;copes, C./., "23, Prote
Principles! and Practice, edisi ke-, "-, 3, ;pringer =erlag, %ew Dork
Farangkar, ;.8., dan /hobragade, 8.%., ##2, 6urification, 8haracteri$ation, and 1ffect of Thiol 8ompounds on Ac
Erwinia caroto+ora L-Asparaginase,Enzyme Research, 5
7/25/2019 Kromatografi Gel Filtrasi Edit(1)
30/30
Terimakasih