Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología Molecular de la Célula 1 Practica 6 “Cinética n!im"tica# Alumnos$ Flores Bonilla %onatan Morales &"nc'e! Ana (orena )ina*ero +errera María %osé )orres ,o*as María Fernanda -ru.o$ /00 Fec'a de entrega$ &"2ado 3/ de a2ril del 341/ INTRODUCCIÓN.
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Enzimas(os en!imas son .roteínas 5ue catali!an reacciones 5uímicas en los seres vivos es decir
sustancias 5ue sin consumirse en una reacción aumentan su velocidad acelerando las reacciones
5ue es.or"dicamente se .roducen7 [Portal de medicina molecular. FIBAO. !!"# [$#
(as en!imas unen su sustrato en el sitio activo o catalítico 5ue suele estar .rotegido del agua .araevitar interacciones no deseadas7 (a en!ima se une al sustrato donde .resenta un estado de
transición 8interacción en!ima sustrato9 : .osteriormente lo ex.ulsa en ;orma de .roducto7 (as
en!imas son mu: selectivas en relación a los sustratos 5ue modi;ican7 Adem"s suelen ser muc'o
m"s grandes 5ue sus sustratos : en muc'as ocasiones re5uieren de la .artici.ación de otras
moléculas m"s .e5ue<as no .oli.e.tídicas como las coen!imas o los iones met"licos llamados
co;actores7
n las reacciones 5uímicas sencillas la trans;ormación de un sustrato en un .roducto suele .asar
.or un estado intermedio llamado estado de transición7 ste estado de transición es mu: inesta2le :
suele necesitar a.orte de energía7 (a velocidad de una reacción 5uímica de.ende de esta energíade activación7 (a en!ima acelera la reacción 5uímica disminu:endo la energía de activación
interaccionando con los elementos 5ue .artici.an en la reacción 5uímica esta2ili!"ndolos en el sitio
activo7 Así aumenta enormemente la .ro2a2ilidad de 5ue se .rodu!ca la reacción 5uímica :a 5ue
concentra : .one en contacto los elementos necesarios .ara la reacción7 [Portal de medicina molecular. FIBAO. !!"# [$#
(os ;actores 5ue in;lu:en so2re la actividad en!im"tica de manera directa son el .+ : la tem.eratura
del medio : los co;actores7 (os co;actores son com.onentes no .roteicos 5ue en ocasiones son
necesarios .ara 5ue la en!ima .ueda reali!ar su ;unción7
(a cinética en!im"tica estudia la velocidad de las reacciones catali!adas .or en!imas7 (a actividaden!im"tica se ve a;ectada .or cam2ios am2ientales .or lo 5ue la medida de velocidad se reali!a en
las condiciones ó.timas de .+ tem.eratura .resencia de co;actores : se utili!an concentraciones
saturantes de sustrato7 n estas condiciones la velocidad de reacción o2servada es la velocidad
m"xima 8=max97 [Casado %ela. !$!# [#
C&lculo de la 'm ( de la %ma) de un enzima
(a re.resentación gr";ica de la ecuación de Mic'aelis>Menten 8v4 ;rente a ?&@49 es una 'i.ér2ola
rectangular7 (a =max corres.onde al valor m"ximo al 5ue tiende la curva ex.erimental : la m
corres.onde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la
• Mientras se reali!a2a el extracto de la en!ima se eti5uetaron 6 tu2os de ensa:o : se colocaron
las siguientes cantidades de reactivo de acuerdo a la )a2la 1 .ara este .aso se utili!aron las
micro.i.etas de 1 ml : de 144 (7
)a2la 17 Cantidades de .irogalol : amortiguador corres.ondientes a los tu2os 1>G7
)u2o %mM isolución de
.irogalol
Enzima Bu**er
$ 4 4 04( /444
47/ /4 04( G34
4 47H/ H/ 04( IG/
5 1 144 04( IH4
6 17/ 1/4 04( I34
7 374 344 04( HH4
" 74 44 04( /H4
8 674 644 04( 0H49 1374 1344 04( 0HH4
• &e colocó 'ielo en una 2ande*a de aluminio donde .osteriormente se acomodaron los tu2os :a
.re.arados7 Con los reactivos listos : en 'ielo se .asó a encender el es.ectro;otómetro : se
a*ustó a una longitud de onda de 03/ nm7
• &e utili!ó el tu2o 1 como 2lanco7 Para ello se adicionó 471 ml del extracto de la .a.a al tu2o con
a:uda de una micro.i.eta seguidamente se agitó r".idamente : se vació en una celda7 &e
tomaron mediciones de a2sor2ancia cada 14 segundos .or 3 minutosE donde el tiem.o 4 ;ue
igual a los .rimeros 14 segundos *usto des.ués de 5ue se le agregara el extracto de la .a.a7• ste .rocedimiento se reali!ó con cada uno de los tu2os siguientesE ca2e destacar 5ue des.ués
de cada medición de a2sor2ancia se regresó la solución a los tu2os de ensa:o adem"s de 5ue
el extracto de la en!ima se mantuvo en el vaso de .reci.itado con 'ielo .ara evitar 5ue se
desnaturali!ara7
• (os resultados se .asaron a una 'o*a de xcel donde se .rosiguió a reali!ar las o.eraciones
Primeramente como se muestra en la sección 1 de los resultados se reali!aron las gr";icascorres.ondientes .ara cada tu2o considerando los datos de tiem.o : distancia7 e manerasiguiente se les a.licó una regresión lineal .ara o2tener la ecuación de la recta7 A .artir de ello sereali!aron las gr";icas de cada uno de los tu2os con a:uda de los datos de tiem.o : a2sor2anciao2tenidos7
Con 2ase a las ecuaciones de la recta o2tenidas se .uede mencionar 5ue el valor de la .endiente
relaciona a la a2sor2ancia con el tiem.o .ues indica cu"nta a2sor2ancia se .resentar" .orsegundo7 s .or esta ra!ón 5ue los valores de las .endientes los consideramos como unae5uivalencia de la velocidad 8=o9 como se muestra en la ta2la de la segunda sección de resultados7
Para la segunda sección en la 5ue se tiene 5ue reali!ar la gr";ica de Mic'aelis>Menten se tuvo 5uecalcular .rimeramente la concentración de .irogalol en mgJml en cada uno de los tu2osE :.osteriormente convertir esos valores a Milimolar 8Mm97
&in em2argo al reali!ar la gr";ica nos encontramos con 5ue el com.ortamiento de nuestra en!imano se acerca2a al ideal .or así decirloE es .or esto 5ue tuvimos 5ue .roceder a tomar en cuenta sololas .artes m"s rectas de cada una de nuestras gr";icas7 Con lo anterior nos re;erimos a calcular la
.endiente sólo con a5uellos valores continuos en los 5ue la a2sor2ancia ;ue en ascenso con;ormetranscurría el tiem.o7 K tal : como se muestra en la gr";ica 11 el com.ortamiento se acercó m"s ales.erado sin em2argo no ;ue ideal7
Posteriormente se ela2oraron las gr";icas de (ineDeaver BurL : adie +o;stee con las cuales sedeterminaría el valor de la =elocidad m"xima 8=max9 : el de la m 5ue es una constante 5ue indica laa;inidad con la 5ue la en!ima reconoce al sustrato7