T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Partikül Bombardımanı (Biyolistik) Yöntemi ile Tritikaleye (x Triticosecale Wittmack) Markör Gen Aktarımı Proje Yürütücüsü Prof. Dr. A. Murat ÖZGEN Proje Numarası : 2005 0711 001 HPD Başlama Tarihi : 15.05.2005 Bitiş Tarihi : 15.05.2006 Rapor Tarihi : 03.07.2006 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - 2006
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU
Partikül Bombardımanı (Biyolistik) Yöntemi ile Tritikaleye (x Triticosecale Wittmack) Markör Gen Aktarımı
Proje Yürütücüsü Prof. Dr. A. Murat ÖZGEN
Proje Numarası : 2005 0711 001 HPD Başlama Tarihi : 15.05.2005 Bitiş Tarihi : 15.05.2006
Rapor Tarihi : 03.07.2006
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara - 2006
2
I. ÖZET
Partikül Bombardımanı (Biyolistik) Yöntemi ile Tritikaleye (x Triticosecale Wittmack) Markör Gen Aktarımı
Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü biyoteknoloji
laboratuvarında yürütülen bu çalışmanın amacı; tritikale ((x Triticosecale
Wittmack)’nin olgun embriyolarına ve kotiledon yapraklarına partikül bombardımanı
tekniği ile gen aktarmada kullanılabilecek en uygun parametreleri belirlemektir.
Tritikele (x Triticosecale Wittmack)’den elde edilen olgun embriyolar ve kotiledon
yapraklar, β-glucuronidase (GUS) genini içeren plasmidlerle kaplanmış hızlandırılmış
altın ve tungsten partikülleri ile bombardıman edildi. Hedef eksplantlara olan farklı
uzaklıklar (6, 9, 12, cm) ve farklı basınçlar (900, 1100, 1550 psi) fiziksel parametreler
olarak kullanıldı. Gen geçişlerinin olduğu mavi hücreler histokimyasal analiz ile
belirlendi. Mavi noktalara ilişkin veriler, gen geçişlerinin etkinliğinin belirlenmesinde
ölçüt olarak kullanıldı.
Tritikalede, partikül bombardımanı tekniği ile doğrudan DNA aktarmada olgun
embriyoların yapraklara oranla, altının ise tungstene oranla daha kullanışlı olduğu
belirlendi. Denemede en iyi sonucu veren olgun embriyolarda bombardıman uzaklığının
6 cm, bombardıman basıncının ise 1100 psi olduğu saptandı.
aklimitizasyonu gibi standart uygulamalar kullanılarak tüm bitki oluşumu sağlanmıştır
(Özgen ve ark., 1998).
Bombardımandan 48 saat sonra gen geçişlerinin belirlenmesi amacıyla eksplantlar
Jefferson (1987) yönteminden yararlanılarak X-GLUC solüsyonuna alınmıştır.
50 ml X-Gluc solüsyonu hazırlamak için bir behere sırası ile,
� 5 ml EDTA,
� 5 ml potasyum ferrisiyanid,
� 5 ml potasyum ferrosiyanid,
� 25 ml Buffer,
0,2 M Na2HPO4 = 15,25 ml
0,2 M NaH2PO4 = 9,75 ml
14
� 500 µl Triton X-100
� 25 mg X-Gluc (tartılarak 500 µl DMF içinde çözüldü.)
� 9 ml steril distile su eklendi.
� Petri kutuları steril kabin içerisinde açılarak kotiledonlar 10 ml’lik cam tüplere
alındı.
� Kotiledonların yüzeyini örtecek şekilde her tüpe solüsyon eklendi.
� Tüpler vakum cihazına yerleştirilerek 10′′ süre ile hava kabarcıklarının dışarı
alınması ve böylece kotiledonların yüzeyi ile solüsyon temasının daha iyi olması
sağlandı.
� Tüpler, ağızları kapatılarak ışık almayacak şekilde bir kutuya yerleştirildi.
� 24 saat süre ile 37 oC’de inkübatörde bekletildi.
� Bu süre sonunda tüpler açılarak X-Gluc solüsyonu mikropipet yardımıyla dışarı
alındı ve bir defa steril distile su ile yıkama sonrası % 70 (v/v) etanol eklendi.
� Kotiledonlar mikroskop altında birer birer incelenerek gözlenen mavi nokta sayıları
kaydedildi.
Fotoğraf çekimleri
Mavi nokta gözlenen kotiledonların fotoğraflarının çekimi için dijital fotoğraf makinası
(Nikon D100) kullanıldı ve görüntüler bilgisayara aktarıldı.
Verilerin değerlendirilmesi
Çalışmanın sonuçları, elde edilen mavi nokta sayıları temel alınarak değerlendirildi
(Ritala vd 1994). X-Gluc solüsyonuna alınan embriyolardan ve yapraklardan yalnızca
gen aktarımı gerçekleşenlerde mavi nokta oluşumu gözlenebilmektedir. Bu embriyolar
ve yapraklar mikroskop altında incelenerek mavi nokta sayıları kaydedildi. Deneyler
için ayrı ayrı tablolar oluşturularak her petride bulunan 50 embriyo ve 14 yaprak başına
yapılan atışlardan elde edilen sonuçlarla mavi noktalı embriyo ve yaprak sayısı ve
yüzdesi, mavi nokta sayısı ve embriyo ve yaprak başına düşen mavi nokta sayıları
hesaplanmıştır. Bombardıman başarısı mavi noktalı embriyo sayısı ve bundan
hesaplanan mavi noktalı embriyo ve yaprak yüzdesi olarak değerlendirilmiştir. Atış
15
yapılan basınç ve mesafeler arasındaki farklılıkların belirlenmesinde Ki-kare
bağımsızlık testinden yararlanıldı.
IV. ANALİZ VE BULGULAR
Bitkisel materyalde genellikle en çok kullanılan basınçlar olan 900, 1100 ve 1550 psi
basınçları ile tahıllarda en çok kullanılan 6, 9, 12 cm mesafelerinden atış yapılarak
olgunlaşmış tritikale embriyolarına ve yapraklarına partikül bombardımanı yöntemi ile,
gen aktarımında kullanılabilecek en uygun basınç ve mesafenin bulunmasına
çalışılmıştır.
Bu denemede altınla, 1350 embriyoya atış yapılmış olup, toplam 538 embriyoda 8243
mavi nokta; 378 yaprağa atış yapılmış olup toplam 348 yaprakta ise 6994 mavi nokta
sayılmıştır. Tungstenle yapılan denemende ise, 1350 emriyoya atış yapılmış olup,
toplam 626 embriyoda 6900 mavi nokta, 378 yaprağa atış yapılmış olup toplam 319
yaprakta 3405 mavi nokta sayılmıştır.
50 embriyo başına yapılan atışlardan elde edilen sonuçlar, mavi noktalı embriyo sayısı
ve yüzdesi, mavi nokta sayısı ve embriyo başına düşen mavi nokta sayıları olarak
hesaplanmıştır. Bombardıman başarısı, mavi noktalı embriyo sayısı ve bundan
hesaplanan mavi noktalı embriyo yüzdesi olarak değerlendirilmiştir.
a) Embriyolarda gen geçişleri
Embriyolara altın ile yapılan atışlarda, Çizelge 2’de de görüldüğü gibi, değerlendirme
parametreleri bakımından en iyi sonucu 1100 psi – 6 cm kombinasyonu vermiştir (Şekil
3). En düşük sonuçların ise, 900 psi’lik basınçlarda alındığı belirlenmiştir (Şekil 4).
16
Çizelge 2. Olgun tritikale embriyolarına altın partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları
Mavi Nokta / Embriyo Basınç-uzaklık (psi-cm)
Mavi Noktalı Embriyo Sayısı (Adet)
Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)
Mavi Nokta Sayısı (Adet)
Tüm Kültüre Alınan Embriyolarda
Mavi Noktalı Embriyolarda
900-6 15.0 bc 30.0 bc 122.3 c 2.4 b 9.1 c 900-9 16.0 bc 32.0 bc 202.3 bc 3.3 b 10.5 bc 900-12 11.6 c 23.3 c 152.0 bc 3.0 b 12.9 abc 1100-6 30.3 a 60.6 a 581.0 a 11.6 a 17.7 ab 1100-9 16.0 bc 32.0 bc 292.0 abc 5.8 ab 18.2 a 1100-12 15.0 bc 30.0 bc 185. 0 bc 3.7 b 12.6 abc 1550-6 26.0 ab 53.0 ab 364.0 abc 5.6 ab 14.0 abc 1550-9 26.0 ab 52.3 ab 450.3 ab 8.9 ab 16.9 ab 1550-12 23.3 abc 46.6 abc 432.0 ab 8.6 ab 18.5 a
Şekil 3. Embriyolara 1100 psi basınç ve 6cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri
17
Şekil 4. Embriyolara 900 psi basınç ve 6cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri
Aynı eksplantlarda tungsten kullanılması durumunda atış parametreleri bakımından
fazla değişiklik olmamış, 1100 psi – 9 cm kombinasyonunun (Çizelge 3, Şekil 5) en
yüksek değeri vermesine karşın 900 psi’lik basınçların da uygun olmadığı görülmüştür.
Çizelge 3. Olgun tritikale embriyolarına tungsten partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları
Mavi Nokta / Embriyo Basınç-uzaklık (psi-cm)
Mavi Noktalı Embriyo Sayısı (Adet)
Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)
Mavi Nokta Sayısı (Adet)
Tüm Kültüre Alınan Embriyolarda
Mavi Noktalı Embriyolarda
900-6 25.0 bc 50.0 bcd 208.3 bcd 4.1 bcd 8.0 bcd 900-9 20.3 cd 40.6 cd 125.0 d 2.5 d 5.9 cd 900-12 16.0 d 32.0 d 92.0 d 1.8 d 5.7 cd 1100-6 18.3 cd 36.6 d 226.0 bcd 4.5 bcd 12.5 ab 1100-9 34.3 a 68.6 a 535.0 a 10.7a 15.0 a 1100-12 18.0 cd 36.0 d 191.3 cd 3.8 cd 10.9 abc 1550-6 28.3 ab 56.6 abc 392.0 abc 7.8 abc 13.3 ab 1550-9 31.0 ab 65.3 ab 429.0 ab 8.5 ab 13.8 ab 1550-12 17.3 cd 34.6 d 101.3 d 2.0 d 5.8 d
18
Şekil 5. Embriyolara 1100 psi basınç ve 9cm mesafeden tungsten partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri
Embriyolarda altın ve tungsten partikülleri, gen geçişlerindeki etkisi bakımından
karşılaştırıldığında (Çizelge 4), altında en iyi sonucu veren 1100psi-6cm
kombinasyonunda altının tungstene oranla önemli düzeyde (χ2 = 10.58**) farklı olduğu;
tungstenin en iyi sonucu verdiği 1100psi-9cm kombinasyonunda ise, tungstenin altına
göre önemli (χ2 = 25.32**) düzeyde farklı olduğu belirlenmiştir.
Çizelge 4. Embriyolarda gen geçişleri bakımından altın ve tungsten partiküllerinin karşılaştırılması Basınç-mesafe Psi-cm
Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)
Altın
Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)
Tungsten
Ki-Kare
900-6 30.0 50.0 7.50**
900-9 32.0 40.6 1.22
900-12 23.3 32.0 1.48
1100-6 60.6 36.6 10.58**
1100-9 32.0 68.6 25.32**
1100-12 30.0 36.0 0.564
1550-6 53.0 56.6 0.134
1550-9 52.3 65.3 2.97
1550-12 46.6 34.6 2.508
19
b) Yapraklarda gen geçişleri Yapraklara altın ile yapılan atışlarda, Çizelge 5’de de görüldüğü gibi, değerlendirme
parametreleri bakımından en iyi sonuçları 1550psi-12cm, 1100psi-9cm ve 1100psi-
12cm kombinasyonları vermiştir (Şekil 6). En düşük sonuçların ise, 1550psi-6cm
Çizelge 5. Tritikalede yaprak eksplantlarına altın partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları
Mavi Nokta / Yaprak Basınç-uzaklık (psi-cm)
Mavi Noktalı Yaprak Sayısı (Adet)
Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)
Mavi Nokta Sayısı (Adet)
Tüm Kültüre Alınan Yapraklarda
Mavi Noktalı Yapraklarda
900-6 13.0 a 92.8 a 189.0 ab 13.4 ab 14.5 a 900-9 13.0 a 92.8 a 266.3 ab 19.0 ab 20.4 a 900-12 13.0 a 92.8 a 268.3 ab 19.1 ab 20.5 a 1100-6 13.6 a 97.6 a 282.6 ab 20.1 ab 20.7 a 1100-9 13.3 a 95.2 a 313.6 ab 22.4 ab 23.4 a 1100-12 13.3 a 95.2 a 329.0 ab 23.4 ab 24.6 a 1550-6 11.3 b 80.9 b 161.6 b 11.5 b 14.3 a 1550-9 11.3 b 80.9 b 184.6 ab 13.1 ab 17.1 a 1550-12 14.0 a 100.0 a 336.0 a 23.9 a 23.9 a
Şekil 6. Yapraklara 1550 psi basınç ve 12cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri
20
Şekil 7. Yapraklara 1550 psi basınç ve 6cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri
Yaprak eksplantlarda tungsten kullanılması durumunda bu kez, atış parametreleri
bakımından, 1550 psi – 9 cm kombinasyonunun (Çizelge 6, Şekil 8) en yüksek değeri
vermesine karşın 900 psi-12cm’lik kombinasyonun en düşük değerleri verdiği
gözlenmiştir (Şekil 9).
21
Çizelge 6. Tritikalede yaprak eksplantlarına tungsten partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları
Mavi Nokta / Yaprak Basınç-uzaklık (psi-cm)
Mavi Noktalı Yaprak Sayısı (Adet)
Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)
Mavi Nokta Sayısı (Adet)
Tüm Kültüre Alınan Yapraklarda
Mavi Noktalı Yapraklarda
900-6 11.6 ab 83.3 ab 113.0 ab 8.0 ab 10.5 a 900-9 12.3 a 88.0 a 69.3 ab 4.9 ab 5.5 a 900-12 8.6 b 61.8 b 36.3 b 2.5 b 4.0 a 1100-6 12.3 a 88.0 a 188.6 ab 13.4 ab 15.2 a 1100-9 11.3 ab 80.9 ab 112.3 ab 8.0 ab 10.4 a 1100-12 11.3 ab 80.9 ab 101.3 ab 7.2 ab 8.9 a 1550-6 12.3 a 88.0 a 170.6 ab 12.1 ab 13.4 a 1550-9 13.3 a 95.2 a 223.3 a 15.9 a 16.9 a 1550-12 13.0 a 92.8 a 120.0 ab 8.5 ab 9.2 a
Şekil 8. Yapraklara 1550 psi basınçta ve 9cm mesafeden tungsten partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri
22
Şekil 9. Yapraklara 900 psi basınçta ve 12cm mesafeden tungsten partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri
Yapraklarda altın ve tungsten partikülleri, gen geçişlerindeki etkisi bakımından
karşılaştırıldığında (Çizelge 7), altında en iyi sonucu veren 1100psi-9cm ve 1100psi-
12cm kombinasyonlarında kombinasyonunda altının tungstene oranla önemli düzeyde
(χ2 = 8.40**) farklı olduğu; tungstenin en iyi sonucu verdiği 1550psi-9cm
kombinasyonunda ise, tungstenin altına göre önemli (χ2 = 8.40**) düzeyde farklı
olduğu belirlenmiştir.
Çizelge 7. Yapraklarda gen geçişleri bakımından altın ve tungsten partiküllerinin önemi Basınç-mesafe Psi-cm
Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)
Altın
Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)
Tungsten
Ki-Kare
900-6 92.8 83.3 3.432
900-9 92.8 88.0 0.83
900-12 92.8 61.8 25.642**
1100-6 97.6 88.0 5.534*
1100-9 95.2 80.9 8.404**
1100-12 95.2 80.9 8.404**
1550-6 80.9 88.0 1.416
1550-9 80.9 95.2 8.404**
1550-12 100.0 92.8 2.866
23
V. SONUÇ VE ÖNERİLER
Tritikale (x Triticosecale Wittmack)’nin olgun embriyolarına ve kotiledon yapraklarına
partikül bombardımanı tekniği ile gen aktarmada kullanılabilecek en uygun
parametreleri belirlemek amacıyla yürütülen bu çalışmada, olgun embriyolar ve
kotiledon yapraklar, β-glucuronidase (GUS) genini içeren plasmidlerle kaplanmış
hızlandırılmış altın ve tungsten partikülleri ile bombardıman edildi. Hedef eksplantlara
olan farklı uzaklıklar (6, 9, 12, cm) ve farklı basınçlar (900, 1100, 1550 psi) fiziksel
parametreler olarak kullanıldı. Gen geçişlerinin olduğu mavi hücreler histokimyasal
analiz ile belirlenerek, mavi noktalara ilişkin verilerden, gen geçişlerinin etkinliğinin
belirlenmesinde uygun bir ölçüt olarak yararlanıldı. Yapılan istatistiksel analizler
sonucunda;
• Tritikaleye partikül bombardımanı yöntemi ile gen aktarmada olgun embriyo ile
kotiledon yaprakların her ikisinin de başarıyla kullanılabileceği,
• Olgun embriyoların eksplant olarak kolay elde edilebilmesi, rejenerasyonunun daha
başarılı olması ve gen geçişleri (mavi nokta oluşturma) bakımından biraz daha
avantajlı olması nedenleriyle tercih edilebileceği,
• Altın ve tungsten partiküllerinin her ikisinin de gen geçişlerinde başarıyla
kullanılmasına karşın, altının dokulara toksik etki yapmama özelliğinin olduğu;
buna karşın pahalıya mal olduğu; tungstenin ise ucuz fakat ileri dönemlerde toksik
etki yapabileceği düşünülerek kullanımda karar verilmesi gerektiği,
• Olgun embriyoların ve altın partiküllerinin kullanılması durumunda, atış
parametreleri olarak, 1100 psi – 6 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,
• Olgun embriyoların ve tungsten partiküllerinin kullanılması durumunda, atış
parametreleri olarak, 1100 psi – 9 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,
• Yaprakların ve altın partiküllerinin kullanılması durumunda, atış parametreleri
olarak, 1550 psi – 12 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,
• Yaprakların ve tungsten partiküllerinin kullanılması durumunda ise, atış
parametreleri olarak, 1550 psi – 9 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,
sonucuna varılmıştır.
24
VI. KAYNAKLAR
AINSLEY, P.J. and ARYAN, A.P., 1998. Efficient plant regeneration system for
immature embryos of triticale (x Triticosecale Wittmack). Plant Growth Regul.
24: 23-30.
BECKER, D., JAHNE, A., ZIMNY, J., LUTTICKE, Z. and LÖRZ, H., 1995.
Production of transgenic cereal crops., Current Issues in Plant Molecullar and
Cellular Biology Proceed. 8. Int. Cong. on Plant Tiss. and Cell Cult., Florence,
Italy, 12-17 June, 1994, pp. 263-269.
BİRSİN, M. and ÖZGEN, M., 2004. A comparasion of callus induction and plant
regeneration from different embryo explants of triticale (x Triticosecale