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Transcript
La longitud de onda determina el color de las cosas
FluorescenciaLUZ VISIBLE
Excitación ===============Emisión
FLUORESCENCIA
¿Qué es?
Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el cual un material absorbe radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido.
¿Cómo se produce?
Los electrones son excitados a estados
vibracionales y rotacionales más altos y cuando
vuelven a su estado fundamental emiten la energía
de excitación en forma de radiación.
¡La cantidad de luz emitida es muy pequeña en
comparación con la utilizada para la excitación!
Fluorescencia y Fosforescencia
Tiempo de excitación
Cantidad de luz emitida
Duración de la emisión
Fluoróforos y Fluorocromos
Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda).
Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.
Tipos de Fluorescencia
La fluorescencia primaria:
Es la que se da porque existe una configuración inherente a la estructura molecular.
Se presenta en muchos sistemas aromaticos
La fluorescencia secundaria:
Ocurre cuando una molécula específica o un grupo capaz de fluorescer un fluorocromo, se introduce en la estructura de la muestra.
Uso de la microscopía de fluorescencia:1) El objetivo principal es la identificación de una
sustancia específica observando sus propiedades características de emisión cuando se ilumina con radiación de longitud de onda apropiada.
2) La determinación de parámetros específicos propios de la muestra, que son resultado de la preparación de la misma, que influyen en la fluorescencia de un fluorocromo específico en un material dado.
3) Otro objetivo es el barrido localizado de una muestra para determinar la distribución de los Fluorocromos que contiene, que es la microscopía de barrido confocal.
FUENTES DE LUZ
La elección de la fuente de luz depende del fluorocromo que se investiga, según sus necesidades de excitación.
Lámparas de mercurio a alta presión
Lámparas de xenón a alta presión:
Con el filtro de excitación seleccionamos la parte del espectro que utilizaremos para excitar la muestra.
La muestra emite fluorescencia en un espectro distinto al de excitación y al mismo tiempo refleja parte del espectro utilizado para la excitación.
El filtro barrera se encarga de eliminar la parte del espectro reflejado y nos permite visualizar el espectro de emisión correspondiente al fluorocromo
1. La lámpara emite luz en todo el espectro.
2. El filtro de excitación sólo deja pasar la parte del espectro necesaria para excitar la muestra.
3. El espejo dicroico refleja hacia la muestra la excitación correspondiente.
4. La muestra se excita con la luz que le llega y emite en un espectro superior al de la excitación.
5. El espejo dicroico transmite la emisión de la muestra.
6. El filtro barrera hace una selección exacta del espectro de emisión que nos interesa.
APLICACIONES
Se aplica a la determinación cuantitativa de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y muchos Fluorocromos celulares (para ello se utiliza un fotómetro que mide la intensidad de la fluorescencia de una región específica de la muestra).
Célula PtK2: Fotografía de sistema de micro túbulos
Equipo 2
Rocío Regalado Villagómez
Joel Grimaldo Velázquez
Omar Pastor Islas Bayona
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