INSTITUTO POLITCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLGICAS
Laboratorio de Bioqumica Microbiana
Integrantes:
Durn Vera Ana RosaFras Navarro Csar FaridPrez Snchez Adriana
Grupo: 5IM1 Equipo: 1 Seccin: 1
Nombre de la prctica: Determinacin de actividad de Succinato
Deshidrogenasa de Escherichia coli
ASPECTOSVALORCALIFICACIN
Hiptesis y diseo experimental6%
Objetivos1%
Registro de datos3%
Manejo de datos5%
Discusin de resultados6%
Conclusiones3%
Bibliografa1%
Hiptesis
Si la bacteria Escherichia coli se inocula en glucosa y en
succinato y se le adiciona una fuente de carbono igual a la del
medio de cultivo, entonces la bacteria presentar un mayor
crecimiento que si se le pusieran sustratos contrarios. A mayor
concentracin de glucosa, ya sea en el medio de inoculacin o
adicionada posteriormente, menor actividad enzimtica presentar la
Succinato Deshidrogenasa.
Fundamento
La succinato deshidrogenasa cataliza la deshidrogenacin
esteroespecfica de succinato a fumarato. Esta enzima es inhibida
fuertemente por malonato, un anlogo estructural del succinato y un
ejemplo clsico de un inhibidor competitivo. La succinato
deshidrogenasa contiene un grupo prottico FAD que se une en forma
covalente a la enzima por medio de un residuo His (en la mayora de
otras enzimas que contienen FAD, el FAD se sostiene fuertemente
pero no en forma covalente). En general el FAD funciona para oxidar
bioqumicamente alcanos (como succinato) a alquenos (como fumarato),
mientras que NAD+ participa en la oxidacin ms exergnica de
alcoholes a aldehdos o cetonas. La deshidrogenacin de succinato
produce FADH2, que debe reoxidarse antes que la succinato
deshidrogenasa pueda emprender otro ciclo cataltio. La reoxidacin
de FADH2 se produce cuando sus electrones se pasan a la cadena
transportadora de electrones mitocrondrial.
Mtodo de Ells
Es un mtodo espectrofotomtrico aerbico aplicado para la
determinacin de Succinato Deshidrogenasa soluble. Basado en que el
Metosulfato de fenazina se acoplar a la cadena transportadora de
electrones entre la reduccin de nucletidos de piridina y
2,6-diclorofenol indofenol. La adicin de metosulfato de fenazina a
un sistema que contiene succinato, DCFIF y SDH soluble, causa una
rpida reduccin del CDFIF (incoloro). La taza de reduccin es
proporcional a la cantidad de enzima aadida.
Objetivos
Determinar la actividad enzimtica de succinato deshidrogenasa en
Escherichia coli, a partir de diferentes cultivos con condiciones
diferentes. Analizar y discutir cmo es que se comporta Escherichia
coli en cada uno de los cultivos empleados.
Registro y Manejo de datos
1. Efecto de la fuente de Carbono:
Para observar el efecto que ocasiona al inocular al medio de
cultivo Succinato y Glucosa, con fuentes de Carbono de Succinato y
Glucosa, se elaboraron los medios y se midieron absorbancias a 600
nm al inicio y despus de incubarlos 5h a 37C, obteniendo los
siguientes datos, que mediante una grfica denotamos dicho
efecto:
Tabla 1. Valores de absorbancias a 600nm del efecto del
crecimiento de Escherichia coli.Cultivos y fuentes de carbonoA a
600 nm
InicialFinalA
S/S0.7121.0050.293
S/G0.721.2060.486
G/S0.8941.1050.211
G/G0.8891.2110.322
Figura 1. Efecto del crecimiento de Escherichia coli en medios
de cultivo con caractersticas diferentes.
2. Efecto de la fuente de carbono en la actividad de la SDH:
Pusimos en evidencia el efecto de la fuente de Carbono sobre la
actividad de la Succinato deshidrogenasa nicamente adicionando
DCFIF, MSF, KCN, Regulador de fosfatos, Succinato de Na y suspensin
celular, se leyeron %T a 600 nm de las 4 celdas cada una con un
inculo de clulas y una fuente de carbono adicionada, y se
obtuvieron las siguientes lecturas:
Tabla 2. Valores de transmitancias de las diferentes fuentes de
carbono en la actividad de la enzima Succinato deshidrogenasa.
Tiempo (s)%T a 600 nm de suspensiones celulares crecidas en las
fuentes de Carbono
S/SS/GG/SG/G
011.54.57.38.2
3013.94.98.28.4
6016.35.29.48.8
9018.45.610.89
12020.5612.29.3
15022.76.313.79.6
18024.76.615.29.8
21026.9716.710
24029.57.318.210.2
27032.17.519.810.5
30034.77.921.410.6
Para observar el efecto que generan las fuentes de carbono
utilizadas, realizamos una grfica comparando las fuentes de carbono
con respecto del tiempo, para ello es necesario restarle el %T
inicial de cada tubo ya que este no corresponde a nuestros
resultados:
De igual forma lo hacemos para cada uno de los tiempos, teniendo
los valores de la siguiente tabla, y con ello se construye una
grfica de %T vs t:
Tabla 3. Diferencias del %T de los medios de cultivo con
diferentes fuente de carbono.Tiempo (s)%T de suspensiones celulares
crecidas en diferentes fuentes de Carbono
S/SS/GG/SG/G
00000
302.40.40.90.2
604.80.72.10.6
906.91.13.50.8
12091.54.91.1
15011.21.86.41.4
18013.22.17.91.6
21015.42.59.41.8
240182.810.92
27020.6312.52.3
30023.23.414.12.4
Figura 2. Efecto de la fuente de Carbono en la actividad
enzimtica.
Discusin de resultados
La bacteria Escherichia coli es una enterobacteria que puede
llevar a cabo tanto respiracin aerobia como fermentacin, esto ayuda
a que se adapte casi a cualquier medio en el que se cultive, siendo
estos los determinantes para que exista un mayor o menor
crecimiento de la misma. Esta bacteria lleva a cabo la gliclisis,
proporcionando de esta manera coenzimas que se reducirn en el Ciclo
de Krebs quien a su vez proporcionar los electrones a travs del
FADH2 para que lleve a cabo la cadena transportadora de electrones
y as poder vivir. Sin embargo en el experimento realizamos pruebas
con dos fuentes de carbono como medio de cultivo: glucosa y
succinato, combinando tambin la fuente de carbono que se le
adicionaba una vez cultivada. En las grficas podemos observar que
la bacteria no tiene un crecimiento grande en el medio de
Glucosa/Glucosa (dnde el primero indica el sustrato adicionado y el
segundo el medio de cultivo) pero sabemos que esto es falso, ya que
como ya se mencion anteriormente, al llevar a cabo gliclisis, la
fuente de carbono principal es la glucosa. Despus le seguiran el
medio Succinato/Glucosa, a continuacin el Glucosa/Succinato y por
ltimo Succinato/Succinato. Aunque el succinato tambin forma parte
de una de las vas que esta bacteria lleva a cabo, claramente no es
la principal y es por ello que el crecimiento no es tan grande que
como si lo hiciera con glucosa. La otra variable que tenemos adems
del medio de cultivo es precisamente el sustrato que le adicionamos
despus, nuevamente tendr un mayor crecimiento con glucosa que con
succinato y esto es otro determinante, ya que si se adiciona
succinato en el medio de glucosa, el primero inhibir el crecimiento
aunque no tanto por tener a la glucosa como otra fuente de donde
puede obtener carbono.
Conclusiones
Succinato Deshidrogenasa presenta mayor actividad enzimtica en
presencia de Succinato que con Glucosa. La importancia de la
Succinato Deshidrogenasa reside en que si se le agregara algn
inhibidor al complejo I, los electrones pueden llegar a la cadena
respiratoria mediante ella directamente en el complejo II. La
enzima necesita un acarreador para poder llevar a cabo su actividad
cataltica en un medio con glucosa. Escherichia coli crece mejor en
un medio donde exista 100% glucosa, sin embargo, puede crecer en
los diferentes medios que se utilizaron aunque en menor
proporcin.
Bibliografa
Voet Voet. Fundamentos de Bioqumica: La vida a nivel molecular.
Editorial Mdica Panamericana, 2 edicin, Madrid Espaa, 2009. Pg.
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