Le metodologie di studio del cervello: SYSTEMS BIOLOGY Alessia Stell 13.04.10.

Le metodologie di studio del cervello: SYSTEMS BIOLOGY

Alessia Stell13.04.10

IV secolo A.C

IPPOCRATE ipotizza che il cervello sia sede dell’intelli-genza

IV secolo A.C

ARISTOTELE considera il cervello come un meccanismo di “raffreddamento” del sangue.

MEDIOEVO

Si studiano disturbi neurologici e psichiatrici(tra cui il mal d’amore)

1674

Anton van Leeuwenhoek costruisce il primo microscopio

La nascita delle neuroscienze

“La reazione nera”

neuroni come entità singole che sono in contatto e si succedono l'una all'altra

Studio del cervello: UN APPROCCIO RIDUZIONISTICO

Studio del cervello: UN APPROCCIO OLISTICO

“lo studio delle interazioni e degli interscambi che

avvengono a diversi livelli dell’informazione biologica”

Il confronto dei due approcciAPPROCCIO RIDUZIONISTICO

Focalizzato su pochi geni e sui loro prodotti proteici

Si ottiene solo una comprensione parziale dei complessi meccanismi eziopatologici

APPROCCIO SYSTEMS BIOLOGYI sistemi biologici vengono affrontati non più come insieme di entità separabili, ma come

network di molecole interagenti, che si influenzano a vicenda

Permette di comprendere la complessità di un sistema in termini di cambiamenti quantitativi

e temporali.

Da dove deriva la complessità del nostro organismo?

25.000 geni codificanti

Il tutto è maggiore della somma delle sue singole parti

Systems Biology cerca di studiare le PROPRIETA’ EMERGENTI

Queste proprietà sono caratteristiche inattese dell’insieme, che non possono essere dedotte se osserviamo solo i componenti e non l’interazione complessa

Da Systems Biology a Systems Neuroscience

302 neuroni5000 connessioni

Possono essere usati tool computazionali per definire le connessioni Possono essere mappate le interconnessioni nervose specifiche di determinati pathways e circuiti

comportamentali Possono essere quindi tracciate relazioni causali dirette tra l’attività neuronale e il comportamento

C.Elegans

Da Systems Biology a Systems Neuroscience

100 miliardi neuroni5 x 10^14 connessioni

Devono essere utilizzati approcci diversi che consentano di comprendere la complessità

Metodi di studio di Systems Biology

Genomica Sequencing

Epigenomica ChIP-chip, ChIP-seQ…

Trascrittomica Microarray e Sequencing

Proteomica Mass Spectrometry e Protein Microarrays

Sequencing

Porta alla determinazione della struttura primaria di un polimero• Metodo Sanger• Automatizzazione del metodo di Sanger• Next-Generation Sequencing

Sequencing – Metodo Sanger

1975

dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs), lacking a 3'-OH group required for the formation of a phosphodiester bond

between two nucleotides

chain-terminator method

Sequencing - Automatizzazione del metodo di Sanger

2000

1975

Sequencing – SHOTGUN Sequencing

Human Genome Project

Sequencing – Next Generation

Sanger: 0.1 Mbp/dayNGS: 5 Gbp/day (5000 Mbp/day)

Incremento di 50.000 volte

Throughput: Costi:

Sanger: 500$/MbNGS: 1-2$/Mb

Riduzione 500 volte

Sequencing – Next Generation

Roche 454

Illumina Solexa

Abi SoLID

Sequencing – Solexa Technology

Epigenomica

Modificazioni della architettura del DNA, non dovuta a modificazioni della struttura primaria (sequenza)

• ChIp-chip / ChIP-Seq• DamID

EpigenomicaModificazioni degli Istoni (N-term)

Acetilazione Metilazione

UbiquitilazioneFosforilazioneSumoilazione

Modificazioni del DNA

Metilazione

Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq

Il principio della Chromatin immunoprecipitation è quello

di ISOLARE le porzioni di cromatina che interagiscono con proteine specifiche (in

questo caso ISTONI) dal complesso miscuglio di DNA, attraverso l’uso di ANTICORPI

specifici

Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq

ChIP-Seq

Identificando le sequenze, si può capire DOVE si localizzano i gli istoni, quanto è compatta la cromatina, e se queste condizioni cambiano nel tempo o in condizioni diverse

Epigenetica - DamID (DNA adenine methyltransferase identification)

DNA-binding protein as a fusion protein with DNA adenine methyltransferase

localizes the methyltransferase in the region of the binding site Adenosine methylation

Trascrittomica

Modificazioni dell’espressione del DNA, quindi dei livelli di RNA messaggero

• Real Time PCR• Expression Microarrays

Proteomica

Modificazioni del livello delle proteine all’interno di una cellula, e della loro funzione

• Mass Spectrometry• Protein Microarrays

Proteomica – Mass SpectrometryDeterminazione della struttura elementare di un campione o di una molecola (peptidi).Il principio della massa si basa sul diverso rapporto massa/carica dei componenti che

vengono ionizzati e accelerati in un campo elettrico

Ionizzazione: MALDI (matrix-assisted laser

desorption/ionization)

Campo Elettrico Detector

Proteomica – Protein Microarrays

Per determinare la presenza e quantificare la proteina di interesse

in un campione

Esempi di studi Systems Biology

• Epigenetica & Trascrittomica• Genomica & Trascrittomica• Proteomica

Biology today relies heavily on genomic data for hypothesis

building.Replacement from “descriptive science” to “discovery science”

Epigenetica & Trascrittomica

altered epigenetic profiles in human neoplasia

Uso di anticorpi specifici per Citosine metilate

ChIP-chip

Cancer Biol 2009

Genomica & Trascrittomica

Science 2008

Scopo: identificare alterazioni geniche in pazienti con GBM, e la loro associazione con la patologia

Genomica: sequencing Trascrittomica:Microarrays Fisiologia:survival

Isocitrate Dehydrogenase 1_- non associato precedentemente con GBM- altamente mutato in GBM (mutazioni puntiformi G>A)- associato a miglior survival

Proteomica

Proteomica è il metodo di elezione per lo studio delle proteine delle vescicole post-sinaptiche, poiché i profili di espressione non sono in grado di fornire dati

accurati

Identificazione dei complessi con la proteina PSD-95(post-synaptic protein) identificarte 118 proteine

Identificazione dei pathways in cui tali proteine sono coinvolte (schizofrenia)

Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY

Data Sharing Network

Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY

Data Sharing Network

Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

Data sharing“omics” reaserach richiede non solo una

strumentazione high-throughput e un team multidisciplinare di biologi, informatici, statistici, ma

richiede anche, e in modo fondamentale, un cambio di prospettiva.

In questa nuova prospettiva assume un ruolo fondamentale il DATA SHARING

• Brain Atlases• Human proteome Project

Allen Brain Atlas

• Mouse Brain• Developing mouse brain• Mouse spianl cord• Human Cortex

http://www.brain-map.org/

In situ Hybridization

Per combinare GENOMICA e NEUROANATOMIA, creando una mappa di

espressione genica nel cervello

GENSAT

GENE EXPRESSION NERVOUS SYSTEM ATLAS

Database pubblico di espressione genica ne SNC di topo allo stato embrionale e nel topo adulto

Basato su bacterial artificial chromosome (BAC)-transgenic reporter mice

Human Brain proteome project

HUPO BPP is an open international project under the patronage of the Human Proteome Organisation (HUPO) that aims:

· to analyze the brain proteome of human as well as mouse models in healthy, neurodiseased and aged status with focus on Alzheimer'sand Parkinson's Disease· to perform quantitative proteomics as well as complemantary gene expression profiling on disease-related brain areas and bodily fluids· to advance knowledge of neurodiseases and aging in order to push new diagnostic approaches and medications· to exchange knowledge and data with other HUPO projects and national / international initiatives in the neuroproteomic field· to make neuroproteomic research and its results available in the scientific community and society

Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY

Data Sharing Network

Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

Network

SYSTEMS BIOLOGY integra dati che derivano da analisi genetiche, gene

expression, esperimenti di proteomica e neurobiologici

NETWORKSsistemi di unità interconnesse in grado di

interagire e influenzarsi a vicenda

Quando i network sono studiati nel loro insieme, emergono proprietà che non

possono essere derivate dall’analisi individuale dei componenti

WGCNAFrom LISTS of genes… …To networks

WEIGHTED GENE CO-EXPRESSION NETWORK ANALYSIS (WGCNA)

Il profilo di espressione può essere organizzato in networks secondo correlazioni

di espressione

WGCNA: esempio

Nature Neuroscience 2008

Cortical Areas

Caudate Nucleus

Network: esempio di studio di geni coinvolti in Atassia

PROTEOMICA +

BIOINFORMATICA

Identificazione di proteine che

interagiscono con proteine atassia-

specifiche

Identificazione di nuovi partner attraverso lo

studio di database di interazioni

altre 7000 proteine

Identificazione di nuovi pathway

coinvolti in atassia e altre patologie

degenerative

Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY

Data Sharing Network

Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

Integrating genotypic and phenotypic data

Expression Quantitative Trait Locus (eQTL) analysis

Genotypic Data:SNPs in un campione di pazienti

Phenotypic Data:Espressione Genica

Determinare quali regioni del genoma sono più INDICATIVE di uno stato fisiologico o patologico

Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY

Data Sharing Network

Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica

Simulazioni e Bioinformatica“We’re literally drowning in data. We have lots

of scientists who spend their life working out important details, but we have virtually no idea

how all these details connect together.

Blue Brain is about showing people the whole.”(Henry Markram, director of BBP)

Simulazioni e BioinformaticaBLUE BRAIN PROJECT

- Iniziato nel 2005- Più di 2000 microchips connessi

- 22.800 miliardi di operazioni al secondo

Raggiunto primo traguardo: Simulazione del firing in una colonna neocorticale

(10.000 neuroni/30 milioni di connessioni)

Conclusioni

• Systems Biology è “lo studio delle interazioni e degli interscambi che avvengono a diversi livelli dell’informazione biologica”

• E’ possibile grazie all’avvento di nuove tecniche di throughput e informatiche

Conclusioni

Le scienze “omiche” non andranno a sostituire le scienze riduzionistiche. Gli approcci “omici” offrono

una nuova base su cui le scienze riduzionistiche possono essere fondate, dal momento in cui

permettono di testare molte ipotesi in parallelo e offrono un contesto di ampio respiro per

l’interpretazione dei dati.