BAB IPENDAHULUAN
Kromatografi berasal dari bahasa Yunani Kromatos yang berarti
warna dan Graphos yang berarti menulis. Kromatografi mencakup
berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari
penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tinggal pada system
dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa gerak,
memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa
menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.Ada banyak
teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak
digunakan. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana.
Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas,
kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan
elektroforesis. Namun dalam makalah ini kita akan mengulas suatu
teknik kromatografi yaitu kromatografi penyaringan gel.Kromatografi
gel merupakan metode kromatografi baru, meliputi kromatografi
eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasi
gel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling mudah
dikerjakan. Selain kesederhanaannya, teknik ini sangat berguna.
Metode ini dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan
penggunaan utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari
tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk untuk
pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM >2000),
terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap
makromolekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel
dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari
polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara
mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu
memiliki berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat
dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat cocok
untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari cuplikan yang tak
diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga
dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu memiliki berat
molekul rendah atau berat molekul tinggi.Kekurangan yang paling
menonjol adalah kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti hanya
ada sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogram total,
karena kromatogram cukup pendek semua senywa terelusi sebelum to.
Pada kromatografi gel jarang terlihat lebih dari enam pita pada
satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi gel biasanya tidak
dapat memisahkan secara sempurna suatu cuplikan kompleks, tanpa
pemisahan lebih lanjut dengan metode lain. Kekurangan kedua adalah
tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai ukuran hampir
sama. Hal ini menyingkorkan kromatografi gel dalam banyak masalah
pemisahan senyawa yang penting, termasuk pemisahan isomer.
Perbedaan pada kromatografi gel adalah prinsip pemisahan yang
berbeda dengan yang digunakan metode kromatografi lain. Konsep
factor pemisahan , dan factor kapasitas k tidak bisa digunakan.
Susunan fasa gerak juga relative tidak penting pada kromatografi
gel.
BAB IIPEMBAHASAN
A. PENGENALAN DAN PEMISAHAN KROMATOGRAFI FILTRASI
GELKromatografi merupakan suatu teknik purifikasi dimana komponen
dari sampel dipisahkan berdasarkan kemampuan masing-masing komponen
tersebut untuk berinteraksi dengan fase gerak (mobile phase) dan
fase diam (stationary phase) yang dilalui sampel. Walaupun saat ini
telah tersedia berbagai tipe kromatografi, pada dasarnya semua
memiliki prinsip pemisahan yang sama (Shetty et al.
2006).Kromatografi filtrasi gel yaitu metode pemisahan protein
berdasarkan perbedaan ukuran molekul dari suatu protein. Proses
pemisahan menggunakan matriks gel berpori yang dipak di dalam kolom
dan dikelilingi oleh solven. Sampel yang mengandung campuran
molekul besar dan kecil dilewatkan ke dalam kolom. Molekul protein
yang lebih kecil dapat menembus ke dalam pori-pori butiran dan
karenanya ia akan tertahan selama aliran ke bawah kolom. Molekul
protein yang besar tidak dapat menembus ke dalam pori-pori butiran
dan melewati kolom lebih cepat. Molekul protein yang berukuran
menengah akan mengalir ke bawah pada kecepatan sedang tergantung
pada kemampuannya menembus butiran (Lehninger, 1982).
Berdasarkan Ahmed (2005) fase diam dapat berbentuk padat, gel,
cair atau campuran padat dan cair, sementara fase gerak dapat
berbentuk cair atau gas dan mengalir melewati fase diam. Semua
metode kromatografi bekerja dengan dasar keseimbangan yang dicapai
antara fase diam dan fase gerak. Kromatografi filtrasi gel sangat
cocok untuk biomolekul yang sensitif terhadap perubahan pH,
konsentrasi ion logam atau ko-faktor dan kondisi lingkungan yang
keras. Pemisahan dapat dilakukan karena adanya bahan-bahan penting
yaitu ion atau kofaktor, detergen, urea, guanidin hidroklorida,
pada konsentrasi tinggi maupun konsentrasi rendah. suhu 37 oC atau
di ruang dingin sesuai dengan persyaratan dari percobaan. Protein
murni dapat dikumpulkan dalam berbagai jenis buffer.Menurut Hagel
(1998) kromatografi kolom gel filtrasi seringkali digunakan sebagai
langkah awal sebelum dilakukan purifikasi lebih lanjut terhadap
sampel dengan teknik adsorptif. Selain itu, gel filtrasi juga
digunakan pada tahap akhir purifikasi untuk menghilangkan
kontaminan yang masih tersisa yang kemungkinan memiliki muatan sama
dengan protein target.Pada saat ini kolom-kolom filtrasi gel
kinerja-tinggi yang mengandung manik-manik kaku dalam polimer
berpori telah tersedia untuk penentuan analit berbobot molekul
tinggi. Mekanisme retensi dalam kromatografi eksklusi-ukuran
didasarkan pada sejauh mana suatu analit memasuki pori-pori di
dalam fase diam.
Seluruh molekul terbesar dikeluarkan dari ruang internal kolom
dan yang pertama terelusi dari kolom tersebut. Tersedia kolom-kolom
dengan ukuran pori yang berbeda. Untuk menentukan bobot molekul,
kolom-kolom tersebut dikalibrasi dengan baku polimer dengan bobot
molekul yang diketahui, meskipun koreksi berkaitan dengan
viskositas analit harus dilakukan jika salah satu tipe polimer
digunakan untuk mengalibrasi suatu kolom yang digunakan untuk
menentukan bobot molekul suatu tipe polimer yang berbeda karena
perbedaan dalam bentuk tiga dimensi. (Watson, 2005)
Fraksinasi resolusi tinggi oleh filtrasi gel sangat cocok untuk
polishing langkah terakhir dalam skema pemurnian. Monomer dapat
dipisahkan dari agregat dan sampel dapat ditransfer ke buffer yang
cocok untuk penyimpanan. Penyaringan gel dapat digunakan langsung
setelah salah satu teknik kromatografi seperti pertukaran ion,
chromatofocusing interaksi hidrofobik atau afinitas karena komponen
dari buffer apapun tidak akan mempengaruhi pemisahan akhir.Gambar
dibawah ini menunjukkan profil elusi teoritis (kromatogram) dari
fraksinasi resolusi tinggi dalam filtrasi gel. Molekul yang tidak
masuk matriks dielusi dalam volume kosong, Vo saat masuk langsung
melalui kolom pada kecepatan yang sama sebagai aliran buffer. Kolom
dikemas dengan baik,, pada volume kosong setara dengan sekitar 30%
dari total volume kolom. Molekul dengn akses sebagain pada
pori-pori elusi matriks dari kolom mengalami penurunan ukuran.
Molekul kecil seperti garam yang memiliki akses penuh ke pori-pori
bergerak ke bawah kolom, tetapi tidak terpisah satu sama lain.
Molekul-molekul ini biasanya mengelusi sebelum satu volume total
kolom (Vt) dari buffer telah melewati kolom.
DAPUS KU :
Ahmed H. 2005. Principles and Reaction of Protein Extraction,
Purification, and Characteriztion. Florida: CRC Press.Hagel L.
1998. Gel Filtration Chromatography. Di dalam: Current Protocols in
Protein Science. John Wiley & Sons, Inc.Lehninger, A.L. 1982.
Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta : Penerbit ErlanggaShetty K,
Paliyath G, Pometto A, Levin RE. 2006. Food Biotechnology Edisi 2.
Suite: Taylor and Francis Groups.Watson, David G. 2005. Analisis
Farmasi Edisi 2. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC