Métodos en Biología, Seminarios
Curso 2009/10
Aplicaciones generales
Observación
Examen
Descripción
Comparación
Representación
Gráfica
Fotográfica/Vídeo
3-D
Rango de resoluciónde los microscopios
Rango de resolución de los microscopios
Lupa estereoscópica
Microscopioóptico
Microscopioelectrónico
Usos de la lupa estereoscópica Observación macroscópica
Reconocimiento taxonómico
Disecciones
Ventajas: Preparación sencilla
Trabaja a bajo aumento
Con amplitud de campo
Crea imágenes tridimensionales
Usos del microscopio óptico Observación de órganos, tejidos, células y orgánulos
Tipo de Microscopio Fundamento Uso
Campo claro Observación directa ampliada de la
muestra. Se visualiza según las
diferencias de absorción
El más sencillo y más utilizado. Permite ver colores originales y
tinciones histológicas. Se pueden incluir filtros para aumentar el
contraste
Campo oscuro Observación de luz dispersada por la
muestra
Muestras transparentes y/o vivas. Hay que iluminar mucho la
muestra. Útil para análisis cuantitativos
Contraste de fases Basado en los cambios del índice de
refracción de la luz al atravesar una
muestra. Convierte diferencias de fase
en diferencias de intensidad
Muestras transparentes y/o vivas. Observación de ciclos celulares y
orgánulos (mitocondrias, lisosomas, cromosomas, nucléolos, etc.). Si
hay pared celular, se debe incluir la muestra en un medio con índice
similar
Contraste diferencial
de interferencia
(Nomarsky)
Basado en la interferometría. Ofrece
una imagen en relieve, de acuerdo a los
cambios de absorbancia de la muestra
Como anterior, pero se intensifica el contraste, al evitarse el halo que
rodea la muestra. Se puede medir el índice de refracción de un
material
Polarización Basado en la birrefringencia,
consecuencia de la organización de
algunas moléculas
Estructuras moleculares largas, paralelas o apiladas, con una
orientación (células musculares, colas de espermatozoides,
cloroplastos, bastones, cadenas de ADN, huso mitótico)
Fluorescencia Basado en la absorción de luz por un
fluoróforo y su emisión en otra longitud
de onda
Detección de cantidades mínimas de algún material (anticuerpos,
histonas, actina, miosina); visualización de componentes de difícil
observación y determinación de su orientación (ácidos nucleicos);
detección de anomalías (bandas cromosómicas)
Usos de diversos microscopios ópticos
Microscopía de campo claro Microscopía de contraste de fases
Microscopía de interferencia Microscopía de campo oscuro
Preparación de muestras permanentes Fijación:
El fijador inmoviliza, mata y preserva las células, las hace más permeables a los colorantes y establece puentes cruzados entre sus moléculas, de manera que quedan estabilizadas y bloqueadas en su posición original.
Fijadores: alcohol, aldehídos activos (formaldehído, glutaraldehído).
Inclusión Se incluyen en un medio que ofrezca consistencia (ceras, resinas).
Sección Los tejidos suelen ser cortados en finas rebanadas (secciones). Por
ejemplo, con un microtomo (10-5-10-6m). Se suelen extender en un portaobjetos. (Sección por congelación: utiliza un criostato - microtomo en cámara
fría. Evita los pasos anteriores).
Extensión Sobre un portaobjetos. El uso de cubreobjetos evita la desecación, el abarquillamiento de la
muestra y que la superficie líquida actúe como lente.
Microscopio de campo claro
Larva nauplius
de balano
Alga verde filamentosa Spirogyra Link, 1820
Ojo de hámster
Amoeba proteus (Pallas, 1766)
Microscopio de campo claroConductos colectores de la orina, riñón
(hematoxilina y eosina)
Sección de raíz
(safranina y verde rápido)
Tinción
Colorantes orgánicos (verde malaquita, negro Sudán, azul de Coomassie). Algunos tienen una afinidad específica por ciertos componentes celulares (p.e. hematoxilina con moléculas con carga negativa).
Colorantes cada vez más específicos, según se ha ido conociendo la química celular.
Colorantes cualitativos, fluorescencia. Por ejemplo, fluoresceína, rodamina.
Microscopio de campo oscuro
Amoeba proteus (Pallas, 1766)
Larva nauplius
de balano
Foraminíferos
Células sanguíneas
humanas
Microscopio de campo oscuro Se puede producir un pseudo-
campo oscuro sin necesidad de tener los accesorios apropiados; sólo moviendo el diafragma y el condensador.
Pluma de ave
Microscopio de contraste de fasesCélula epitelial
Alga
diatomea
Amoeba proteus (Pallas, 1766)
Microscopio diferencial de interferencia
Rotífero
Miocito de corazón de ratón adulto
(contraste de fase y diferencial de interferencia)
Amoeba proteus (Pallas, 1766)
Microscopio de polarización
Rodilla de vaca, red de colágeno en cartílago
Perforaciones en membranas
externas de la diatomea
Triceratium favusEhrenberg, 1840
Pelo de mamífero
Piel de cebolla
Microscopio de fluorescencia
Tinciones fluorescentes
Proteínas celulares fluorescentes
Célula en mitosis
Se han observado tres elementos fluorescentes: microtúbulos en verde, centrómeros en rojo, ADN en azul
Microscopio de fluorescencia
Nanopartículas fluorescentes o puntos cuánticos
(cristal)
Tinciones fluorescentes y nanopartículas
Proteína nuclear en verde (Alexa 488) y microtúbulos en rojo (nanopartículas con estreptavidina)
Anticuerpo primario
Anticuerpos secundarios
Inmunofluorescencia
Microscopio de fluorescencia
Microscopio de fluorescencia
Célula cancerígena humana en división
ADN en azul, proteína del centrómero en verde, microtúbulos en rojo
Célula endotelial de arteria pulmonarde vaca
Núcleo en azul (DAPI), microtúbulos en verde (anticuerpo unido a FITC), filamentos de actina en rojo (faloidinaunida a TRITC)
Microscopio electrónico de transmisión
Microscopio de fluorescencia(Antitubulina fluorescente)
Microscopio de fluorescencia
Usos del microscopio electrónico Observación de órganos, tejidos, células, orgánulos y moléculas
Reconocimiento de patologías, virus, nanopartículas, etc.
Tipo de Microscopio Inglés Fundamento Uso
Transmisión
(MET)
Transmission
(TEM)
La imagen es formada por
los electrones que atraviesan
la muestra
Muestras <2·10-7 m
Transmisión Barrida
(METS)
Scanning
Transmission
(STEM)
Como MET, pero se va
barriendo una cuadrícula
Muestras <2-7·10-8 m
Bajo Voltaje
(MEBV)
Low Voltage
(LVEM)
Como MET, pero, al trabajar
con un voltaje menor, se
mejora de forma significativa
el contraste de los elementos
más claros
Muestras <2·10-8 m
Barrido
(MES)
Scanning
(SEM)
La imagen es formada por
los electrones emitidos por la
muestra
Cualquier tipo de
muestra. Ofrece
tridimensionalidad,
pero menor resolución
Lámina de oro
Átomos a 0.2·10-9m
Preparación de muestras para ME Muestras grandes (órganos, tejidos, células)
Fijación:
Glutaraldehído (une proteínas)
Tetróxido de osmio (une bicapas lipídicas y proteínas)
Alternativamente, criofijación
Inclusión:
Resina monomérica (metacrilato de metilo)
Alternativamente, inclusión de resina en frío (criosustitución)
Sección:
Ultramicrotomo (secciones inferiores a 2·10-7m)
Alternativamente, criofractura
Polimetacrilato de metilo
Preparación de muestras para ME
Muestras grandes (órganos, tejidos, células)
Réplica o sombreado metálicos
Usos del METSistema nervioso,
axones de neuronas con mielina (células de Schwann)
Sección de corazón de rata
Arriba, MET; Abajo, MEBV
Usos del MES
Estereocilios de una célula pilosa del oído interno de la rana toro
A: MES; B: Microscopio diferencial de interferencia; C: MET
Preparación de muestras para ME Muestras pequeñas
(macromoléculas, moléculas)
Réplica metálica
Tinción negativa o contraste negativo:
Sal de metal pesado (p.e. sal de ácido fosfotúngstico, yoduro de cadmio, uranil acetato).
La imagen es el resultado de la intensidad relativa del haz electrónico en cada punto, que es proporcional al grosor de la película opaca.
Empleado con éxito en bacteriófagos, virus y proteínas.
Cadenas helicoidales de moléculas globulares de actina
Preparación de muestras para ME Muestras pequeñas
(macromoléculas, moléculas)
Crio-electromicroscopía
Crio-EM de GroEL
(Escherichia coliMigula, 1895)
Hibridos de ARN y ADN en
disolución
Filamentos de ADN extraídos del bacteriófago T4
Campo oscuro
Preparación de muestras para ME Muestras pequeñas
(macromoléculas, moléculas)
Immunogold (puntos negros / nanopartículas)
Localización de cuatro proteínas del cuerpo polar del huso en levadura
Representación gráfica
Mano alzada
Cámara lúcida o tubo de dibujo
Representación fotográfica/vídeo Cámaras
Objetivos digitales
Pantallas de vídeo (ME)
Representación fotográfica/vídeo Falso coloreado (ME)
Arteria con célulassanguíneas
Polen de Amaranthaceae
Bacilo Vibrio vulnificus
Farmer, 1980
Representación 3-D Microscopio óptico
Deconvolución
Cromosomas politenos de
Drosophila Fallen, 1823
Representación 3-D
Microscopio óptico
Confocalización (fluorescencia)
Estado de gástrula de
Drosophila Fallen, 1823
Grano de polen de
flor de la pasión
Representación 3-D
Reconstrucción de unamitocondria de levadura
Microscopio óptico y electrónico
Reconstrucción a partir de secciones
Reconstrucción de la cápsula proteínica del virus de la Hepatitis B
Reconstrucción de única partícula (ME)
Representación 3-D Microscopio electrónico
Tomografía electro-microscópica (EM), o crio-electrónica (CE)
Complejo de Golgi
Complejoproteínicode la cubiertade un retrovirus
Aplicaciones de Microscopía en BiologíaMétodos en Biología, Seminarios
Curso 2009/10