Translate Amd13

8/19/2019 Translate Amd13

1/32

Ageing-associated changes of lysosomal compartment -

implications on cellular functions

ABSTRACT

Kompartemen lisosom adalah situs utama untuk degradasi intraseluler. Degradasi lisosom

konstituen sel sendiri, disebut autophagy, tidak hanya menyediakan sel dengan nutrisi, tetapi juga menghilangkan struktur endogen yang rusak dan berpotensi berbahaya, sehinggamengamankan homeostasis intraseluler. Di sisi lain, lisosom telah terbukti terlibat dalamtahap awal apoptosis, dan efek perlindungan dari autophagy telah disarankan untuk beralih kekematian sel ketika berlebihan.

Perubahan-Penuaan terkait struktur selular result dari kerusakan yang disebabkan oleh spesiesoksigen reaktif ( !"#, yang merupakan terelakkan oleh-produk dari kehidupan aerobik.!mset intraseluler organel terganggu dan makromolekul, yang lisosomal degradasimerupakan kontributor utama, tidak berfungsi sempurna, bahkan di bawah kondisi yang

menguntungkan. ini melekat ketidaklengkapan degradasi lisosomal bertanggung jawab atasakumulasi dari berbagai non-terdegradasi dan fungsional tidak efisien struktur, yang dapatdianggap biologis $sampah$. %iologis $sampah$ meliputi rusak makromolekul non-terdegradasi dan organel, serta struktur polimer-seperti non-degradable intralysosomaldisebut lipofuscin, atau usia pigmen. &eskipun akumulasi biologis $sampah$ telahdisarankan berbahaya, sedikit yang diketahui tentang mekanisme yang merusak efek.

'ntuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik dari perubahan-penuaan terkait lisosomalyang kompartemen dan pengaruh mereka pada fungsi sel, kami fokus pada belajar ()# peranmacroautophagy dalam omset organel dan lipofuscin pembentukan* (+# peran biologis$sampah$ akumulasi di pengembangan perubahan-penuaan dan kematian terkait akhirnya-

pertumbuhan ditangkap, sel postmitotik-seperti* ( # efek sel-protektif kemungkinan mitosis*( # pengaruh lipofuscin pada kelangsungan hidup sel selama kelaparan lengkap* dan ( # efek lipofuscin pada stabilitas lisosom.

"ebagai model induksi biologis $sampah$ akumulasi kami menggunakan konfluen fibroblastmanusia diperlakukan dengan autophagy pada inhibitor -methyladenine ( &A#. Atau,degradasi lisosomal ditekan dengan menggunakan sistein leupeptin P/, atau cathepsin Dinhibitor pepstatin A. "ebagai model selular sel tua, kami menggunakan lipofuscin-loaded

manusia fibroblas. 0ipofuscin-loading dicapai oleh kultur konfluen fibroblas dalam kondisihipoksia selama +- bulan. Dengan menggunakan in 1itro model, penelitian ini menunjukkan


2/32

bahwa ()# penghambatan hasil autophagy di akumulasi bahan autofluorescent lisosom terkaitdan mitokondria dengan potensi membran rendah* (+# efek yang merugikan dari biologis$sampah$ akumulasi penghambatan berikut autophagy adalah dicegah dengan pembelahan selyang terus menerus* ( # sel lipofuscin-loaded lebih tahan terhadap kematian sel kelaparan

diinduksi dari sel kontrol* ( # lisosom fibroblas lipofuscin-loaded yang lebih tahan terhadaporganel-ditargetkan stres maka lisosom sel kontrol.

%erdasarkan hasil penelitian ini kami menyimpulkan bahwa benar beroperasi mesinautophagic memainkan peran penting dalam mencegah perubahan yang berkaitan dengan usiaterkait dengan akumulasi biologis $sampah$. Kami juga menyarankan bahwa proliferasiterus-menerus adalah mekanisme alami di mana sel-sel mengatasi akumulasi bahan non-degradable, menggunakan cairan mekanik selama pembelahan sel. Akhirnya, kamimemperkenalkan ide lipofuscin menjadi agen hormetic, dan mungkin memiliki beberapalisosom-menstabilkan properti. Pemahaman yang lebih baik dari pengaruh usia-terkait

akumulasi biologis $sampah$ pada fungsi selular mungkin dapat membantu untuk pembangunan masa depan anti-penuaan terapi dan pengelolaan usia- patologi terkait.


3/32

ABBREVIATIONS

3MA -methyladenineAMC 2-amino- -methyl-coumarin

ANOVA analysis of 1arianceAO acridine orangeBrDU bromodeo3yuridineGAPDH glyceraldehyde- -phosphate dehydrogenaseHsp heat-shock proteinLAMP lysosome-associated membrane proteinLDH lactate dehydrogenaseM6PR mannose 4-phosphate receptor MSDH O -methyl-serine dodecylamide hydrochlorideNADH nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form#

NAG 5-acetyl-D-glucosaminidaseNzQ ,6-dihydro3y-), -naphtho7uinonePBS phosphate buffered salinePCD programmed cell deathPI3K phosphatidylinositol -kinasePI propidium iodideROS reacti1e o3ygen species

Tor target of rapamycin


4/32

INTRODUCTION

Lysosomes

Ge er!" #e!$%res

0isosom yang umumnya didefinisikan sebagai organel membran-terikat mengandung banyak en8im hidrolitik dengan akti1itas en8im optimum pada asam p9. Karakterisasi lisosomsebagai organel sub-seluler diskrit adalah pertama diuraikan pada tahun ): ) (%erthet et al.,): )#, dan istilah itu sendiri diciptakan pada ): (de Du1e dkk., ): #. 0isosom hadir disemua eukariotik benar sel, menempati ;, -) < dari 1olume sel, dan terkonsentrasi dekatdengan mikrotubulus pengorganisasian pusat (&atteoni dan Kreis, ):62* =ambar )#.">%'A9 berbagai en8im litik, termasuk protease, nucleases, lipase, fosfatase, danglycosidases, adalah alasan utama penamaan ini asam organel lisosom, yaitu partikel litik (deDu1e dkk., ): #. Degradatif kapasitas dan rendah p9 intra-organel fitur khas lisosom (deDu1e dan ?attiau3, ):44#. 0isosom p9 disediakan oleh fungsi 1acuolar 9 @ A Pase, pompayang translocates proton dari sitosol ke lisosom yang (!hkuma et al, ):6+*. %owman et al,):66.#, dan dipertahankan sekitar p9 , B ;, ( eijngoud dan ager, ):2 * !hkuma danPoole, ):26#. Kondisi asam, yang sangat diperlukan untuk akti1itas optimal en8im lisosom,memungkinkan denaturasi protein mengalami degradasi membantu efisiensi proses

proteolitik.

'kuran lisosom berkisar antara sekitar ;, dan + mikrometer (=ambar )%#, dan tergantung pada konten mereka dan tahap Proses degradasi lisosom (0u8io et al., +;; #. lisosom yangmembran diperkaya dalam glikoprotein membran integral, yang dianggap bertanggung jawabuntuk ketahanan lisosomal diri degradasi dari dalam (?inchester, +;;)#. &eskipun jugaasam, endosomes bertanggung jawab untuk pengiriman bahan endocytosed ke kompartemenlisosomal, dan dirampas lisosom terkait spesifik protein membran (lampu* >skelinen, +;;4*=ambar )A#.


5/32

Gambar 1 . Fluorescent (A) dan elektron (B) mikroskop dari lisosom dalam fibroblasmanusia. Dalam (A) lisosom adalah immunostained untuk lisosom terkait protein membran(LAMP-2). L lisosom! Mt mitokondria! " inti. Bar skala 2# m (A) dan 2 m (B).

Citur lain yang penting yang membedakan lisosom dari endosomes adalah tidak adanyareseptor manosa 4-fosfat (&4P s# dan daur ulang reseptor membran plasma (Kornfeld dan&ellman, ):6:*. 0u8io et al, +;;)#.

B&o'e es&s o# "ysosomes

"tudi terbaru dari %iogenesis lisosom telah mengungkapkan dinamis kompleksitaskompartemen lisosomal, dan menentang mendominasi dengan pandangan lisosom sebagaiorganel degradatif terminal statis jalur endocytic di sel hewan (0u8io et al., +;; #. heendocytosed bahan pertama dikirim ke endosomes awal, kemudian endosomes terlambat dan,akhirnya, lisosom (&ellman, )::4*. &ukherjee et al, )::2#. 'ntuk menjelaskan mekanisme

penyampaian materi endocytosed dari endosomes terlambat untuk lisosom, hipotesis yang berbeda telah diusulkan. Pematangan, sebelumnya mengaku sebagai mekanisme yang masuk akal dari lisosom %iogenesis (&urphy, )::)#, biasanya terjadi pada akhir jalur endocytic, dantidak dianggap sebagai sarana utama penyampaian materi ke lisosom (0u8io et al., +;; #.

Gambar 2 . Model tentatif dari lisosom Bio$enesis. Didalam model hipotesis dari perpaduanlan$sun$ antara endosomes akhir dan lisosom di$unakan. % endositosis! 2 mannose &-reseptor fosfat terkait perda$an$an 'esikular! pen erapan bahan sitosol. *Dimodifikasidari Lu+io et al 2## Mol membr Biol 2#,. % %- /

&ekanisme lain, yang disebut transportasi 1esikular, sebagian besar hadir dalam jalur sekretori dan endocytic (&ellman dan ?arren, +;;;#, dengan sedikit bukti untuk lalu lintas


6/32

seperti antara endosomes akhir dan lisosom. iuman dan menjalankan $hipotesis ("torrie danDesjardins, )::4# menggunakan ide dari diulang sementara fusi dan fisi proses antara duaorganel. Atau, fusi lengkap akhir endosome dan hasil lisosom dalam pembentukan organelhybrid ( erah et al, )::2*. =ambar +# dengan kualitas menengah antara endosomes akhir dan

lisosom (&ullock et al., )::6#. Kondensasi berikutnya dari konten dan penghapusanmembran yang berlebihan oleh operator 1esikular mengarah pada re-pembentukan lisosomdari organel hybrid (Pryor et al., +;;;#. Dengan cara ini, fungsi organel hybrid sebagaiorganel pencernaan atau $perut sel$ (=riffiths, )::4#, dan lisosom dipandang sebagai organel

penyimpanan untuk asam hidrolase (0u8io et al., +;; #. Atau, lisosom dapat sekering denganautophagosomes dengan pembentukan phagolysosomes auto, yang juga merupakan situsuntuk degradasi intraseluler.

(% )$&o s o# "ysosomes

Degradasi baik material ekstra dan endogen berasal telah dianggap sebagai fungsi utama darilisosom (de Du1e dan ?attiau3, ):44#. Keterlibatan lisosom di degradasi endocytosed ser1is

bahan tujuan sebagian besar gi8i, sedangkan degradasi konstituen sel sendiri, autophagysocalled, juga mengamankan homeostasis intraseluler melalui penghapusan struktur molekulrusak dan berpotensi berbahaya dan organel (Klionsky, +;; #. /ni juga telah menunjukkan

bahwa kompartemen lisosomal adalah terlibat dalam signaling sel (&iac8ynska et al., +;; #,terutama inisiasi kematian sel (Cerri dan Kroemer, +;;)#.

/de keterlibatan lisosom kematian sel, tinju disarankan oleh de Du1e dan ?attiau3 ():44#,telah mendapat dukungan dari penelitian yang menunjukkan bahwa lisosom destabilisasiadalah peristiwa yang memicu kematian sel yang diinduksi oleh berbagai faktor sepertiradiasi, stres oksidatif, "taurosporine-pengobatan, paparan agen lysosomotropic danteroksidasi low-density lipoprotein (Euan et al, )::2*. %runk dan "1ensson, ):::* oberg etal, ):::*.. 0i et al, +;;;* Fohansson dkk., +;; * Persson dkk., +;; #. Fenis kematian sel,diinduksi oleh lisosom destabilisasi, tergantung pada derajat lisosom kerusakan dengannekrosis menjadi hasil dari rilis yang luas dari lisosom konten, dan apoptosis maju karena

pecah moderat lisosom (%runk et al, +;;)*.. Ghao et al, +;; #.

A%$op*!'y

De+ &$&o ! , )*!r!)$er&s$&)s

Autophagy (juga disebut auto fagositosis# adalah e1olusi dilestarikan jalur selular untuk degradasi protein berumur panjang dan organel (Klionsky, +;; #. Kata autophagy berasal dari

bahasa Eunani dan berarti untuk makan diri. Cenomena autophagy terjadi di berbagaieukariotik organisme dari ragi untuk mamalia selama kelaparan, sel dan jaringan

pengembangan, dan kematian sel (0e1ine dan Klionsky, +;; * =ambar #. Di sel mamalia,tiga jenis autophagy diakui tergantung pada cara penyampaian materi mengalami degradasi


7/32

ke lisosom, dan termasuk macroautophagy, microautophagy dan pendamping-dimediasiautophagy (Klionsky dan >& , +;;;* uer1o, +;; #.

&acroautophagy memainkan peran utama dalam degradasi intraseluler dan sering digunakansebagai sinonim untuk autophagy (Eoshimori, +;; #. "elama macroautophagy, bagian darisitoplasma, dan bahkan seluruh organel, yang diasingkan dalam organel ganda membrandisebut autophagosome. "eperti itu organel dikenakan sejumlah perubahan berikutnyatermasuk transformasi membran, pengasaman, dan, akhirnya, fusi dengan lisosom atau akhir endosomes, dan pembentukan autophagolysosome dari amphistomes, masing-masing(Cangsrud et al, +;; *. =ambar +#. &eskipun macroautophagy adalah umumnya dianggapsebagai proses non-selektif ("eglen et al., )::;#, telah ada laporan telah autophagy selektif

peroksisom dan mitokondria (Eokota, ):: * 0emasters, +;; #. Asal usul dan sifat dariautophagic yang membran eksekusi (phagophore# masih menjadi bahan diskusi yang sedang

berlangsung dengan dua alternatif yang dipertimbangkan untuk pembentukan phagophore

baik oleh de no1o sintesis, atau dengan pemanfaatan membran sitoplasma yang sudah ada(Cengsrud et al., +;; #.

Proses ketika lisosom menyerap komponen sitoplasma di in1aginations membran lisosomdidefinisikan sebagai macroautophagy (Dice, +;;;#. Pencernaan bahan diinternalisasi terjadisetelah hilangnya membran 1esikel. &acroautophagy menyumbang degradasi peroksisomdan beberapa protein sitosol ("ubramani, )::6:#.

Gambar 3 . 0lektron mikro$raf dari fibroblast manusia menun1ukkan 'akuola autopha$ic(A ). Autopha$ diinduksi oleh paparan M3D3 deter1en l sosomotropic pada konsentrasi 2uM selama menit. Mt mitokondria! " inti. 3kala bar 2 m.


8/32

Pendamping-dimediasi autophagy adalah jalur selektif bertanggung jawab untuk degradasi protein sitosol tertentu setelah transportasi langsung melalui lisosomal membran dengan carachaperone molekul ( uer1o dan Dadu, )::6* Dadu, +;;;* uer1o, +;; #. Protein yangdipilih untuk jenis autophagy, mengandung urutan asam amino tertentu (KC> H lisin

fenilalanin-glutamat-arginin-glutamin#, yang diakui oleh protein pendamping jenis heatshock, dan diangkut ke lisosom terkait membran jenis protein +a (0A&P-+a# untuk translokasi ke dalam lumen lisosom ( uer1o, +;; #.

Re'%"!$&o

Autophagy adalah proses terus berlangsung, bahkan di bawah yang normal hadir kondisi, dandiatur oleh agen yang berbeda. &ekanisme regulasi macroautophagy dipahami lebih baik dari

peraturan jenis lain autophagy. !leh karena itu, mekanisme regulasi, singkatnya dijelaskandalam ini tesis, yang bersangkutan sebagian besar macroautophagy, meskipun disebut sebagaiautophagy.

Kekurangan gi8i adalah inducer kuat autophagy, sementara asam amino, menjadi produk akhir dari degradasi autophagic protein, bertindak sebagai negatif regulator umpan balik (%lommaart et al., )::2#. &erupakan bagian penting dari nutrisi regulasi tergantung jalur adalah serin I treonin kinase or (target rapamycin#. Penghambatan or oleh rapamycinmenginduksi autophagy bahkan di Kehadiran asam amino (%lommaart et al., ):: #.&eskipun sebenarnya &ekanisme regulasi asam amino akti1itas or belum dipahami, telah

menunjukkan bahwa akti1asi or oleh nutrisi menginduksi fosforilasi protein yang terlibatdalam langkah awal autophagy, sehingga pembongkaran dan penghambatan autophagymereka (0e1ine dan Klionsky, +;; * &eijer dan odogno, +;; #. or juga telah ditemukansensitif terhadap deplesi A P (Dennis et al., +;;)#.

"elain nutrisi, autophagy juga diatur oleh beberapa hormon terutama insulin dan glukagon.Akti1asi menginduksi reseptor insulin kegiatan kelas / phosphatidylinositol- -kinase (P/ K#,dengan konsekuensi akti1asi kaskade en8im menengah, akhirnya mengakibatkanupregulation or dan penghambatan autophagy (0e1ine dan Klionsky, +;; #. Ada juga telahdijelaskan reseptor insulin or-independen terkait jalur, akti1asi yang menghasilkan

penghambatan autophagy ("aeki et al., +;; #. =lukagon, di sisi lain, mengaktifkan autophagydengan menghambat or melalui terkait &ekanisme protein kinase (Kimball et al., +;; #.

Di antara regulator yang berbeda dari autophagy, perhatian khusus diberikan untuk kelas ///P/ K. Akti1asi en8im ini diperlukan untuk penyerapan, awal langkah autophagy (Petiot et al.,+;;;#. &eskipun sejumlah tambahan protein, seperti protein = heterotrimeric, as, proteinkinase A dan %, dan lain-lain, di mana ditampilkan untuk mengatur autophagy, peran danmekanisme mereka tindakan belum dipahami dengan baik (0e1ine dan Klionsky, +;; *&eijer dan odogno, +;; #.


9/32

A%$op*!'y ! , )e"" ,e!$*

Kematian sel terprogram (P D# memainkan peran penting dalam pemeliharaan organismehomeostasis dengan mengendalikan jumlah sel dan menghapus sel-sel abnormal (%aehrecke,

+;;+#. Atas dasar morfologi, tiga jenis kematian sel telah dijelaskan ("chweichel dan &erker,):2 * %aehrecke, +;; #. ipe / P D (atau apoptosis klasik#, ditandai dengan seluler

penyusutan, kromatin kondensasi dan fragmentasi inti, membran blebbing, dan terperosok berikutnya sel mati oleh sel atau makrofag khusus tetangga (Kerr et al., ):2+#. iri khas daritipe // P D (atau kematian sel autophagic# adalah kehadiran dari autophagosomes danautophagolysosome (!gier-Denis dan odogno, +;; * %ursch, +;; * >dinger dan hompson,+;; #, yang merupakan pelaksana diri degradasi. ipe /// (juga disebut non-lisosomal#kematian sel mirip nekrosis karena melibatkan pembengkakan organel dan lysosome-

pembentukan independen $ruang kosong$ dalam sitoplasma (0eist dan FJJttelJ, +;;)*

%aehrecke, +;; #. 5amun, perbedaan antara berbagai jenis P D terkadang sulit untuk membuat. Dengan demikian, ada penelitian yang menunjukkan bahwa 1acuolisationautophagic mendahului apoptosis klasik ('chiyama, +;;)*. =on8ale8-Polo et al, +;; #, danyang kedua jenis P D dapat diamati dalam sel yang sama (%ursch, +;; #.

/mplikasi dari autophagy di apoptosis telah dijelaskan oleh yang berbeda mekanisme. Dengandemikian, autophagy ditemukan untuk menyerap seperti pro-apoptosis faktor sebagaisitokrom c dan A/C, yang dirilis ke sitosol selama permeabilitas transisi mitokondria ( akano-!hmuro et al, +;;;*. >lmore et al., +;;)#. emuan tersebut menyebabkan saran bahwaautophagy terutama adalah respon kelangsungan hidup sel untuk apoptosis rangsangan, dan

P D diaktifkan bila autophagy kelebihan beban (0emasters et al., )::6#. /de ini konsistendengan pengamatan bahwa autophagy cukup aktif memiliki efek menguntungkan padakelangsungan hidup sel, tetapi beralih ke sel bunuh diri ketika berlebihan (>dinger dan

hompson +;; * =o8uacik dan Kimchi +;; * 0ockshin dan Gakeri, +;; #.

ipe // P D dianggap fenomena lama filogenetis (%ursch, +;;)#, dan ditemukan di keduanegara fisiologis dan patologis (!rier- Denis dan odogno, +;; #. %ahkan ada saran yang selautophagic kematian e1olusi didahului apoptosis ("chwart8 et al., ):: #. autophagic P Dterutama diaktifkan bila ada kebutuhan sel besar eliminasi, misalnya selama pengembangandan reno1asi jaringan. /tu Karakteristik penting dari tipe // P D, yang membedakannya dariapoptosis, adalah autophagy yang menghilangkan sebagian besar sitoplasma sebelum

perubahan nuklir muncul. &ekanisme ini menjamin kemungkinan penghapusan autophagicdari konstituen yang rusak pada tingkat sub-seluler, melanjutkan ke penghapusan seluruh sel

jika kerusakan tidak pantas diperbaiki (%ursch, +;; #.

A'e& '


10/32

De+ & ' !'e& '

Keberadaan berkepanjangan mayoritas sistem yang kompleks, termasuk yang biologis, yang

pasti disertai dengan penuaan. "eperti dilihat oleh ahli biologi, proses terkait kehidupan penuaan dimulai pada saat pembuahan dan terus sampai mati (%alcombe dan "inclair, +;;)#.&enurut Perpustakaan 5asional of &edicine dan 5ational /nstitutes of 9ealth, penuaanadalah dianggap sebagai $perubahan ire1ersibel bertahap dalam struktur dan fungsi dariorganisme yang terjadi sebagai akibat dari perjalanan waktu $. Perubahan ini umumnyadipandang sebagai berbahaya, penurunan fungsi normal dan adaptasi, dan sekaligusmeningkatkan kemungkinan kematian ( omfort, ):2:#.

&engenai penuaan selular, atau penuaan, penekanan biasanya pada penurunan kemampuanuntuk berkembang biak sebagai akibat dari baik melebihi proliferasi %atas (penuaanreplikatif* 9ayflick, ):4 * %lackburn, +;;;* ?einert dan imiras, +;; # atau stres seluler (stress penuaan* oussaint et al,. +;;+* ampisi, +;; * /tahana et al., +;; #. Dalam tesis ini,

penuaan selular dianggap sebagai perubahan fungsi dan struktur yang terjadi dalam selindi1idu dengan berlalunya waktu.

O-&,!$&.e s$ress ! , )e""%"!r !'e& '

Dari berbagai teori diperkenalkan dalam rangka untuk menjelaskan mekanisme penuaan(&ed1ede1, )::;#, ada teori tunggal yang berlaku umum. Antara teori-teori yang diperoleh

paling menarik perhatian adalah teori radikal bebas dari penuaan diusulkan oleh 9arman(): 4#. &enurut teori ini, penuaan terkait Perubahan struktur seluler result dari kerusakanyang disebabkan oleh sangat reaktif agen, yang disebut radikal bebas dan didefinisikansebagai atom atau molekul mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan.&olekul tersebut atau ion, dibentuk sebagai akibat dari tidak lengkap pengurangan satuelektron dari oksigen, secara kolektif disebut spesies oksigen reaktif ( !"#, dan merupakanterelakkan oleh-produk dari kehidupan aerobik (%eckman dan Ames, )::6* adenas danDa1ies, +;;;#. 9ipotesis 9arman didukung oleh penelitian yang menunjukkan penuaan yang

dipercepat dalam kondisi stres oksidatif, yang merupakan gangguan dalam keseimbanganantara pro dan antioksidan dalam mendukung mantan (%arja, +;;+#. Di antara sumber endogen !", mitokondria memainkan peran paling penting, karena pembentukan radikal

bebas yang mau tidak mau ditambah dengan mitokondria terkait fosforilasi oksidatif danterjadi bahkan di bawah kondisi yang menguntungkan (9arman, ):2+#.

&eskipun struktur selular dapat menjadi subjek kerusakan !"-diinduksi, penurunanmitokondria dan lisosom fungsi adalah faktor kunci dalam memahami mengapa struktur yangrusak seperti menumpuk (%runk dan erman, +;;+#. Dengan demikian, kerusakan terusmenerus dari hasil mitokondria bahkan decoupling lebih menonjol dari fosforilasi oksidatif

dan kebocoran !". "elain itu, sistem lisosomal dikompromikan tidak dapat secara efektif


11/32

menghapus baik struktur yang rusak secara oksidatif atau sumber mereka merusak, yaitumitokondria yang rusak, mempromosikan stres oksidatif lebih lanjut ( erman et al., +;;4#.

(% )$&o !" )*!r!)$er&s$&)s o# )e""%"!r !'e& 'Pro"er!$&.e )!p!)&$y o# !'e& ' )e""s

Penuaan selular dikaitkan dengan berbagai morfologi dan fungsional keunggulan, dansebagian besar dikaitkan dengan apa yang disebut sel postmitotik, seperti neuron dan miosit

jantung ("achs et al, ):22*. 0a elle dan %uschmann, ):6 * erman dan %runk, +;;4#. Diantara perubahan fungsi sel, penurunan potensi proliferatif adalah fitur utama dari sel

penuaan. 'sia- penurunan tergantung dari proliferasi sel telah dijelaskan oleh telomerememperpendek, diperoleh selama pembelahan sel sebelumnya atau paparan stres faktor yangmenyebabkan kerusakan D5A ( on Gglinicki, +;; *. /tahana et al, +;; #. Atau dengantelomere tergantung pemendekan proliferatif kecacatan, telah menunjukkan bahwa p): IA C-p dan p)4 I P % jalur, dikenal sebagai mekanisme penekan tumor, proliferasi sel juga

berkurang selama penuaan selular ( ampisi, +;;)* /tahana et al, +;; #.

A%$op*!'y ! , !'e& '

Karakteristik fungsional lain penuaan selular adalah autophagic menurun degradasi ( uer1odan Dice, +;;;* %ergamini et al, +;; .#, dan ditambah dengan itu akumulasi progresif bahanfungsional tidak aktif, jadi- disebut $sampah biologis$ ( erman et al., +;;4#. /ni $sampah$,atau intraseluler $buang$ -bahan termasuk rusak non-terdegradasi makromolekul dan organel,terakumulasi baik intralysosomal, karena degradasi en8imatik lengkap, atau e3tralysosomally,sebagai akibat dari penyerapan autophagic rusak. "ejak, mitokondria adalah primer sumber endogen berasal !", daur ulang mitokondria memiliki penting dalam pembentukan danakumulasi $sampah biologis$ (%runk dan erman, +;;+#. &enjadi awalnya hasil dari lengkapdegradasi autophagic, akumulasi $sampah biologis$ akhirnya berkontribusi pada penurunankapasitas degradatif seluler, sehingga membentuk sebuah lingkaran setan ( uer1o dkk.,+;; #.

Ce""%"!r !'e& ' ! , !pop$os&s

Kematian sel merupakan hasil tak terhindarkan dari kehidupan terbatas sel-sel normal.Penuaan memiliki dianggap sebagai pendahulu dari kematian sel, tetapi mekanisme di balik kematian sel penuaan belum sepenuhnya jelas. 9al ini diketahui bahwa kematian sel mungkinterjadi dengan apoptosis atau nekrosis. "ementara apoptosis dianggap sebagai diatur, Prosesdiprogram, diarahkan pelaksanaan $diam$ mati tanpa akti1asi respon inflamasi, nekrosis, di


12/32

sisi lain, adalah pasif, respon merusak kerusakan sel akut, disertai dengan reaksi inflamasiyang ditandai (Kerr et al, ):2+*. ?yllie, )::2#. Perbandingan antara anggota pro dan anti-apoptosis %cl-+ protein keluarga telah dianggap sebagai faktor penting dalam regulasiapoptosis (Adams dan ory, )::6* Antonsson dan &artinou, +;;;#. "el penuaan yang

terbukti resisten terhadap apoptosis (Pereira-"mith dan %ertram, +;;;#. esistensi inimemiliki telah ditemukan berkorelasi dengan peningkatan ekspresi %cl-+ (?arner et al.,)::2# dan akti1itas berkurang dari pelaksana utama apoptosis, caspase- ("paulding et al,):::*.. &arcotte et al, +;; #. /ni juga telah menunjukkan bahwa "el penuaan menahankematian sel terprogram karena ketidakmampuan untuk menekan %cl-+ (?ang, ):: #.Ketidakmampuan penuaan sel untuk menjalani tergantung p apoptosis dalam menanggapikerusakan D5A telah disarankan untuk bertanggung jawab atas pergeseran dalam sel jalur kematian dari apoptosis nekrosis ("eluano1 et al., +;;)#.

A'e& ' ! , *ormes&s

Penuaan umumnya ditandai oleh adaptasi berkurang karena mengumpulkan ketidakcukupanhomeodynamics ( otan, +;; #. elah hipotesis bahwa stimulasi jalur bertanggung jawabuntuk seluler pemeliharaan dan perbaikan akan menghasilkan peningkatan kemampuanadaptasi dan meningkat umur. "tres ringan dalam bentuk dosis rendah agen berbahaya telahterbukti stimulasi sehingga mampu mengaktifkan homeodynamics tanpa menyebabkankematian sel. Cenomena seperti respon adaptif terhadap dosis rendah agen dinyatakan

berbahaya disebut hormesis ( otan dan lark, +;; #. Paparan periode berulang heat shock ringan dilaporkan memiliki menguntungkan efek anti-penuaan, yang berkaitan dengan

peningkatan kadar berbagai heat shock protein, akumulasi berkurang protein teroksidasi, dan

ditingkatkan akti1itas proteasomal mengakibatkan resistensi stres ( otan, )::6* Conagy etal., +;;+* erbeke et al., +;;+#. >fek anti-penuaan pembatasan kalori juga dapat dijelaskandalam hal hormesis, jika intermiten puasa dipandang sebagai contoh dari stres ringan (Ansonet al, +;; *. &asoro, +;; #. Demikian pula, berbagai macam perawatan kimia dan fisik yangterbukti memiliki sifat hormetic ( alabrese dan %aldwin, +;;;* 0e %ourg dkk., +;;;* 0e%ourg, +;;)#.

L&po#%s)&

B!s&) #e!$%res

Perubahan morfologi selama proses penuaan sel termasuk pembentukan pigmen berwarnakuning kecoklatan, dengan khas spektrum luas autofluorescence (Porta, +;;+* =ambar #.Pigmen seperti, ditemukan di dalam lisosom, disebut lipofuscin ( erman dan %runk, +;; *=ambar # ketika usia-terkait, atau ceroid, ketika akumulasi mereka dipengaruhi oleh kondisi

patologis (Porta, +;;+* "eehafer dan Pearce, +;;4#.


13/32

=ambar . lipofuscin terkait autofluorescence pada manusia fibroblas terdeteksimenggunakan mikroskop confocal ( 66 nm laser#. Akumulasi lipofuscin dipercepat olehkultur sel di ;< oksigen selama dua bulan. "kala bar, +; p&.

0ipofuscin yang biasa disebut $pigmen usia$. /ni adalah gabungan struktur polimer, terdiridari cross-linked protein oksidatif diubah dan residu degradasi lipid. 0ipofuscin jugamengandung karbohidrat dan beberapa logam, yang besi adalah yang paling penting, karena

implikasinya di Centon-jenis kimia dan pembentukan radikal bebas ( erman dan %runk,+;; #. Citur yang paling khas dari lipofuscin, meskipun perbedaan yang Komposisi antara

jenis sel yang berbeda, adalah bahwa semua pigmen lipofuscin yang terdegradasi. /nimungkin karena pembentukan struktur polimer seperti kompleks selama silang peptida(Kikugawa et al., ):6:#.


14/32

=ambar . >lektron mikrograf dari fibroblast manusia menunjukkan sejumlah lipofuscinmengandung lisosom (0f#. Akumulasi lipofuscin dipercepat oleh kultur sel di ;< oksigenselama dua bulan. 5, inti. "kala bar, ) m.

Me)*! &sms o# #orm!$&o ! , !))%m%"!$&o

0ipofuscin bisa berasal dari kedua intra (di sebagian besar sel postmitotik# dan bahanekstraseluler, misalnya di makrofag, sel glial dan pigmen retina epitel (%urke dan "kumat8,)::6* "iddi7i dan Peters, ):::#. auto he I bahan phagocytosed dikirim ke lisosom, tetapi

proses degradasi tampaknya inheren tidak sempurna, dan menghasilkan lisosom antar akumulasi produk non-terdegradasi. >ndogen membentuk hidrogen peroksida bebas berdifusimelalui membran lisosom dan menyebabkan radikal kerusakan auto I phagocytosed

biomolekul. "eperti disebutkan sebelumnya, pada lisosom rendah p9 redoks besi aktif

mempromosikan pembentukan radikal hidroksil melalui reaksi Centon, juga menyebabkankerusakan radikal dan meningkatkan resistensi bahan intralysosomal ke lisosom en8imdengan formasi final "truktur terdegradasi, yaitu lipofuscin ( erman dan %runk, +;; *

erman dan %runk, +;;4#.

P*ys&o"o'&)!" e/e)$s

&emiliki hipotesis kerja yang lipofuscin sendiri mungkin berpartisipasi dalam pembentukanradikal bebas mengubah lama mendominasi pandangan lipofuscin sebagai $tidak bersalah$

penanda penuaan selular ( erman dan %runk, +;; #. Demikian, telah menunjukkan bahwa di pigmen retina sel epitel lipofuscin akumulasi mengurangi kapasitas fagositosis ("undelin etal., )::6#. Dalammodel yang sama lipofuscin selular bertindak sebagai fotosensiti8er,terutama ketika gembira dengan cahaya biru, menyebabkan destabilisasi lisosomal dankematian sel (?ihlmark et al., )::2#. /ni juga telah menunjukkan bahwa akumulasi lipofuscinmeningkatkan kerentanan fibroblast untuk oksidatif stres diinduksi kerusakan lisosom dankematian sel berikutnya ( erman et al., ):::#. "elain itu, telah menyarankan bahwa barudiproduksi en8im lisosom adalah salah tempat ke lisosom lipofuscin-dimuat dalam upayaefektif untuk menurunkan lipofuscin, melepaskan diri mereka dari fungsi yang berguna

mereka di dalam lisosom lipofuscin bebas ( erman dan %runk, +;; #. &eskipun disajikan bukti, efek buruk dari lipofuscin belum berlaku umum(Porta et al., +;;+#.


15/32

AIMS O( THE STUD0

ujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mempelajari perubahan-penuaan terkaitkompartemen lisosomal dan pengaruh mereka pada fungsi sel. ujuan khususnya adalahuntuk menentukan

Paper I

- "umber lipofuscin dalam fibroblas manusia

- 0okasi intraseluler struktur lipofuscin seperti mengumpulkan selama penghambatanautophagy

- Peran macroautophagy dalam omset organel dan pembentukan lipofuscin

P!per II

- Peran biologis $sampah$ akumulasi dalam pengembangan penuaan terkait perubahan danakhirnya kematian sel postmitotik

- Kelayakan efek perlindungan dari pembelahan sel

P!per III

- Karakteristik kematian sel berikut kelaparan lengkap- Pengaruh lipofuscin pada kelangsungan hidup sel selama kelaparan lengkap

P!per IV

- >fek lipofuscin pada stabilitas lisosom


16/32

MATERIALS AND METHODS

Ce""s

Penuaan terutama mempengaruhi sel postmitotik berumur panjang seperti neuron dan miosit jantung. Konfluen sel pertumbuhan ditangkap menyerupai postmitotik benar sel dan secaraluas digunakan untuk studi penuaan. Dalam penelitian ini, manusia Cibroblas A=-) )6 (yangdiperoleh dari oriell /nstitute, amden, 5F, '"A* &akalah /-/ # dan astrosit '-))4; =(hadiah semacam Profesor %engt ?estermark, Departemen Patologi, 'ni1ersitas 'ppsala,"wedia* Kertas //# yang digunakan.

"el tumbuh di bawah kondisi hipoksia dikenal untuk mempercepat usia terkait perubahan danakumulasi lipofuscin ( erman dan %runk, )::6* =rune et al., +;; #. Dalam rangka untuk

menginduksi akumulasi lipofuscin konfluen manusia fibroblas (Papers /-/ # terkena hipoksia( ;< !+, < 5+ dan < !+# selama dua-lima bulan dan disebut sebagai lipofuscin-loaded.

E-per&me $!" ,es&' 1

"el tumbuh di bawah kondisi hipoksia dikenal untuk mempercepat usia terkait perubahan danakumulasi lipofuscin ( erman dan %runk, )::6* =rune et al., +;; #. Dalam rangka untuk menginduksi akumulasi lipofuscin konfluen manusia fibroblas (Papers /-/ # terkena hipoksia

( ;< !+, < 5+ dan < !+# selama dua-lima bulan dan disebut sebagai lipofuscin-loaded.

P!per I

Konfluen budaya fibroblast A=-) )6 didistribusikan di lima kelompok (i# budaya konfluenawal* (ii# sel dikultur dalam kondisi normal untuk dua minggu* (iii# sel dikultur dalam kondisihipoksia selama dua minggu* (i1# sel dalam kondisi normal terkena m& autophagy

inhibitor -methyladenine ( &A# selama dua minggu* (1# sel dalam kondisi hipoksia terkena m& &A selama dua minggu. Perbandingan dilakukan antara non sel diperlakukan dalamkondisi normal dan kelompok lain serta antara kelompok yang berbeda.

Autophagy-menghambat efek &A disebabkan penghambatan kelas /// phosphatidylinositol-kinase (P/ K#. Aktif P/ K kelas /// diperlukan bagi penyerapan, tahap awal autophagy

(Petit et al., +;;;#.


17/32

P!per II

'-))4; = astrosit dan fibroblas lipofuscin-loaded didistribusikan di kelompok berikut selkonfluen tidak diobati* sel konfluen diobati dengan m& &A selama dua minggu* sub-

konfluen sel yang tidak diobati* &A-diperlakukan sub sel konfluen. Cibroblas A=-) )6didistribusikan di kelompok yang sama ditambah tambahan sel konfluen diobati dengan m& &A selama dua minggu, kemudian sub-dibudidayakan dalam kondisi &A-paparan(sel &A-diperlakukan dilepaskan dari confluency#* sel konfluen diobati dengan ; p& darilisosom sistein protease inhibitor leupeptin selama ); hari* leupeptin- sel sub-konfluendiobati. Perbandingan dilakukan baik antar kelompok yang berbeda dalam model selular yangsama dan antara kelompok masing-masing model seluler yang berbeda.

%erbeda dengan &A pengobatan terkait pencegahan autophagic penyerapan, leupeptinmengganggu degradasi intralysosomal dari auto phagocytosed material. Kami berspekulasi

bahwa pengobatan dengan &A akan terutama mempercepat akumulasi ekstra lisosom$sampah$, sementara leupeptin-pengobatan akan sebagian besar mengakibatkan akumulasiintralysosomal $buang$ -bahan. Dengan cara ini, pendekatan yang berbeda untuk percepatan

biologis $sampah$ pembentukan dipekerjakan.

P!per III

"el dibagikan dalam kelompok berikut (i# fibroblast normal (disebut sebagai kontrol#* (ii#fibroblast lipofuscin-loaded* (iii# fibroblast yang normal pra terkena m& &A selama + jam* (i1# fibroblast yang normal pra-terkena );; p& dari cathepsin D inhibitor pepstatin Aselama + jam. Di semua kelompok kelaparan diinduksi oleh paparan sel untuk phosphate-

buffered saline (P%"# untuk inter1al waktu yang berbeda (+ , 6, 2+ dan :4 jam#. "elamakelaparan, sel-sel dalam kelompok (iii# dan (i1# terkena m& &A dan );; p& pepstatin A,masing-masing. Perbandingan dilakukan antara lipofuscin dimuat dan sel non-loaded dalamkaitannya dengan titik waktu di mana perubahan signifikan telah terjadi.

Pepstatin perlakuan A diperkenalkan untuk menghambat en8im lisosom cathepsin D,

diketahui terlibat dalam tahap awal apoptosis ( oberg et al., ):::#. Pepstatin A jugaseharusnya meniru hipotetis lipofuscin terkait penghambatan cathepsin D.

P!per IV

Dua kelompok sel dibandingkan fibroblas normal (disebut sebagai kontrol# dan lipofuscin-loaded. Kedua kelompok yang terkena tiga perlakuan yang berbeda (dalam# &"D" deterjenlysosomotropic pada konsentrasi + p& selama ) , ; atau 4; menit* (ii# redoks-bersepedakuinon naphtha8arin (inducer stres oksidatif akut# pada konsentrasi ;,2 p& selama ) , ;


18/32

atau 4; menit dan* (iii# 1acuolar A Pase inhibitor bafilomycin A) pada konsentrasi +; n&selama ) atau ; menit.

Perawatan yang dipilih menggunakan mekanisme yang berbeda dari tindakan, danmemungkinkan pendekatan multifaset untuk mempelajari stres lisosom bertarget. Dengandemikian, &"D9- dan 58H-pengobatan menyebabkan perubahan struktural dalam membranlisosom dengan menginduksi modifikasi deterjen-seperti dan oksidatif, masing-masing,akhirnya menghasilkan lisosom kebocoran atau pecah. Atau, bafilomycin A)- pengobatanmempengaruhi pengasaman lisosom tanpa perubahan jelas integritas membran lisosom(%owman et al., ):66#.

Assessme $ o# )e""%"!r !%$o2%ores)e )e

Fumlah bahan lipofuscin-seperti diperkirakan dengan pengukuran autofluorescence seluler (Paper /#. 'ntuk kuantifikasi autofluorescence, gambar laser scanning non-confocal budayahidup diperoleh. idak seperti gambar confocal, yang merupakan bagian optik, non-confocalgambar mewakili sel utuh. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan 5ational /nstitute of 9ealth Program =ambar (http IIrsb.info.nih.go1Inih- gambarI#. /ntensitas fluoresensi telahdinyatakan dalam satuan sewenang-wenang (au# makhluk produk dari nilai pi3el rata-rata per sel (termasuk latar belakang# dan sel daerah ( erman et al., ):::#. Dari setiap spesimen :;-) ; dipilih secara acak sel dianalisis.

Co "o)!"&s!$&o o# !%$o2%ores)e $ m!$er&!" 4&$* "ysosomes

o-lokalisasi bahan autofluorescent dengan lisosom adalah diperkirakan dengan perbandingan gambar autofluorescent dengan gambar lisosom baik immunostained untuk cathepsins (D atau 0* C/ -conjugated sekunder antibodi# atau amat diwarnai denganfluorochrome lysosomotropic acridine orange (A!#. Kedua jenis pencitraan yang dilakukan

pada sel-sel berlapis kacamata penutup hambered dengan daerah bawah ditandai (lingkaransekitar ) mm#. "elama pencitraan berulang (deteksi autofluorescence, diikuti oleh lisosom

pewarnaan#, sel-sel yang sama diidentifikasi dan sasaran penyelidikan. "ejak C/ dan A!

fluoresensi yang jauh lebih terang dari lipofuscin seperti autofluorescence, itu memungkinkanatenuasi sinar laser ke le1el ketika lipofuscin tidak terdeteksi, tidak memberikan kontribusi

bagi fluoresensi terdeteksi selama lisosom pewarnaan. :; sel minimum per sampel dianalisis(Paper /#.


19/32

Assessme $ o# pro"er!$&.e po$e $&!"

Potensi proliferatif diperkirakan dengan deteksi imunositokimia "intesis D5A (Paper //#.%romodeo3yuridine (%rd'# menggabungkan ke dalam nuclear- dan mitokondria-D5A bukan

timidin selama replikasi dan memperbaiki (Da1is dan layton, )::4#. "ementara deteksimtD5A replikasi biasanya membutuhkan paparan %rd' selama )+ jam, eksposur untuk 4;menit sudah cukup untuk mendeteksi replikasi D5A nuklir. &enurut ini, sel-sel yang terkena) p& %rd' selama 4; menit, tetap di < formaldehida dalam P%" selama +; menit di L ."etelah Permeabilisasi dan denaturasi D5A, sel yang terkena monoklonal anti tikus Antibodi%rd', diikuti oleh pengobatan dengan kelinci anti-tikus C/ - antibodi terkonjugasi. "el-selkemudian dibilas dengan P%" dan air suling, dipasang di ectashield, dan mengalamimikroskop fluoresensi (biru eksitasi cahaya# dan pencitraan. "el dengan pewarnaan %rd'terang inti dianggap %rd'-positif (=ambar 4#. );; sel minimum dari masing-masing

spesimen dianalisis.

=ambar 4. 5uclei fibroblas immunostained untuk %rd'. %rD'- negatif (A# atau %rd'-positif (%# inti. "kala bar, +; p&.

De$e)$&o o# )e"" ,e!$*

Kedua metode morfologi dan biokimia yang digunakan untuk mendeteksi kematian sel.'ntuk estimasi morfologi sel apoptosis, formaldehida-tetap sel menjadi sasaran fase kontras(&akalah // dan ///# dan fluoresensi mikroskop (Kertas //#. Penyusutan seluler, pyknosis dannuklir fragmentasi dianggap khas untuk sel apoptosis. sel kematian- perubahan morfologiterkait, diungkapkan oleh gabungan 9oechst I propidium iodida pewarnaan 1ital, dianalisis

baik oleh in situ mikroskop fluoresensi (Kertas //# atau dengan aliran cytometry (Paper ///#.Deteksi biokimia dari kematian sel termasuk penilaian akti1itas caspase- -seperti (Paper ///#.


20/32

Hoe)*s$5Prop&,&%m &o,&,e s$!& & '

&enggunakan kombinasi dari 9oechst dan propidium iodida (P/# pewarnaan yang berbeda jenis kematian sel dapat diidentifikasi. 9oechst noda kromatin kental sel apoptosis lebih

intens dari kromatin inti normal. P/ meresapi hanya sel dengan gangguan membran plasma,dan dengan demikian noda inti sel nekrotik. ital pewarnaan, dengan campuran ug I ml9oechst + dan ) mg I ml P/ selama +; menit di atas es, dilakukan baik di situ (Paper //#atau pada sel yang telah trypsini8ed, disentrifugasi pada M ;; 3g selama menit, kembaliditangguhkan dalam media kultur dan disaring melalui sel 2; p& saringan (Paper ///#. Dalamkasus yang pertama, analisis 9oechst I P/ pewarnaan dilakukan dengan menggunakanmikroskop fluoresensi ( ;- 6; I +; nm dan );- 4; I :; filter eksitasi I penghalang nmuntuk 9oechst dan P/ pewarnaan, masing-masing#, sementara dalam kasus yang terakhir seldiwarnai dianalisis oleh aliran cytometry (' I biru eksitasi ganda, dan 6; nm panjang lulus

dan 2 B filter penghalang +4 nm untuk pengukuran emisi fluoresensi dari 9oechst dan P/,masing-masing#.

=ambar 2. Cluoresensi mikroskop fibroblas 9oechst-bernoda. 55, inti normal* 9o @,9oechst-positif (juga terfragmentasi# inti dari apoptosis sel menjalani. "kala bar, +; p&.

"elama analisis gambar neon, sel-sel yang normal menunjukkan layak rendah intensitas9oechst-pewarnaan. "ebaliknya, sel-sel mati dengan kental, dan di beberapa kasusterfragmentasi, inti, dipamerkan intens 9oechst-pewarnaan (=ambar 2#. "emacam

pewarnaan, jelas lebih terang dari yang dari inti utuh, adalah Dianggap 9oechst-positif.&enurut pola 9oechst I P/ positif pewarnaan, sel dibagikan dalam tiga kelompok (i#

9oechst-positif saja sel, dianggap sebagai menjalani tahap awal apoptosis* (ii# P/-positif hanya sel, dianggap sebagai nekrotik* (iii# sel dengan gabungan 9oechst dan P/ positif,


21/32

dinilai sebagai sel dalam tahap nekrosis pasca-apoptosis (?eber et al., )::2#. Delapan puluhsampai )+; sel yang dipilih secara acak dari setiap spesimen yang dianalisis.

"elama aliran analisis cytometric, dua populasi sel yang terjaga keamanannya sesuai denganintensitas 9oechst I P/ pewarnaan. "el menunjukkan intensitas rendah dari pewarnaandianggap layak, sementara mereka dengan intensitas yang lebih tinggi dianggap sebagai selyang mengalami apoptosis atau nekrosis pasca-apoptosis. );.;;; sel dari masing-masingsampel dianalisis.

C!sp!se 3 "& e !)$&.&$y !ss!y

aspases dikenal sebagai pelaksana utama apoptosis klasik. 'ntuk menilai akti1itas caspase--seperti (Paper ///#, lisat sel diinkubasi dengan fluorophore urutan substrat terkonjugasi (Ac-

D> D-A& #. fluoresensi intensitas dibebaskan A& (2-amino- -metil-kumarin# padacaspase pembelahan substrat antara D dan A& diukur dengan spektrofotometer dandinyatakan sebagai mol A& dirilis per miligram protein per jam. Kandungan protein diujimenggunakan metode yang dijelaskan oleh 0owry (0owry et al., ): )#.

Lysosom!" & $e'r&$y !ss!ys

De)re!se o# "ysosome !sso)&!$e, re, 2%ores)e )e o# !)r&,& e or! 'e

Akridin oranye (A!# adalah basa lemah lysosomotropic dengan fitur metachromatic (Koenig,):4 * obbins, ):4 #. %entuk oligomer yang sangat terkonsentrasi dan terprotonasi A!(A!9 @# ditemukan dalam lisosom utuh dan menunjukkan fluoresensi merah. 0isosomalkalinisasi dan translokasi konten lysosomal hasil sitosol dalam pembentukan monomer yang bentuk terdeprotonasinya A! dengan fluoresensi hijau (!lsson et al., ):6:#. /tu tingkatkebocoran lisosom diperkirakan sebagai penurunan lysosome- terkait fluoresensi merah A!(Kertas / #. "el pada co1er-slip yang sebentar diwarnai dengan mg I ml A! selama )menit di bawah budaya yang normal kondisi, dibilas dalam medium lengkap dan terkenatepat perawatan. "etelah diperoleh gambar neon dari sel-sel (cahaya biru eksitasi#, lisosomterpisah dijiplak dan pengukuran lisosomal merah A!-fluoresensi dilakukan denganmenggunakan /nstitut 5asional Kesehatan Program image (http IIrsb.info.hih.go1Inih-imageI#. Cluoresensi /ntensitas dinyatakan dalam unit sewenang-wenang (au# menjadi produk yang bernilai pi3el rata-rata per lisosom dan daerah lisosom. Dari );;-) ; lisosom dari setiapspesimen dianalisis.


22/32

Imm% o)y$o)*em&)!" ,e$e)$&o o# "o)!$&o o# )!$*eps& D

athepsin D biasanya hadir di dalam kompartemen lisosomal. Kami menggunakan cathepsinD sebagai $en8im penanda$ meskipun cathepsin lain juga dilepaskan dari lisosom denganintegritas membran terganggu. sel dengan lisosom utuh menunjukkan kasar (lisosom-seperti#

pola cathepsin D immunostaining. Destabilisation membran lisosom disertai dengantranslokasi cathepsin D ke sitosol, sehingga difus (sitosol# pola pewarnaan. Cibroblas berlapis

pada co1er-slip diproses untuk immunocytochemistry setelah diperbaiki di < formaldehiddalam P%" selama +; menit di L . /nkubasi dengan poliklonal kelinci anti-manusia antibodiuntuk cathepsin D diikuti oleh paparan kambing anti-kelinci /g= Ale3a : terkonjugasi."etelah itu, sel-sel dibilas di P%" dan air suling, dipasang di ectashield, dan mengalamimikroskop fluoresensi dan pencitraan (&akalah /// dan / #.

De$e)$&o o# )y$oso"&) #r!)$&o o# )!$*eps& D

>kstraksi dari sitosol dilakukan dengan menggunakan agen kolesterol-solubilising digitoninseperti yang dijelaskan di tempat lain (Fohansson et al, +;; *. Kertas / #. "ecara singkat,konsentrasi rendah digitonin permeabilise plasma kaya kolesterol membran, sedangkanmembran kolesterol buruk misalnya lisosom tetap kurang lebih utuh. Konsentrasi digitoninyang dioptimalkan untuk menghasilkan rilis maksimum sitosol laktat dehidrogenase (0D9#.0D9-kegiatan juga diukur untuk mem1erifikasi jumlah yang sama diekstraksi sitosol disemua sampel, dan spektrofotometri diperkirakan sebagai penurunan absorbansi pada ; nmdari nicotinamide adenin dinukleotida (5AD9# selama pengurangan 0D9-katalis dari piru1atmenjadi laktat. /ntegritas lisosom selama digitonin-pengobatan di1erifikasi oleh penilaianlisosom yang en8im, 5-asetil-D-glucosaminidase (5A=#, akti1itas, yang sesuai denganfluoresensi dari dibelah 5A=-substrat ( -&ethylumbelliferyl-+- asetamido-+-deoksi-N-Dglucopyranoside# pada panjang gelombang eksitasi 4 nm dan dari panjang gelombangemisi nm.

Paparan sel untuk ekstraksi penyangga (+ ; m& sukrosa, +; m& 9epes, ); m& K l, ),m& &g l+, ) m& >D A, ) m& >= A dan digitonin di konsentrasi + ug I ml# selama )+menit di atas es diikuti oleh koleksi supernatan dan pengendapan protein dengan cara

pengobatan dengan < perklorat asam di atas es selama ); menit dan sentrifugasiselanjutnya di M +;.6;; 3 g selama ) menit. Protein pelet kemudian mengalamiimunoblotting. "ebuah mouse monoclonal cathepsin anti-manusia D antibodi primer, dankambing anti-tikus antibodi sekunder pero3idase-conjugated lobak digunakan untuk analisiswestern blot. %and di1isualisasikan menggunakan ?estern blotting 0uminol eagen.Pemuatan sama di1erifikasi oleh menyelidik membran dengan antibodi dehidrogenase tikusanti-gliseraldehida- -fosfat (=APD9#.


23/32

Lysosom!" pH me!s%reme $

P9 rendah adalah ciri khas dari lisosom (De Du1e dan ?attiau3, ):44# dan merupakan perwakilan dari integritas fungsional lisosom ( hen, +;;+* 5ilsson et al., +;; #. P9 lisosom

diukur dengan aliran cytometry sebagai dijelaskan di tempat lain (5ilsson et al, +;; *.&akalah /// dan / #. "ecara singkat, sel-sel pre-loaded dengan dekstran C/ -terkonjugasimenjadi sasaran yang tepat perawatan. "etelah itu, sel trypsini8ed, disentrifugasi pada M ;;3g selama menit, kembali ditangguhkan dalam media kultur, disaring melalui sel 2; p&saringan dan dianalisis oleh aliran cytometry. "ebuah 66 nm argon laser digunakan untuk eksitasi C/ , dan emisi terdeteksi di C0) dan C0+ saluran menggunakan ; B +6 nm dan4); B +; filter penghalang nm, masing-masing. Data dari );.;;; sel dianalisis. &odifikasi

buffer %ritton- obinson (p9 .;- 2.;# digunakan untuk persiapan kur1a standar. asio C0) IC0+ digunakan untuk menghitung p9 menggunakan kur1a standar (=ambar 6#.

=ambar 6. ontoh dari kur1a standar yang diperoleh untuk p9 lisosom.

S$!$&s$&)!" ! !"ys&s

"emua percobaan diulang setidaknya tiga kali. 5ilai-nilai yang diberikan sebagai sarana B

".D. Perbandingan statistik dari data p9 lisosom dibuat menggunakan Kruskal-?allis dan post hoc uji &ann ?hitney. Data yang diperoleh dari percobaan lain dianalisis menggunakanA5! A dan post hoc uji 0"D. P-nilai O;,; dianggap signifikan.


24/32

RESULTS AND DISCUSSION

P!per I

Dalam penelitian ini, budaya konfluen dari fibroblast manusia A=-) )6 terkena hipoksiadan I atau autophagy inhibitor -&A selama dua minggu. Pengobatan jangka panjang dengan

-&A dimungkinkan karena toksisitas relatif rendah obat, dan memungkinkan akumulasistruktur selular non-autophagocytosis untuk dipelajari. Kami berspekulasi bahwa identifikasi

bahan non-terdegradasi mengumpulkan akan memberikan informasi mengenai sumber lipofuscin dalam fibroblas manusia.

L&po#%s)& "&6e m!$er&!" !))%m%"!$es #o""o4& ' e-pos%re $o *ypero-&!

! ,5or 3 MA

Paparan dari konfluen fibroblast budaya sampai ;< ambient oksigen atau -&A, tetapiterutama kombinasi keduanya, yang diproduksi ditingkatkan autofluorescence dibandingkandengan sel kontrol, dipertahankan dalam kondisi normal dan hanya menampilkan

peningkatan terkait usia autofluorescence. mengakumulasi bahan dipamerkan lipofuscin-seperti spektrum luas autofluorescence berikut eksitasi dengan ultra1iolet, biru, atau hijaumuda. &eskipun menyerupai umum, berkaitan dengan usia lipofuscin, bahan mengumpulkanmemiliki beberapa karakteristik morfologi tertentu diungkapkan oleh elektron studi

mikroskopis. Dengan demikian, kerapatan elektron dari 1akuola mengandung bahanmengumpulkan lebih rendah dibandingkan dengan inklusi lipofuscin. %eberapa 1akuola ini

juga berisi ruang elektron-berkilau dan urat saraf-seperti struktur.

I *&7&$&o o# !%$op*!'y & )re!ses $*e %m7er o# "ysosomes ! ,m&$o)*o ,r&! 4&$* "o4 mem7r! e po$e $&!"

0isosom ditemukan lebih berlimpah di -&A sel terkena daripada di kontrol. Karena paparan-&A tidak mengubah endosomal akhir kompartemen (sebagai disimpulkan dari tidak adanya

perubahan yang cukup di &P immunoreacti1ity#, yang jauh lebih kecil dari wilayah yangdiduduki oleh autofluorescent lisosom penanda-positif butiran (lihat bagian berikutnya#, itumenyarankan bahwa itu terutama lisosom dewasa yang terakumulasi berikut blok autophagy./ni konsisten dengan elektron emuan mikroskop, menunjukkan bahwa sebagian besar 1akuola mengumpulkan selama - &A paparan tidak memiliki struktur multi1esicular, khasuntuk akhir endosomes (0u8io, et al., +;; #.

Paparan -&A juga disebabkan peningkatan moderat umum di nomor mitokondria, terutama

mereka yang memiliki potensi rendah membran dalam. Dari tingkat mikroskopis elektron,mitokondria dari -&A diperlakukan sel ditampilkan perubahan serupa dengan yang


25/32

ditemukan dalam sel-sel penuaan, yaitu sebagian kental matriks dan melebar krista. emuanini sesuai dengan sebelumnya penelitian yang menunjukkan bahwa berkepanjangan -&A

pengobatan menginduksi akumulasi struktur selular dikeluarkan dari daur ulang ( erman etal., +;; #.

L&po#%s)& "& e !%$o2%ores)e )e & 3 MA $re!$e, )e""s )o "o)!"&ses 4&$*"ysosomes

%ahan Autofluorescent, akumulasi selama dua minggu-paparan -&A, colocali8ed denganlisosom, seperti disimpulkan dari kesamaan pola autofluorescence dengan immunostaininguntuk cathepsins D dan 0, dan pewarnaan 1ital dengan A! sel yang sama.

"ejak lipofuscin dianggap sebagai pigmen intralysosomal, yang dibentuk dari bahan dikirimke lisosom sebagian besar dengan cara autophagy (%runk et al, )::+*. erman dan %runk,

+;; #, akumulasi diamati lisosom yang mengandung bahan lipofuscin-seperti dalam kondisimenghambat autophagy dapat dijelaskan jika kemungkinan autophagy lisosom adalahdipertimbangkan. /stilah $3ylophagy$ awalnya digambarkan mikroskop elektron

emuan dari lisosom pelagica membran (de Du1e dan ?attiau3, ):44* =laumann et al.,):6)# muncul setelah lisosom fusi atau microautophagy, dan dianggap sebagai buktimembran parsial daur ulang (&ar8ella et al, ):6)*. 0loyd, )::4#. Dalam terang baru-baru ini

emuan, $autophagy$ bisa menggambarkan tidak hanya kelebihan cairan-fase autophagy,tetapi juga macroautophagy massal-fase seluruh lisosom. =agasan lisosom autophagydidukung oleh imunoelektron sebelumnya emuan mikroskopis protein membran lisosomdalam lisosom (%arriocanal et al., ):64#, dan asam fosfatase kegiatan positif membran-terikatstruktur dalam autophagosomes setelah 1inblastin diinduksi blok fusi (&iettinen dan

eunanen, )::)#.

Pengurangan diamati dari =olgi kompleks dan penurunan immunostaining untuk prokolagendi -&A sel diperlakukan dapat dianggap contoh berbahaya efek dari bahan terakumulasi

pada fungsi seluler. 'ndegraded bahan mengumpulkan karena penghambatan berkepanjanganautophagy, terutama bila dikombinasikan dengan stres oksidatif kronis, mungkin dipandangsebagai biologis $"ampah$ biasanya ditemukan dalam sel-sel penuaan ("heldrake, ):2 *9irsch, ):26* erman, +;;)#. Kesamaan temuan ini untuk umum penuaan terkait Perubahanmenekankan kesesuaian model sel yang digunakan dalam penelitian ini untuk penuaan

penelitian.

P!per II

Penuaan selular dikaitkan dengan akumulasi progresif fungsional bahan yang tidak efisiensering disebut biologis $sampah$ atau $sampah$ ( erman, +;;)#. %iologis $sampah$ termasuk e3tralysosomally lokal kerusakan struktur molekul non-degradable dan organel, misalnya$raksasa$ mitokondria, dan bahan polimer dicerna intralysosomal disebut lipofuscin. Dalamrangka mempercepat biologis $sampah$ akumulasi, Ag ) )6 fibroblast manusia (sarat dengan


26/32

lipofuscin atau tidak# dan '-))4; = astrosit yang terkena autophagy inhibitor -&A selamadua minggu. Atau, degradasi intralysosomal terhambat di A=-) )6 fibroblas dengan cara

paparan lisosom sistein P/ leupeptin selama ); hari. Kami berhipotesis bahwa proliferasi selakan mencegah $sampah$ akumulasi dengan pengenceran mekanik, dan meningkatkan sel

kelangsungan hidup dengan mengurangi konsentrasi berpotensi berbahaya $sampah$.

Co 2%e $ )e""s #re8%e $"y ,&e #o""o4& ' pro"o 'e, & *&7&$&o o# !%$op*!'y

Dalam semua model sel yang digunakan dalam penelitian ini, kematian sel spontan bahkandalam diobati budaya konfluen terdeteksi. Fumlah sel mati meningkat signifikan berikut

penghambatan autophagy. Dibandingkan dengan non-loaded sel, fibroblas lipofuscin-loadedditampilkan penurunan kurang jelas dari kelangsungan hidup setelah pengobatan dengan -

&A. "el mati berikut berkepanjangan paparan leupeptin terkandung dalam jumlah besar autofluorescence lipofuscin- seperti bahan dan menunjukkan fragmentasi nuklir khasapoptosis. di sel sekarat berikut -&A pengobatan, penelitian mikroskop elektronmengungkapkan apoptosis seperti kondensasi kromatin dan fragmentasi nuklir,dikombinasikan dengan sejumlah besar 1akuola sarat dengan bahan 'ndegraded.

S%7 )%"$&.!$&o & )re!ses pro"er!$&o o# 7o$* % $re!$e, ! ,3 MA e-pose,+7ro7"!s$s

Kedua lipofuscin-loading dan -&A pengobatan berkurang sub-budidaya proliferasidiinduksi, yang, bagaimanapun, tetap secara signifikan lebih tinggi daripada dalam budayakonfluen. Paparan -&A tidak menyebabkan penurunan lebih lanjut dari potensi proliferatif sudah dikompromikan di lipofuscin dimuat fibroblas sub-konfluen.

S%7 )%"$&.!$&o &mpro.es .&!7&"&$y o# )e""s % ,er )o ,&$&o s o# & *&7&$e,!%$op*!'y

Dalam semua model sel $sampah$ sel akumulasi disajikan dalam penelitian ini, sub-budidayamengakibatkan penurunan yang signifikan dalam jumlah sel-sel mati, bahkan ketika sub-

budidaya dikombinasikan dengan paparan terus-menerus terhadap inhibitor autophagy. >fek perlindungan dari sub-budidaya, meskipun masih signifikan, itu kurang diucapkan dalamlipofuscin-loaded fibroblas mungkin karena potensi proliferasi mereka menurun.

Penurunan disajikan 1iabilitas sel akibat penghambatan berkepanjangan autophagy danakumulasi terkait biologis $sampah$ konsisten dengan gagasan bahwa akumulasi $limbah$

bahan kompromi seluler fungsi ( erman et al, ):::*. erman, +;;)* erman dan %runk,+;;4#. /de ini didukung oleh temuan sebelumnya kematian progresif jantung miosit berikut -&A penghambatan diinduksi autophagy ( erman et al., +;; #. >fek merugikan dari $sampah$akumulasi dapat dijelaskan oleh toksisitas produk oksidasi protein (=oldberg, +;; *. =rune et


27/32

al, +;; #, dan peningkatan jumlah !" dihasilkan oleh rusak mitokondria ("ohal et al.,):: #. Atau, dengan menduduki tertentu jumlah ruang fisik di dalam sel, biologi $sampah$

bisa mengganggu sinyal intraseluler, transportasi dan metabolisme.

>fek menguntungkan dari proliferasi sel mungkin karena dilusi berbahaya non-degradable$sampah$ selama mitosis, yang menyediakan lebih atau distribusi kurang lebih sama bahanantara sel anak. Kontinu kerja dari mekanisme tersebut bisa menjadi satu-satunyakemungkinan untuk sel untuk melarikan diri penuaan terkait perubahan dan akhirnyakematian. Dalam perjanjian dengan ini /de adalah temuan penggantian terus-menerus darisemua sel dalam primitif organisme 9ydra, diketahui kekurangan fitur dari penuaan(&artine8, )::6#. "ecara keseluruhan, hasil penelitian ini mendukung $sampah$ teoriakumulasi penuaan dan menekankan peran pembelahan sel sebagai anti-penuaan alamimekanisme.

P!per III

Dari berbagai induser kematian sel, kelaparan lengkap terpilih karena kebanyakan $fisiologis$satu. Dalam penelitian ini, manusia fibroblas A=-) )6, normal dan mereka pra-berbudayadalam kondisi hipoksia untuk menginduksi akumulasi lipofuscin, terkena phosphate-bufferedsaline (P%"# hingga :4 jam. "ejak lisosom telah terbukti terlibat pada tahap awal kematiansel terprogram (Euan et al, )::2*. %runk dan "1ensson, ):::* oberg et al., ):::* 0i dkk.,+;;;* Cerri dan Kroemer, +;;)* Fohansson dkk., +;; * Persson dkk., +;; #, kami

berspekulasi bahwa lipofuscin-loading, -&A penghambatan diinduksi autophagy, atauinhibisi en8im lisosomal cathepsin D dengan pepstatin A akan mengganggu fungsi lisosomyang dapat mempengaruhi sensiti1itas sel kelaparan-diinduksi kematian sel.

L&po#%s)& "o!,e, )e""s e ,%re )omp"e$e s$!r.!$&o

Dalam sel kontrol, peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel-sel mati terjadi setelah 2+ jam dari kelaparan lengkap. Dibandingkan dengan kontrol, kematian sel adalah ditunda

sampai :4 jam di pepstatin A sel diobati, dan dipercepat dalam sel terkena -&A (diamatisetelah 6 jam paparan P%"#. kematian sel terhambat dalam sel lipofuscin-load, dan

peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel yang mati tidak ditemukan bahkan setelah :4 jam dari kelaparan.

C!sp!se 3 !)$&.&$y ,e)"& es ,%r& ' s$!r.!$&o

aspase- kegiatan, hadir di beberapa tingkat basal dalam sel non-kelaparan, menurunselama kelaparan. "elanjutnya caspase- re-akti1asi ditemukan bertepatan dengan waktu


28/32

peningkatan yang signifikan dalam persentase sel-sel mati di sesuai kelompok eksperimen.idak ada perubahan signifikan dalam caspase- akti1itas selama :4 jam dari kelaparan yang

diamati pada sel lipofuscin-loaded. emuan ini dari tingkat signifikan lebih rendah dari basalcaspase akti1itas dalam sel lipofuscin-loaded dibandingkan dengan kontrol ini sesuai

dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan berkurang caspase- kegiatan dalam penuaansel ("paulding et al, ):::*. &arcotte et al,. +;; #.

S$!r.!$&o &s !sso)&!$e, 4&$* "ysosom!" !" !"& &s!$&o

0isosom alkalinisasi terjadi di kedua kontrol dan lipofuscin-loaded sel, tetapi lebih diucapkandi bekas. Peningkatan yang signifikan dari p9 lisosom dalam sel kontrol ditemukan

bertepatan dengan waktu peningkatan yang signifikan dalam persentase sel-sel mati dalam

kelompok itu (setelah 2+ jam kelaparan#. 9al ini konsisten dengan keterlibatan dilaporkansebelumnya dari lisosom alkalinisasi di apoptosis (5ilsson et al., +;; #. Penting, kontrol dansel lipofuscin-loaded ditampilkan p9 lisosom yang sama sebelum memulai kelaparan.

S$!r.!$&o & ,%)e, )e"" ,e!$* &s !sso)&!$e, 4&$* re"o)!$&o o# )!$*eps&D $o $*e )y$oso"

/mmunostaining untuk cathepsin D mengungkapkan relokasi en8im ke sitosol setelah 2+ jam

karena kelaparan, yang bertepatan dengan titik di waktu yang meningkat signifikan dari persentase sel-sel mati di kelompok kontrol ditemukan. Dalam sel-sel mati, studi mikroskopcahaya mengungkapkan dramatis Penurunan 1olume sitoplasma tanpa perubahan jelas nuklir morfologi. "ebaliknya, sel-lipofuscin dimuat diawetkan yang normal morfologi dan lisosom

pola cathepsin D pewarnaan.

Hypero-&! ,oes o$ & ,%)e o.ere-press&o o# Hsp9:

"tres ringan, termasuk stres oksidatif ringan, dianggap sebagai penggerak dari sistem bertanggung jawab untuk pemeliharaan dan perbaikan sel, dan merupakan dasar hormesis( otan dan lark, +;; #. >fek perlindungan dari eksposur diulang stres ringan telahditemukan terkait dengan peningkatan ekspresi panas- shock protein, yaitu 9sp2; (Conagy etal, +;;+*.. 9ercus et al, +;; #. Di penelitian ini tidak ada perubahan jelas dalam ekspresi9sp2; ditemukan berikut paparan ;< ambient oksigen untuk sampai bulan. 9al ini sesuaidengan temuan yang dilaporkan sebelumnya menunjukkan penurunan ekspresi daninducibility protein heat-shock dengan usia lanjut (5jemini et al., +;;+* Fin dkk., +;; *"tarnes et al., +;; #.

Perbedaan antara P D tipe /, atau apoptosis klasik ditandai dengan akti1asi caspase, danP D tipe //, atau kematian sel autophagic, tidak selalu jelas (%ursch, +;;)* 0ockshin dan


29/32

Gakeri, +;; #. &enurut saat ini emuan, kematian sel kelaparan-diinduksi dikaitkan dengan penyusutan terkenal sitoplasma sebelum perubahan nuklir jelas, yang khas untuk kematian selautophagic (%ursch, +;;)#. Di sisi lain, temuan bahwa penghambatan autophagy dengan -&A dipercepat kematian sel-sel kelaparan berpendapat terhadap sifat autophagic kematian sel

kelaparan-diinduksi. "ebagai tambahan, kondensasi kromatin nuklir, diamati pada sel-selmati, lebih karakteristik untuk apoptosis dan nekrosis pasca-apoptosis (?eber et al., )::2#.Akhirnya, meskipun peran caspases di sel terprogram kelaparan-diinduksi kematian tidak sepenuhnya jelas, akti1asi mereka juga lebih khas untuk apoptosis (%ursch, +;; * >dinger dan hompson, +;; #. Karena kemungkinan simultan co-eksistensi dari kedua jenis P Ddalam sel yang sama (%ursch, +;; * &ills et al., +;; #, kita tidak menentukan jenis kematiansel terdeteksi di pelajaran ini.

emuan ini dari respon kematian sel menurun dari lipofuscin-loaded sel berada dalam perjanjian dengan pandangan bahwa sel-sel penuaan mengembangkan resistensi terhadap

apoptosis. Alternatif untuk mekanisme dijelaskan sebelumnya di balik ini resistensi (?ang,):: * "paulding et al, ):::*. Pereira-"mith dan %ertram, +;;;* &arcotte et al., +;; #, yangtak lama dibahas dalam Pendahuluan, yang >fek hormetic ( otan dan lark, +;; # daritingkat moderat lipofuscin adalah juga mungkin. Kami selanjutnya berspekulasi lipofuscinyang mungkin menstabilkan lisosom kompartemen melalui tarik en8im lisosom,menonaktifkan mereka translokasi ke sitosol selama P D. /de ini didukung oleh emuan inikematian sel tertunda di fibroblas dengan cathepsin terhambat Kegiatan D. "ecarakeseluruhan, hasil penelitian ini menjamin pandangan no1el akumulasi lipofuscin sebagaimekanisme untuk pelestarian integritas seluler dengan mengorbankan fungsi dan reakti1itasumum.

P!per IV

%erdasarkan temuan kami sebelumnya peningkatan resistensi dari lipofuscin-loaded sel untuk kematian sel kelaparan tersebut, kita berspekulasi bahwa anti-apoptosis Pengaruh lipofuscinadalah karena stabilisasi lisosom dan, dengan cara ini, pencegahan P D-memicu dalamkondisi stres lisosom. Dalam urutan untuk menguji apakah lipofuscin bisa mempengaruhi

stabilitas lisosom, manusia A=-) )6 fibroblas pertumbuhan ditangkap (lipofuscin-loaddibandingkan sel non-loaded# adalah terkena lisosom bertarget stres yang disebabkan baik oleh lysosomotropic sebuah deterjen (&"D"* 0i et al, +;;;.# atau stres oksidatif akut oleh

paparan redoks-bersepeda kuinon-pengobatan (5GHA*. oberg et al, ):::#. "elain itu,integritas fungsional dari lisosom terkena paparan 1acuolar A Pase inhibitor bafilomycin A)(%owman et al., ):66#.

MSDH & ,%)e, "ysosom!" ,es$!7&"&s!$&o !)$&.!$es !%$op*!'y


30/32

Paparan &"D9 mengakibatkan diucapkan 1acuolation autophagic diamati pada keduatingkat elektron dan cahaya-mikroskopis. Kami berspekulasi bahwa peningkatan autophagy

bisa dilihat sebagai respon seluler adaptif di untuk membatasi kerusakan yang disebabkanoleh kebocoran proton dan proteolitik en8im ke dalam sitosol karena gangguan membran

lisosom. =agasan ini sesuai dengan peran yang disarankan sebelumnya autophagy1acuolation dalam perlindungan homeostasis intraseluler (9enics dan ?heatley, ):::#.Dengan cara ini, 1acuolisation autophagic, meskipun hadir di kontrol dan fibroblaslipofuscin-load, tapi kurang menonjol di Eang terakhir, bisa menjadi tanda dari tingkat yanglebih rendah kerusakan lisosom di lipofuscin- sel dimuat.

Lysosom!" ,es$!7&"&s!$&o #o""o4& ' $*e or'! e""e $!r'e$e, s$ress &smore pro o% )e, & )o $ro" $*! & "&po#%s)& "o!,e, +7ro7"!s$s

0isosom destabilisasi secara signifikan lebih diucapkan dalam kontrol dari pada fibroblaslipofuscin-load, terutama selama 5GHA-pengobatan ketika sel lipofuscin-loaded tidak menunjukkan tanda-tanda penurunan lisosom. Penurunan jumlah lisosom, menyusul organel-ditargetkan stres, juga ditemukan karakteristik untuk kontrol tetapi tidak untuk lipofuscin-loaded sel.

&enurut temuan ini penurunan sensiti1itas lipofuscin dimuat lisosom stres organel-ditargetkan, kami berhipotesis bahwa fenomena yang diamati adalah karena intra lisosomlipofuscin. Kami selanjutnya berspekulasi bahwa tergantung lipofuscin lisosom stabilisasidapat dijelaskan oleh mekanisme tentatif berikut

- Pendudukan etap situs aktif en8im lisosom oleh non-degradable (tapi ditargetkan untuk degradasi# lipofuscin, yang mencegah translokasi en8im untuk sitosol selama stres lisosom./de ini, berdasarkan hasil sekarang menurun translokasi sitosol cathepsin D di lipofuscin-fibroblas dimuat, adalah sesuai dengan temuan kami sebelumnya peningkatan resistensi sellipofuscin-loaded kelaparan-diinduksi kematian (Paper ///#.

- Proton-menjebak karena struktur polimer dari lipofuscin mengandung jumlah tinggikelompok !9-, yang berpotensi mampu bereaksi dengan 9 @. /de ini didasarkan pada hasilini penurunan alkalinisasi sitosol dalam sel lipofuscin-loaded berikut paparan &"D9, 58H,dan, terutama, spesifik 1akuola A Pase inhibitor bafilomycin A) (%owman et al., ):66#. /deini juga didukung oleh temuan kami sebelumnya menurun lisosom alkalinisasi di fibroblaslipofuscin-dimuat selama kelaparan (Paper ///#.

- 0ipofuscin adalah situs tarik radikal bebas. /ni mungkin menjelaskan resistensi yang tinggidiamati sel lipofuscin-loaded untuk akut stres oksidatif.

"ecara keseluruhan, hasil penelitian ini mendukung ide kami menyarankan sebelumnyalisosom-menstabilkan sifat lipofuscin.


31/32


32/32

$sampah$ - bahan yang dibutuhkan. &emahami mekanisme dan konsekuensi dari usia-akumulasi terkait biologis $sampah$ mungkin dapat membantu untuk masa depan

pengembangan terapi anti-penuaan dan manajemen penyakit terkait usia.

Translate Amd13

Documents