DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA DE
Escherichia coliHIPOTESIS Si Escherichia coli tiene mayor afinidad
con la glucosa, entonces, al utilizarla como fuente de carbono
tendr un mayor crecimiento que en succinato. Si la enzima succinato
deshidrogenasa es inducida con succinato, entonces, hay mayor
actividad de la enzima con esta fuente de carbono que la inducida
con glucosa. Si se mide la actividad enzimtica de la succinato
deshidrogenasa por el mtodo de Ells, entonces Escherichia coli no
hace una cadena transportadora de electrones natural sino una
cadena transportadora de electrones artificial.DISEO
EXPERIMENTAL
a) Obtencin de la Suspensin Celular
Se utiliza una cepa silvestre de Escherichia coli, organismo que
representa nuestro objeto de estudio, es decir, del cual
determinaremos la actividad de succinato deshidrogenasa. Esta cepa
se utiliza para inocular 2 matraces que contienen cada uno 50 mL
del medio sinttico Sypher y Strauss, un medio sinttico del cual se
conoce las cantidades concretas de las sustancias qumicas puras que
lo conforman; en el primer ensayo la fuente de carbono es la
glucosa, que se encuentra presente en el 1.0% y el en segundo la
fuente de carbono es succinato 0.5%. Se incuba a 37C, en agitacin
durante 12 horas. Las clulas se cosechan por centrifugacin en
condiciones de esterilidad y se lavan y se resuspenden con
regulador de fosfatos, el cual mantiene el pH ptimo para la enzima
succinato deshidrogenasa. Las suspensiones anteriores se emplean
para elaborar una serie de cuatro ensayos:En el primero y segundo
ensayo se utiliza un cultivo previo de Succinato, y se emplea como
fuente de carbono adicional Succinato 0.5% y Glucosa 1.0%,
respectivamente (SS y SG). En el tercer y cuarto ensayo el cultivo
previo empleado es Glucosa, y la fuente de carbono adicionada es
succinato 0.5% y Glucosa 1.0% respectivamente (GS, GG). En
condiciones de esterilidad, se toman alcuotas de 4 mL y se leen las
absorbancias a 600nm, al tiempo inicial y final de incubacin, de
37C por 5 horas, contra un blanco (medio de cultivo sin inculo),
esto nos permitir conocer el efecto de la fuente de carbono en el
crecimiento y actividad enzimtica de Escherichia coli.b) Efecto de
la fuente de Carbono sobre la actividad de la succinato
deshidrogenasa.
Se realiza la determinacin de la actividad de la enzima
succinato deshidrogenasa de la siguiente manera: Ya que ninguno de
los componentes clave puede medirse directamente, la reaccin
Succinato Fumarato se medir mediante la reduccin de un aceptor de
electrones artificial, el colorante 2,6- diclorofenol indofenol, se
aaden 0.25 ml de este colorante a una celda de espectrofotmetro, se
adicionan 0.6 ml de KCN para bloquear la trayectoria normal de
electrones a travs del sistema de transporte de electrones
mitocondrial, inhibiendo la transferencia de electrones del
citocromo a, al aceptor final de electrones (el oxgeno, se
adicionan tambin a la celda 3.25 ml de regulador de fosfatos para
mantener el pH ptimo de la enzima, 1.0 ml de Succinato de sodio
como sustrato que la enzima oxidar, 0.4 ml de metosulfato de
fenazina, compuesto que acta como acarreador para garantizar que
los electrones sean captados por el aceptor artificial de
electrones, y por ltimo se aade 0.5 ml de suspensin celular, que
contiene a Escherichia coli, microorganismo del que se pretende
lleve a cabo esta cadena artificial de transporte de
electrones.Rpidamente la celda se sella con papel parafilm, se
mezcla por inversin y se lee el porciento de transmitancia a 600nm
contra un blanco de regulador de fosfatos. Leemos en realidad la
reduccin del colorante (cambio de color azul a incoloro). Se
registran lecturas cada 30 segundos por cinco minutos. Este
procedimiento se realiza con los 4 ensayos, es decir suspensiones
celulares SS, GS, GG y SG. OBJETIVOS
Observar el crecimiento de E. coli al utilizar como fuentes de
carbono a succinato y la glucosa. Inducir una cadena artificial de
electrones para E. coli y as poder determinar la actividad
enzimtica de succinato deshidrogenasa. Determinar qu fuente de
carbono genera una mayor actividad enzimtica en succinato
deshidrogenasa.REGISTRO DE DATOSEFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN
EL CRECIMIENTO DE E. coliDespus del desarrollo experimental, se
obtuvieron los siguientes datos:Se presentan las absorbancias
inicial y final obtenidas a 600 nm, las cuales son un indicativo
del crecimiento de Escherichia coli en los distintos cultivos y
fuentes de carbono empleadas. *Cabe destacar que este ensayo no se
realizo, por lo cual solo no se discutirn tcnicas
experimentalesTabla 1 Efecto de la fuente de carbono en el
crecimiento de E. coli.Cultivos previos en:Matraces con medio base+
Fuente de carbonoCrecimiento(Absorbancia a 600nm)Crecimiento
InicialFinal
Succinato1Succinato0.7121.0050.293
2Glucosa0.7201.2000.486
Glucosa3Succinato0.8941.1050.211
4Glucosa0.8891.2110.322
Y, a partir de estos datos, obtenemos la grfica correspondiente
al ensayo:Grfica 1 Efecto de la Fuente de carbono en el crecimiento
de Escherichia coli
SS = Cultivo previo en Succinato + adicin de Succinato como
fuente de carbono.SG = Cultivo previo en Succinato + adicin de
Glucosa como fuente de carbono.GS = Cultivo previo en Glucosa +
adicin de Succinato como fuente de carbono.GG = Cultivo previo en
Glucosa + adicin de Glucosa como fuente de carbono.
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA
SUCCINATO DESHIDROGENASASe muestran los resultados obtenidos dnde
las fuentes de carbono para los cultivos son:S-S:
Succinato-succinato.S-G: Succinato-glucosa.G-S:
Glucosa-succinato.G-G: Glucosa-glucosa.
Tabla 2 Lecturas obtenidas de %T a 600 nm para actividad de
succinato deshidrogenasa en las diferentes fuentes de
carbono.TIEMPO% DE TRANSMITANCIA A 600 nm DE LAS SUSPENCIONES
CELULARES CRECIDAS EN LAS FUENTES DE CARBONO
S-SS-GG-SG-G
015.515.616.216.3
3017.416.517.419.8
6019.517.317.820.8
9022.818.118.622
12025.519.219.222.8
15028.416.219.524
1803117.120.624.9
2103418.121.325.9
24036.818.721.726.7
27040.119.322.327.3
3004319.82328
Tabla 3 Diferencia de %T a 600 nm para succinato deshidrogenasa
en las diferentes fuentes de carbono.TIEMPO%T
S-SS-GG-SG-G
00000
301.90.91.23.5
6041.71.64.5
907.32.52.45.7
120103.636.5
15012.90.63.37.7
18015.51.54.48.6
21018.52.55.19.6
24021.33.15.510.4
27024.63.76.111
30027.54.26.811.7
Grfica 2 Actividad de la Succinato Deshidrogenasa de Escherichia
coli crecidas con fuentes de carbono Glucosa y Succinato por el
mtodo de Ells
MANEJO DE DATOSEFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO
DE E. coliPara el ensayo del efecto de la fuente de carbono en el
crecimiento de E. coli:Graficamos el crecimiento obtenido en cada
uno de los diferentes ensayos con cultivos previos y fuentes de
carbono adicionales, para esto obtenemos el de absorbencia, el cual
corresponder al crecimiento total para cada ensayo:Matraz con
cultivo previo en Succinato + Succinato como fuente de
carbono:Abs600nm = A600nm final - A600nm inicialAbs600nm = 1.005
0.712 Abs600nm = 0.293
Matraz con cultivo previo en Succinato + Glucosa como fuente de
carbono:Abs600nm = A600nm final - A600nm inicialAbs600nm =
1.2000.720 Abs600nm = 0.486
Matraz con cultivo previo en Glucosa + Succinato como fuente de
carbono:Abs600nm = A600nm final - A600nm inicialAbs600nm = 1.105
0.894Abs600nm = 0.211
Matraz con cultivo previo en Glucosa +Glucosa como fuente de
carbono:Abs600nm = A600nm final - A600nm inicialAbs600nm =
1.2110.889Abs600nm = 0.322
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA
SUCCINATO DESHIDROGENASASe obtuvo la diferencia del % de
transmitancia para cada cultivo cada treinta segundos durante 5
minutos a partir de los resultados registrados de la tabla 1.
EJEMPLO: Para el cultivo de succinato-succinato:
A Continuacin se muestra el comportamiento que se espera obtener
en la medicin de la actividad de succinato deshidrogenasa para cada
una de las condiciones de cultivo por el mtodo de Ells.
DISCUSINSegn los resultados de efecto de la fuente de carbono en
el crecimiento de E. coli, se observa que la bacteria si puede
incorporar succinato a su metabolismo 1, ya que s presento
crecimiento en este medio de cultivo. La bacteria creci mejor en
glucosa que en succinato ya que la absorbencias iniciales de los
matraces 3,4 son mayores que las absorbencias de los matraces 1,2,
(tabla 1) esto se debe a que el uso de glucosa como sustrato
utiliza dos vas centrales en condiciones aerobias, la glicolisis y
el ciclo de Krebs, lo cual genera un mayor poder reductor que se
ver reflejado en mayor sntesis de ATP 2, mientras que el succinato
es un sustrato que se va a incorporar en el ciclo de los cidos
tricarboxlicos, pero produciendo menor poder reductor 3 . El
mecanismo para que E. coli incorpore succinato a su metabolismo
requiere una fase de adaptacin de mayor tiempo, ya que como se
observo el cultivo s presento crecimiento en succinato pero de
manera ms lenta en comparacin con las clulas crecidas en glucosa 4.
El cambio en la fuente de carbono afecto el crecimiento celular ya
que las lecturas finales de absorbencia de los matraces 1,2 y 3,4
no son iguales. En el matraz 2 (succinato - glucosa) Se observa que
el crecimiento se acelero mas al cambiar las clulas pre incubadas
en succinato por otra fuente de carbono como glucosa, esta
observacin es notoria si restamos las absorbencias iniciales de las
finales (los valores son de M1 =0.293 y M2 =0.486), mientras que
para el matraz 1 donde no se cambio la fuente de carbono, las
clulas continuaron replicndose pero de una manera un tanto ms
constante.En los resultados del segundo par de matraces (3,4) se
presento un mejor crecimiento en glucosa glucosa, comparado con el
crecimiento glucosa succinato, los valores de absorbencia iniciales
son similares pero al cambiar la fuente de carbono, el crecimiento
en succinato fue afectado disminuyendo (matraz 3 Abs = 1.105) en
comparacin con el de las clulas crecidas en glucosa (matraz 4 Abs =
1.211).La succinato deshidrogenasa es una enzima que est presente
en procesos en la ltima parte del ciclo de Krebs, una conversin de
succinato a fumarato, la des hidrogenacin depende de FAD . Esta
enzima est unida a la membrana de E. coli y pasa los electrones del
succinato a la CoQ, por medio del FAD para permitir que se lleva a
cabo la fosforilacin oxidativa. 5En los resultados de actividad de
la enzima succinato deshidrogenasa se observa que la enzima de la
bacteria presenta una mayor actividad cuando E. coli creci en los
medios de cultivo succinato succinato. Tambin se observa que para
el crecimiento en los medios de cultivo succinato glucosa se vio
afectada la actividad de la succinato deshidrogenasa, pero no de
manera determinante, es decir, que la enzima si presento actividad,
si esta actividad se compara con las de enzimas de las clulas que
crecieron en glucosa succinato podemos decir que la tendencia de
stas rectas fueron muy parecidas.Para los ensayos de acuerdo a la
bibliografa, se reporta que la actividad de la succinato
deshidrogenasa se ve reprimida cuando E. coli es crecida en un
medio que contiene glucosa, pero adems esta enzima incrementa su
actividad cuando en el medio de cultivo existe succinato como la
principal fuente de carbono 6. Si succinato deshidrogenasa es una
enzima reprimible, se debe tener una clara disminucin en la
actividad de la enzima para el crecimiento en glucosa glucosa y un
aumento en el porciento de transmitancia (cuantificacin de la
actividad) para el ensayo de succinato succinato. . En el caso de
los otros dos ensayos se esperaba un comportamiento similar, de
valores de porcentaje de absorbencia entre los de succinato
succinato y glucosa glucosa, se realizo una tendencia de estos
datos, representados en el grfico 3.La metodologa por la cual se
determino la actividad de la enzima es un conjunto de reacciones de
oxido reduccin que conforman una cadena de transporte de electrones
artificial, donde el ultimo aceptor de electrones fue el
2,6-diclorofenol indofenol, que genero un color verde 7, para que
posteriormente se leyera la absorbencia en un espectrofotmetro,
donde para el ensayo de glucosa glucosa se presento una desviacin
muy notable en nuestros resultados, esto lo podemos atribuir a que
como equipo tuvimos un error experimental en confundir las celdas
en donde se midi esta actividad al agregar en vez de clulas de
glucosa-glucosa a su celda correspondiente, agregamos otras clulas
crecidas en succinato-glucosa. La tendencia de las graficas
obtenidas no concuerda con lo reportado en la bibliografa 6 ya que
como se dijo se presentaron errores experimentales, sobre todo en
el ensayo donde utilizamos a las clulas crecidas en glucosa-glucosa
cuyo valor debera ser muy diferente, pero cabe destacar que las
condiciones de las clulas con las cuales se trabajo, no eran
conocidas, ya que como se menciono en el registro de datos solo
realizo la determinacin de la actividad enzimtica y no se incubaron
estas. Por otro lado al ser un mtodo indirecto y colorimtrico las
interferencias inherentes al mtodo, y, a los errores del
espectrofotmetro fueron eliminadas mediante el tratamiento de
datos. Los resultados del mtodo realizado, el cual era la formacin
de una cadena artificial para medir la actividad de la enzima
succinato deshidrogenasa, no son satisfactorios como se esperaba,
ya que aunque estos resultados muestran que la enzima es inducible
por la presencia de succinato no muestra que sea reprimible por la
presencia de glucosa.CONCLUSIONES E. coli presenta un alto
crecimiento en un medio que contiene clulas incubadas en
succinato-glucosa. E. coli presenta un buen crecimiento en un medio
de glucosa-glucosa comprado con el crecimiento en
succinato-succinato. El crecimiento de E. coli disminuye con la
presencia de succinato como principal fuente carbono y aumenta si
la fuente de carbono es glucosa. Se determin que la mejor fuente de
carbono que genera una mayor actividad enzimtica de succinato
deshidrogenasa en E. coli fue cuando se utiliz slo Succinato. No
obtuvieron resultados que demuestren que la enzima succinato
deshidrogenasa de E.coli sea inducible segn la fuente de carbono
presente en el medio.Bibliografa1. J. Monza, S. Doldan y S.
Signorelli. Ciclo De Krebs2.
http://www.unavarra.es/genmic/metabolismo/glucolisis.htm3. Mary K.
Campbell, Shawn O. Farrell. Bioqumica. Edit. CENGAGE Learning. Pg
560 565. 4. Curso Qumico Biolgico en Lnea de la UCV:
http://www.bioquimicaqui11601.ucv.cl/5. Christopher k. Mathew
kensal e. Van hole kevin g. Ahern. Pearson. Bioquimica 3a edit. 586
-5876. J. Rufz Herrera y L. G. Garca. Marzo 1972. Regulation of
succinate dehydrogenase in escherichia coli . Departamento de
microbiologa, Escuela nacional de ciencias biolgicas, instituto
politcnico nacional, Mxico 17, D. F.7. H. Alan Ells. A colorimetric
Method for the Assay of Succinic Dehydrogenase and
Pyridineucleoticde Linked Deshudrogenases .
INSTITUTO POLITCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLGICAS
BIOQUMICA MICROBIANA
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA DE
Escherichia coliALUMNOS:ALVARADO RODRGUEZ DIANA KAREN MARTNEZ
PINEDA MICHELLERODRGUEZ RAMREZ ALEJANDRAGRUPO: 5IV1SECCIN: 1EQUIPO:
1
FECHA DE ENTREGA DE INFORME: 13/03/14