BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang Mikroorganisme merupakan makhluk hidup yang sangat kecil dan sangat penting dalam memelihara keseimbangan ekologi dan ekosistem di bumi. Beberapa mikroorganisme bersifat menguntungkan dan ada pula yang bersifat merugikan, baik terhadap manusia maupun hewan. Sebagai contoh, mikroorganisme yang menguntungkan dapat dimanfaatkan dalam pembuatan makanan yang dapat dikonsumsi oleh manusia maupun hewan. Akan tetapi, tidak sedikit mikroorganisme yang dapat merugikan manusia yang dapat menimbulkan penyakit yang berbahaya bagi tubuh manusia (Maksum Radji, 2011). Mikroorganisme banyak terdapat dimana-mana, baik pada suhu tinggi seperti air panas, pada suhu rendah, pada semua jenis makanan maupun pada permukaan jaringan tubuh kita sendiri. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008). Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008). Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram-positif dan Gram-negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Dwijoseputro, 2003).
1
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus (Dwidjoseputro, 1994). Dengan pewarnaan Gram bakteri akan menyerap warna tertentu yaitu kristal violet. Dengan penguatan lugol, bakteri Gram positif akan tetap mengikat warna ungu meskipun ada penambahan alkohol dan fuschin atau safranin. Sedangkan bakteri Gram negatif akan melepaskan warna ungu dengan adanya penambahan alkohol 96% dan akan mengikat safranin atau fuschin sehingga sel bakteri berwarna merah. Dalam melakukan teknik pewarnaan Gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah Gram-positif atau Gramnegatif dimana pemeriksaan Gram preparat ini merupakan petunjuk awal dari identifikasi penentuan genus hingga spesies bakteri dengan melihat bentuk, sifat Gram, ada tidaknya flagel, spora, kapsul, dan sebagainya. Sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan Gram dan pembacaan preparat yang telah dibuat. 1.2 Rumusan Masalah1.2.1 Apa yang dimaksud dengan pewarnaan Gram (cat Gram)? 1.2.2 Bagaimana cara melakukan pewarnaan Gram (cat Gram)? 1.2.3 Bagaimana penggolongan bakteri yang terlihat saat hasil pewarnaan
diamati menggunakan mikroskop binokuler? 1.1 Tujuan1.1.1 Untuk mengetahui yang dimaksud dengan pewarnaan Gram (cat Gram) 1.1.2 Untuk mengetahui cara melakukan pewarnaan Gram (cat Gram) 1.1.3 Untuk mengetahui penggolongan bakteri yang terlihat saat hasil
pewarnaan diamati menggunakan mikroskop binokuler
1.2 Manfaat1.2.1 Agar mengetahui yang dimaksud dengan pewarnaan Gram (cat Gram) 1.2.2 Agar mengetahui cara melakukan pewarnaan Gram (cat Gram)
2
1.2.3 Agar mengetahui penggolongan bakteri yang terlihat saat hasil pewarnaan
diamati menggunakan mikroskop binokuler
3
1.2.4
BAB II DASAR TEORI2.1 Morfologi Bakteri Bakteri mempunyai bentuk dan ukuran yang sangat beragam. Sebagian besar sel bakteri memiliki diameter 0,2-2 mikron dan panjang 2-8 mikron. Berdasarkan bentuk bakteri digolongkan menjadi tiga golongan utama, yaitu bentuk kokus (bulat), bentuk basil (batang), dan bentuk spiral. Bakteri kokus biasanya berbentuk bulat atau lonjong, hidup sendiri-sendiri, berpasangan, membentuk rantai panjang atau kubus tergantung cara bakteri itu membelah diri dan kemudian melekat satu sama lain setelah pembelahan. Kokus yang kokus yang bentuknya kecil dan tunggal disebut mikrokokus (micrococcus) Kokus yang tetap berpasangan setelah membelah disebut dengan diplokokus (diplococcus). Streptokokus (streptococcus) adalah kokus yang membelah dalam satu bidang dan tidak memisahkan diri sehingga berbentuk rantai. Kokus yang membelah dalam tiga bidang yang saling tegak lurus sehingga membentuk kubus adalah Sarcinae, sedangkan kokus yang membelah membentuk gugusan atau berkelompok seperti buah anggur adalah bakteri Staphylococcus. Bentuk morfologi kokus yang berbeda-beda ini sering kali digunakan untuk identifikasi jenis bakteri golongan kokus. Bakteri basil adalah adalah golongan bakteri yang memiliki bentuk seperti batang atau silinder. Bakteri ini mempunyai ukuran yang sangat beragam. Basil umumnya terlihat sebagai batang tunggal. Beberapa bakteri basil berpasangan setelah pembelahan sel. Bentuk basil terdiri atas diplobasilus (diplobacillus), Streptobasilus (streptobacillus), dan kokobasilus (coccobacillus). Bakteri spiral adalah bakteri yang mempunyai bentuk yang tidak lurus seperti basil, tetapi mempunyai satu atau beberapa lekukan. Bakteri spiral dibagi menjadi vibrio yaitu bakteri yang berbentuk batang melengkung menyerupai bentuk koma, spirilum yaitubakteri yang berbentuk spiral atau pilinan dengan selnya yang kokoh, dan spiroketa yaitu bakteri yang berbentuk spiral dan tubuhnya sangat lentur sehingga dapat bergerak bebas. Kemampuan bergerak ini dimungkinkan karena
4
kontraksiyang lentur dari sumbu filamen atau flagel yang terdapat di permukaan dinding sel bakteri (Maksum Radji, 2011).
Gambar Berbagai Bentuk Bakteri 2.2 Struktur Sel Bakteri Seperti prokariot (organisme yang tidak memiliki membran inti) pada umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Sehubungan dengan ketiadaan membran inti, materi genetik (DNA dan RNA) bakteri melayanglayang di daerah sitoplasma yang bernama nukleoid. Salah satu struktur bakteri yang penting adalah dinding sel. Bakteri dapat diklasifikasikan dalam dua kelompok besar berdasarkan struktur dinding selnya, yaitu bakteri Gram-negatif dan bakteri Grampositif. Struktur sel bakteri antara lain : 1. Membran Sel Prokariotik Pada beberapa bakteri, membran mengelilingi sitoplasma tanpa menunjukkan adanya lipatan. Membran pada bakteri lain mengalami pelipatan ke dalam yang disebut mesosom. Pada bakteri fotosintetik, khlorofil tidak terdapat dalam suatu khloroplas, melainkan terdapat dalam membran yang sangat berlipat-lipat di dalam sel, yang disebut membran tilakoid. Sistem fotosintetik pada bakteri disamping
5
menggunakan khlorofil, juga karotenoid. Keduanya mengandung sistem transport elektron yangmenghasilkan ATP pada proses fotosintesis. 2. Dinding Sel Dinding sel bakteri bersifat agak elastis dan tidak bersifat permeable terhadap garam dan senyawa tertentu dengan berat molekul rendah. Secara normal konsentrasi garam dan gula yang menentukan tekanan osmotik di dalam sel lebih tinggi daripada di luar sel. Apabila tekanan osmosis di luar sel naik, air sel akan mengalir keluar, protoplasma mengalami pengkerutan, dan membran akan terlepas dari dinding sel. Proses ini disebut dengan plasmolisis. Dinding sel bakteri Gram-positif terdiri 40 lapis rangka dasar murein, meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun dinding sel Grampositif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan asam teikoat yang sangat spesifik. Dinding sel bakteri Gram-negatif hanya terdiri atas satu lapis rangka dasar murein, dan hanya meliputi 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya mengandung diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain. Senyawa-senyawa ini merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak terdapat dalam dinding sel ini. 3. Flagel dan Pili Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Letak flagel dapat polar, bipolar, peritrik, maupun politrik. Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun flagel adalah sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah. Ukuran flagel berdiameter 12-18 nm dan panjangnya lebih dari 20 nm. Pada beberapa bakteri, permukaan selnya dikelilingi oleh puluhan sampai ratusan pili, dengan panjang 12 nm. Pili disebut juga sebagai fimbrae. Sex-pili berperan pada konjugasi sel. Pada bakteri Escherichia coli strain K12 hanya dijumpai 2 buah pili. 4. Kapsul dan Lendir Beberapa bakteri mengakumulasi senyawa-senyawa yang kaya akan air, sehingga membentuk suatu lapisan di permukaan luar selnya yang disebut sebagai kapsul atau selubung berlendir. Fungsinya untuk kehidupan bakteri tidak begitu esensial, namun menyebabkan timbulnya sifat virulen terhadap inangnya. Keberadaan kapsul mudah diketahui dengan metode pengecatan negatif6
menggunakan tinta cina atau nigrosin. Kapsul akan tampak transparan diantara latar belakang yang gelap. Pada umumnya penyusun utama kapsul adalah polisakarida yang terdiri atas glukosa, gula amino, rhamnosa, serta asam organik seperti asam piruvat dan asam asetat. Ada pula yang mengandung peptida, seperti kapsul pada bakteri Bacillus sp. Lendir merupakan kapsul yang lebih encer. Adakalanya kapsul bakteri dapat dipisahkan dengan metode penggojokan kemudian diekstrak untuk menghasilkan lendir. 2.3 Pengecatan Gram Pada tahun 1884, seorang dokter berkebangsaan Denmark, Christian Gram, membuat zat warna khusus yang sangat penting dalam bidang bakteriologi. Prosedur pewarnaan Gram terdiri atas beberapa langkah yaitu :1. Sediaan bakteri difiksasi atau direkatkan di atas gelas preparat dan diwarnai
dengan karbol kristal ungu. 2. Zat warna kristal ungu tersebut kemudian dicuci dan dibilas.3. Sediaan diwarnai dengan larutan lugol (larutan I2 + KI) dan didiamkan selama 45-
60 detik.4. Larutan lugol ditiriskan dan sediaan dicuci dengan alkohol 96% selama 15-30
detik atau digoyang-goyangkan sampai tidak ada zat warna yang mengalir lagi.5. Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan air fuchsin selama 1-2 menit.
6. Sediian dicuci, dikeringkan, dan diperiksa di bawah mikroskop. Perbedaan hasil pewarnaan Gram pada bakteri Gram-positif dan Gram-negatif dapat dijelaskan oleh beberapa teori yaitu :1. Teori Salton. Teori ini menjelaskan bahwa dinding sel bakteri Gram-negatif
mengandung kadar lipid yang tinggi, sekitar 20%. Lipid ini dapat larut pada tahap pencucian sediaan dengan alkohol 96% sehingga pori-pori pada dinding sel membesar dan zat warna yang sudah diserap oleh sel akan dilepaskan kembali. Akibatnya, bakteri tersebut menjadi tidak berwarna. Sebaliknya, pada bakteri Gram-positif pencucian dengan alkohol 96% akan menyebabkan protein pada dinding sel mengalami denaturasi sehingga pori-pori mengecil dan kompleks ungu kristal iodium tetap terperangkap pada dinding sel sehingga bakteri berwarna ungu.2. Teori lain menyebutkan bahwa perbedaan warna bakteri Gram-positif dan Gram-
negatif berkaitan dengan permeabilitas dinding sel. Teori ini didasarkan pada7
ketebalan lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Susunan dinding sel bakteri Gram-positif terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal sekali (kurang lebih 30 lapisan) sehingga permeabilitas dinding sel bakteri Gram-positif kurang dan kompleks ungu kristal iodium tidak dapat keluar dari dinding sel. Lapisan peptidoglikan bakteri Gram-negatif sangat tipis, hanya 1-2 lapisan sehingga permeabilitas dinding sel bakteri Gram-negatif lebih besar dan memungkinkan keluarnya kompleks ungu kristal iodium dari dinding sel (Maksum Radji, 2011). Tabel Diferensiasi Zat Warna pada Proses Pewarnaan Gram No 1 Perlakuan Pewarnaan dengan karbol ungu kristal 2 Pemberian cairan lugol 3 Pencucian dengan alkohol 96% 4 Pewarnaan dengan air fuchsin Ungu Merah Ungu Tidak berwarna Ungu tengguli Ungu tengguli Gram-positif Ungu muda Gram-negatif Ungu muda Keterangan Zat warna diserap dalam dinding sel dan protoplasma Terbentuk kompleks ungu kristal iodium Zat warna dilaritkan oleh alkohol dan keluar dari sel Zat warna kontras air fuchsin akan menyebabkan sel bakteri Gram negatif berwarna merah
2.4 Identifikasi Bakteri Identifikasi jenis bakteri bukan suatu pekerjaan mudah karena memerlukan ketrampilan dan beberapa informasi untuk menentukan spesies bakteri yang akan diidentifikasi. Beberapa hal yang perlu diperhatikan antara lain :1. Ukuran, bentuk, dan susunan bakteri 2. Reaksi pewarnaan Gram
3. Gerakan bakteri : apakah ada bakteri yang bergerak atau tidak 4. Tipe flagel 5. Ukuran dan bentuk koloni bakteri8
6. Warna koloni 7. Konsistensi koloni bakteri Identifikasi bakteri, khususnya bakteri yang patogen untuk manusia, dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu : 1. Pengamatan sifat-sifat morfologi koloni bakteri 2. Pengamatan mikroskopis melalui pewarnaan bakteri 3. Identifikasi bakteri melalui uji sifat biokimia 4. Identifikasi bakteri berdasarkan profil DNA1.4.1 Identifikasi Bakteri Menggunakan Pengamatan Mikroskopis melalui
Pewarnaan Bakteri Berdasarkan perbedaan struktur dinding sel dan respon terhadap pewarnaan Gram, bakteri digolongkan menjadi bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif. Struktur dinding sel bakteri Gram-positif dan bakteri Gramnegatif adalah sebagai berikut :1. Dinding sel bakteri Gram-positif
Dinding sel kebanyakan bakteri Gram-positif terdiri atas beberapa laipsan peptidoglikan yang tebal dan kaku (20-80 nm). Hal inilah yang membedakan dari dinding sel bakteri Gram-negatif. Dinding sel bakteri Gramnegatif hanya terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tipis. Di samping itu, dinding sel beberapa bakteri Gram-positif mengandung substansi dinding sel yang disebut asam teikoat. Fungsi asam teikoat belum sepenuhnya diketahui, tetapi diperkirakan berperan dalam pertumbuhan dan pembelahan sel. Di samping itu, asam teikoat mempunyai sifat antigen spesifik sehingga dapat dimanfaatkan untuk mengidentifikasi spesies-spesies bakteri Gram-positif secara serologi (Maksum Radji, 2011).2. Dinding sel bakteri Gram-negatif
Dinding sel bakteri Gram-negatif terdiri atas satu atau lebih lapisan peptidoglikan dan membran di bagian luar lapisan peptidoglikan. Dinding sel bakteri Gram-negatif tidak mengandung asam teikoat. Karena hanya mengandung sedikit lapisan peptidoglikan, dinding sel bakteri Gram-negatif umumnya lebih rentan terhadap guncangan fisik.
9
Struktur dinding sel bakteri Gram-negatif lebih rumit daripada dinding sel bakteri Gram-positif. Membran luar sel bakteri Gram-negatif terdiri atas lipoprotein, fosfolipida, dan lipopolisakarida. Komponen lipopolisakarida dinding sel bakteri Gram-negatif sangat penting karena menunjukan toksisitas pada hewan. Karena bersifat toksik dan tidak terpisahkan dari sel bakteri, komponen ini disebut endotoksin. Tabel Ciri-Ciri Bakteri Gram-positif dan Bakteri Gram-negatif Ciri-ciri bakteri Gram-negatif Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Ciri-ciri bakteri Gram-positif Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat di dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
Kurang
rentan
terhadap Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti yang ungu kristal. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1%
senyawa penisilin. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. Komposisi nutrisi
dibutuhkan relatif sederhana. Tidak resisten terhadap
gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
10
Peka terhadap streptomisin Toksin Endotoksin yang dibentuk
KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Gambar Dinding Sel Bakteri Gram-positif dan Bakteri Gram-negatif
11
Contoh Bakteri Gram-positif
Contoh Bakteri Gram-negatif
12
BAB III METODE3.1 Waktu dan Tempat 3.1.1 Waktu Praktikum ini dilakukan dua tahap yaitu : 1. Tahap 1 Merupakan proses cara pewarnaan Gram preparat yang dilaksanakan pada Jumat, 17 Februari 2012 pukul 08.00 12.00 WITA. 2. Tahap 2 Merupakan proses pembacaan preparat bakteri yang telah diwarnai dengan pewarnaan Gram dilaksanakan pada Kamis, 23 Februari 2012 pukul 12.00 16.00 WITA. 3.1.2 Tempat Praktikum cara pewarnaan Gram preparat dan pembacaan preparat bakteri yang telah diwarnai ini, dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan Politeknik Kesehatan Denpasar.3.2 Alat, Bahan, dan Reagen
3.2.1 Alat 1. Kaca preparat (object glass) 2. Ose 3. Pinset 4. Api bunsen5. Mikroskop binokuler
6. Rak pewarnaan7. Label
8. Tissue 3.2.1 Bahan 1. Biakan bakteri 2. Oil immersi
13
3.2.1Reagen 1. Carbol gentian violet (Gram I) 2. Lugol/iodine (Gram II) 3. Alkohol 96% (Gram III) 4. Safranin/fuchin (Gram IV)
5. Air garam fisiologis6. Aquades
3.2 Langkah Kerja 3.2.1 Pembuatan Sediaan1. Diambil kaca preparat, diberi label, dan difiksasi kaca preparat.
2. Diambil ose, lalu dipanaskan dalam api bunsen.3. Diambil satu ose aquades, diteteskan pada kaca objek. 4. Dibuka cawan petri yang berisi sampel. Diambil satu ose koloni,
dicampur dengan aquades pada kaca preparat. 5. Dihapuskan pada kaca preparat.6. Diletakkan pada posisi miring dan dikeringkan pada suhu kamar.
7. Setelah kering, difiksasi lagi sebanyak 3 kali.8. Dilakukan pewarnaan Gram pada preparat.
3.2.1 Fiksasi Fiksasi dilakukan dengan cara mengelilingi kaca preparat pada api bunsen sebanyak tiga kali. 3.2.2 Pewarnaan1. Diteteskan cat Gram I yaitu carbol gentian violet pada kaca preparat,
ditunggu hingga 1 menit, lalu dibilas dengan aquades.2. Diteteskan cat Gram II yaitu lugol/iodine pada kaca preparat, ditunggu
hingga 1 menit, lalu dibilas dengan air aquades.3. Diteteskan cat Gram III yaitu alkohol 96%
pada kaca preparat,
ditunggu hingga menit, lalu dibilas dengan aquades.4. Diteteskan cat Gram IV yaitu safranin/fuchsin pada kaca preparat,
ditunggi -1 menit, lalu dibilas dengan aquades.5. Dikeringkan dengan cara dianginkan dan diletakkan pada rak preparat.
3.2.1 Pembacaan1. Disiapkan mikroskop diatas meja kerja yang rata dan kokoh. 14
2. 3. 4.
Diatur posisi duduk (ergonomi) yang baik agar tidak mengganggu pengamatan. Dihubungkan mikroskop ke arus listrik. Dihidupkan mikroskop dengan menekan tombol on/off pada mikroskop untuk memulai langkah selanjutnya.
5. Diletakkan slide pada meja mikroskop. 6. Diatur lensa objek pada posisi 10X.
7. 8. 9.
Dinaikkan makrometer full ke atas. Diturunkan pelan-pelan hingga menemukan lapang pandang. Setelah mendapatkan lapang pandang, diatur fokus mata kanan dan mata kiri dengan mengatur cincin diopter pada lensa okuler.
10. Ditutup diafragma. 11. Dinaikkan kondensor, diturunkan pelan - pelan hingga menemukan
polygon. 12. Dibuka diafragma seluas lapang pandang. 13. Diteteskan oil imersi dengan mencari celah diatara lensa objektif.14. Diputar lensa objektif ke 100X.
15. Diatur
mikrometer,
jika
kurang
terang,
diterangkan
dengan
membesarkan lampu.16. Dilakukan identifikasi bakteri Gram apa yang ditemukan Bakteri Gram positif berwarna ungu. Bakteri Gram negatif berwarna merah.
15
BAB IV PEMBAHASAN4.1 Data Hasil Pengamatan 4.1.1 Preparat I
Pembesaran Lensa Objektif 100X + Oil Immersi Ciri-ciri yang terlihat1. Bentuk 2. Warna 3. Penataan 4. Sifat Gram
: batang (basil) : ungu : bergerombol : Gram-positif
Interpretasi hasil : Gram +, Basil +
4.1.2 Preparat II
Pembesaran Lensa Objektif 100X + Oil Immersi
16
Ciri-ciri yang terlihat1. Bentuk 2. Warna 3. Penataan 4. Sifat Gram
: batang (basil) : ungu : berantai : Gram-positif
Interpretasi hasil : Gram +, Basil +
4.2 Pembahasan Pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni Gram-positif dan Gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram-positif dan Gram-negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Pengecatan Gram mempunyai kelebihan dimana pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram-positif dan Gram-negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Selain itu kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram-negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptif diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Dalam proses pewarnaan Gram, hal pertama yang perlu dipastikan adalah gelas objek yang digunakan harus bersih, bersifat steril, dan tidak terkontaminasi. Lalu dilanjutkan dengan proses pelabelan agar bakteri yang nantinya akan kita warnai tidak tertukar. Selanjutnya dilakukan proses fiksasi, dimana tujuan dari fiksasi ini antara lain melekatkan bakteri pada gelas objek, menonaktifkan mikroorganisme (bakteri), dan mengawetkan mikroorganisme yang berada di atas slide. Kemudian ditetesi dengan aquades dan diapuskan dengan sediaan bakteri. Preparat yang telah diapuskan lalu dikeringkan dengan posisi miring. Tujuan dari diletakkan dalam posisi miring ini agar bakteri menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di17
atas objek gelas, dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Setelah itu baru dilanjutkan dengan proses pewarnaan Gram. Dalam pewarnaan Gram diperlukan empat reagen yaitu : 1. Zat warna utama (Carbol Gentian Violet)2. Mordan (larutan Iodin atau Lugol) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama3. Pencuci atau peluntur zat warna (alkohol 96% atau aseton) yaitu solven organik
yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama4. Zat warna kedua atau cat penutup (safranin atau fuchsin) digunakan untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol Zat warna carbol gentian violet dan larutan lugol akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna ungu. Setelah pencucian dengan alkohol 96%, beberapa kelompok bakteri dapat melepaskan zat warna ungu dengan mudah, sedangkan kelompok yang lain dapat mempertahankan zat warna ungu tersebut. Bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu pada pencucian dengan alkohol 96% merupakan bakteri Gram-negatif, sedangkan kelompok bakteri yang mempertahankan zat warna ungu tersebut merupakan bakteri Gram-positif. Karena tidak berwarna setelah dicuci dengan alkohol 96% bakteri Gram-negatif perlu diwarnai dengan zat warna lain untuk mengetahui bentuknya di bawah mikroskop, yaitu dengan zat warna merah safranin atau fuchsin. Dengan demikian, bakteri Gram-negatif akan berwarna merah. Sebaliknya, zat warna ungu yang tidak tercuci oleh alkohol 96% pada bakteri Gram-positif menyebabkan penambahan zat warna merah safranin tidak menimbulkan pengaruh. Dengan demikian, sel bakteri Grampositif tetap berwarna ungu atau biru lembayung. Setelah proses pewarnaan Gram selesai, dilanjutkan dengan pembacaan preparat yang sudah diwarnai. Pembacaan preparat menggunakan mikroskop binokuler dengan pembesaran lensa objektif 100X ditambah oil immersi. Hasil pembacaan dari dua preparat yang telah dibuat diperoleh warna sel bakteri berwarna ungu sehingga memiliki sifat Gram yaitu Gram-positif. Dilihat secara morfologi, bentuk bakteri pada preparat adalah bentuk batang (basil). Struktur dinding selnya terlihat tebal dan berlapis tunggal. Dari segi penataan, untuk preparat I penataan bakterinya bergerombol sedangkan preparat II penataan bakterinya berantai.
18
BAB V PENUTUP1.1 Simpulan
19
1.1.1Pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar yaitu Gram-positif dan Gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.1.1.2Dalam pewarnaan Gram digunakan empat macam reagen antara lain zat
warna utama (Carbol Gentian Violet), Mordan (larutan Iodin atau Lugol) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama, pencuci atau peluntur zat warna (alkohol 96% atau aseton) yaitu solven organik yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama, dan zat warna kedua atau cat penutup (safranin atau fuchsin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.1.1.3Dalam identifikasi bakteri menggunakan pewarnaan Gram yang diamati
menggunakan mikroskop binokuler dengan pembesaran lensa objektif 100X + oil immersi, sel bakteri tersebut digolongkan kedalam bakteri Gram positif dan berbentuk batang (basil). 1.2 Saran 1.2.1Diharapkan agar praktikan mengikuti prosedur kerja secara benar agar proses pewarnaan Gram ini dapat diperoleh hasil yang baik sehingga mudah untuk diamati menggunakan mikroskop.1.2.2Dalam melakukan teknik pewarnaan Gram haruslah sesuai prosedur agar
tidak mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah Gram-positif atau Gram-negatif.
DAFTAR PUSTAKAhttp://rudyregobiz.wordpress.com/bakteri-Gram-dan-pewarnaannya-2/
20
http://wawan-junaidi.blogspot.com/2010/02/makalah-tentang-pewarnaan-Gramatau.html http://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/12/macam-macam-teknik-pewarnaanbakteri/ http://id.shvoong.com/exact-sciences/biology/2143074-pewarnaan-bakteri-Grampositif-dan/#ixzz1naEO9YOa Jati, Wijaya. 2007. Aktif Biologi. Jakarta : Ganeca Exact Radji, Maksum. 2011. Buku Ajar Mikrobiologi. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC
21
