Cinética Enzimática Prof. Rita de Cassia Siqueira Curto Valle Depto. Engenharia Química Universidade Regional de Blumenau
Cinética EnzimáticaProf. Rita de Cassia Siqueira Curto ValleDepto. Engenharia QuímicaUniversidade Regional de Blumenau
Cinética enzimática• Estuda a velocidade com que ocorrem as
transformações de reações catalisadas por enzimas.
• Velocidade de transformação de substrato em produto
• Leva à determinação de parâmetros cinéticos para deduzir a atividade enzimática, a afinidade da enzima pelo substrato e os mecanismos através dos quais leva a cabo a catálise.
Cinética enzimática - objetivos• Medir as velocidades das transformações que se
processam;• Estudar a influência de condições de trabalho
naquelas velocidades:▫ pH;▫ Temperatura;▫ Concentração de reagentes e das enzimas;▫ Concentração de inibidores e de ativadores;
• Correlacionar as velocidades das transformações com algum dos fatores que as afetam;
• Colaborar com a otimização do processo;• Estabelecer critérios para o controle de processo• Projetar um reator adequado
Atividade enzimática• É a velocidade na qual a enzima catalisa a
reação
• Unidades da atividade enzimática:U: quantidade de enzima que promove a formação de 1 μmol de produto por minuto
• Deve sempre estar referenciado à uma quantidade específica de amostra
• Exemplo: 20 U/g de mamão 1 g de mamão tem uma quantidade de enzima que transforma 20 μmol de substrato por minuto
Atividade enzimática• Unidades da atividade enzimática:• Katal: quantidade de enzima que transforma
1 mol de substrato por segundo ou forma 1 mol de produto por segundo
• Deve sempre estar referenciado à uma quantidade específica de amostra• Exemplo: 45 katal/mL de amostra 1 mL da
amostra tem uma quantidade de enzima que transforma 45 moles de substrato por segundo
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Temperatura
à medida que ↑T, ↑V da reação, até o ponto em que ↑T, vai V↓
T = temperaturaV = velocidade
Fatores que influenciam a atividade enzimática
• Temperatura▫ Estabilidade térmica
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Temperatura
▫ Tempo de meia vida (t1/2) – tempo no qual as enzimas perdem 50% da sua atividade numa determinada temperatura
Fatores que influenciam a atividade enzimática• pH
O sítio ativo da enzima está frequantemente composto de grupos ionizáveis que devem estar na forma iônica adequada para manter a conformação, unir os substratos ou catalisar a reação.
A atividade da enzima deve ser medida no pH ótimo
Fatores que influenciam a atividade enzimática• pH
à medida que ↑pH, ↑V da reação, até
o ponto em que ↑pH, vai V↓
• Fixam-se [E], [S] e a temperatura.
• Ex.: pHótimo para pepsina = 1,5 a 3
Fatores que influenciam a atividade enzimática• pH
▫ Resistência ao pH
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Concentração de enzima
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Presença de inibidores
▫ compostos que diminuem a velocidade da reação▫ Agem de diferentes formas Inibição competitiva Inibição não-competitiva
▫ Fármacos▫ Preservativos de alimentos▫ Compostos tóxicos
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Concentração de substrato
Elevadas concentrações de substrato podem preservar a estabilidade da enzima sob efeito da temperatura e do pH
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Concentração de substrato
à medida que ↑[S], ↑V da reação, até
o ponto em que ↑[S], V torna-se cte
V=Vmax
[E]; T e pH = ctes
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Concentração de substrato
▫ Concentrações altas a velocidade será máxima. Até o ponto de saturação da enzima não afeta a velocidade.
vo
[S]
Vmax
Fatores que influenciam a atividade enzimática• Concentração de substrato
▫ Desvios da linearidade ocorrem: Presença de inibidores na solução de enzima; Presença de substâncias tóxicas; Presença de um ativador que dissocia a enzima; Limitações impostas pelo método de análise.
Determinação da velocidade de reação• Complicador - a concentração do substrato
varia ao longo da reação à medida que este vai se transformando em produto.
Velocidade de reação
•Então como medir a velocidade de uma reação enzimática?
Velocidade de reação
• Limitar a velocidade em alta [S] devido à saturação dos sítios ativos da Enzima
• Determinar a velocidade inicial da reação v0 (velocidade inicial)
Velocidade de reação
[P] é baixa
Variações da concentração de substrato são negligenciáveis
Cinética de Michaelis e Menten• Modelo cinético que melhor explica a influência
das concentrações iniciais de enzima e substrato na velocidade inicial da reação enzimática
(1913)Leonor Michaelis -EnzimologistaMaud Menten - Pediatra
Cinética de Michaelis e Menten• Hipóteses:
▫ O substrato e a enzima reagem reversivelmenteentre si formando um composto intermediário denominado complexo enzima-substrato.
▫ O complexo formado ou se decompõe, regenerando a enzima e formando os produtos da reação.
Cinética de Michaelis e Menten
K1 = cte de velocidade de formação do complexoK2 = cte de velocidade de dissociação do complexoK3 = cte de velocidade de decomposição do complexo, formando produtov = velocidade de formação do produtoS = concentração inicial de substratoE = concentração inicial de enzimaP = concentração de produto
v
Cinética de Michaelis e Menten
• velocidade de catálise, ou velocidade inicial (v0) é igual ao produto da concentração de ES por k3
v0 = K3 [ES]
• A velocidade de formação de ES corresponde a k1 [E].[S]
• A velocidade de quebra de ES corresponde a (k2 + k3). [ES]
• A velocidade de formação de ES será: k1 [E].[S] = (k2 + k3). [ES]
A constante de Michaelis (KM) é definida como: Reescrevendo...
Cinética de Michaelis e Menten• Considerando que a concentração da enzima livre [E] corresponde à concentração da enzima total [ET], menos a concentração da enzima ligada [ES]
Como: v0 = K3 [ES]
Fazendo as devidas substituições
Condição reacional necessáriaComo a [S] >>> [ET], a E está saturada com o [S] e a [ES] = [ET]
Nestas circunstâncias, [S] é muito maior do que KMe [S] /([S] + KM) ~ 1
Nestas condições Velocidade máxima de formação de P = Vmax
Então Equação de Michalis-Menten
Cinética de Michaelis e MentenVo = V max [S]
Km + [S]
1) Se [S] é muito maior do que KM
2) Se [S] é muito menor do que KM,
Essa equação explica o comportamento da cinética de reações catalisadas por enzimas:
a velocidade da reação é máxima e independe da concentração do substrato
a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração de substrato.
Cinética de Michaelis e Menten
Vo = V max [S]
Km + [S]
3) Se [S] é igual a KM
Essa equação explica o comportamento da cinética de reações catalisadas por enzimas:
[S]
v
Vmax
2
v = Vmax
v = Vmax [S]Km
Km
2
1
3
Determinação de Km e Vmáx
• Método gráfico de Lineweaver-Burk
maxV1
[S]maxVmK
v1
+=
1[S]
1v
-1Km
1Vmax
KmVmax
Inclinação =
Determinação de Km e Vmáx
• Método gráfico de Eadie-Hofstee
[S]v
mK
maxVv −=
VmaxKm
v
-Km
Inclinação =
v[S]
Vmax
Determinação de Km e Vmáx• Método gráfico de Hanes-Woolf
[S]maxV1
maxVmK
v[S]
+=
[S]
[S]v
-Km
KmVmax
1Vmax
Inclinação =
Constante de afinidadeKM = K2 + K3
K1
Imaginando um caso limitante, em que k2 seja muito maior do que k3; isto significa que a dissociação do complexo ES em E mais S é mais rápida do que a formação de E mais produto (P). Portanto, quando k3 é muito menor do que k2,KM é igual à constante de dissociação de ES. Em outras
•Km alto – baixa afinidade•Km baixo – alta afinidade
•Km depende:o aspectos específicos do mecanismo de reação;o n° de passos da reação;o velocidades relativas dos passos individuais