Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones ... · -IIV-Madura: CD1a y CD3mb ... CH3-C-O Cl O COOH H Cl HO OH Cl O COOH H Cl HO O Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation...

Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica,

Investigación y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.

Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Concepción, 16 de Agosto de 2004

¿Qué es la Citometría de Flujo?

Aplicaciones

Flow Cytometry Publications/year

300300

600600

0 13 28 79113

480611

811940

1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1991 19921989 1990 1993 1994

(*) Data taken from Medline search using the keywords: “flow Cytometry”(Agost 15th: 20:30 hrs)

1995 1996

2003: 5.588 2004: 3.205 (*)

1999: 4.2561998: 3.8891997: 3.613

2002: 5.3232001: 5.0252000: 4.771

2,713Papers2,4452700

21002100 1,855

180018001,494

15001500 1,232

1,07812001200

900900

¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??

La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición simultánea de

múltiples características físicas y químicas de células en

suspensión”

¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA

CELULA?

1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad

interna.3.- Evaluación de características químicas:

• Fluorocromos

• Anticuerpos conjugados con fluorocromos

FACS: Fluorescence activated cell sorter

Relative Sizes of Biologicals

AmoebaLymphocyte

S.aureus5-8 µm

15-30 µm

Componentes• Sistema de Fluidos

• Sistema Optico:

• Fuente de luz

• Separación espectral

• Sistema Electrónico:

• Control mecánico, de luz y detectores

• Colección y análisis de pulsos

• Sistema Informático:

• Análisis y presentación de datos

Flow Cell

Injector Tip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

Focused laserFocused laserbeambeam

Sheathfluid

SISTEMAS DE UN CITOMETRO SISTEMAS DE UN CITOMETRO DE FLUJODE FLUJO

Sistema Optico:•Consta de uno o varios láseres, filtros, lentes y fotomultiplicadores.

•El láser produce una luz monocromática utilizada para la excitación de los fluorocromos.

Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

DichroicFilters

BandpassFilters

Flow Cytometry OpticsFlow Cytometry Optics

Flow cell

Lasers• Argon laser• He-Ne Laser

Optical Collection systems

He-Cd Laser Argon Laser He-Ne Laser2nd Argon Laser

Elite Cytometer with 4 Lasers

Water cooled argon laser

He-Cd laser

Air-cooled argon laser

Santa clause

ANTICUERPOS MONOCLONALES

• Gran disponibilidad comercial

• Gran variedad de fluorocromos

• Precios accesibles• Pedidos vía Internet• Gran Calidad

FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS

Fluorescein (FITC)EmissonExcitation

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Wavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

ive In

Protein

Phycoerytherin (PE)Excitation Emisson

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Protein

Propidium IodideEmissonExcitation

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

ive In

Allophycocyanin (APC)Protein 632.5 nm (HeNe)

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Excitation Emisson

CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO

PREPARACIONDE LA MUESTRA

OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR

CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOPREPARACION DE LA MUESTRA

Procedimiento St.:• 100 µL de sangre total • 10 µL del Ac. conjugado • Incubar por 10-15 minutos RT • Añade el lisador • Leer en un citómetro de flujo

PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRA

• CALIBRACION• ADQUISICION• ANALISIS

FITC Fluorescence

CD4 CD8

leu11a

CD20 Tube

FORMA DE PRESENTACION DE DATOS

• Histograma• Gráfico de Puntos (Dot Plot)• Gráfico de Contorno (Countour Plot)• Gráfico Isométrico (3D)• Gráfico de Densidad (Density Plot)

Citometría de flujo: mediciones

“GATE”

SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN

Density Dot Plot Contour Plot

Color of dots can give indication Identify subpopulationsof frequency of events with proper contour lines

HISTOGRAMA(Un Parámetro)

Autofluorescenciay/o

control isotipo

One parameter frequency histogram

# of events forparticular parameter

establish regions and calculate coefficient of variation (cv)cv = stdev/mean of half peak

ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

Autofluorescenciay/o

control isotipo

ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES

• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . .

• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología

EVOLUCION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Inmunología Celular

Aplicaciones enPatología

AnticuerposMonoclonales

Citometría deFlujo

CITOMETRIA CLINICA

CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,

fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS

• Linfocitos T totales :CD3(+)• Linfocitos T Helper :CD3(+)CD4(+)• Linfocitos T Sup/Citot :CD3(+)CD8(+)• Linfocitos B :CD3(-)CD19(+)• Linfocitos Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)

• Relación Linfocitos T CD4/CD8

Infección VIH-SIDA

File: 111.003Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12430Total Events: 15000

Quad Events % Gated % TotalUL 20 0.16 0.13UR 1496 12.04 9.97LL 2028 16.32 13.52LR 8886 71.49 59.24

RELACION CD4/CD8 = 0.17File: 111.004Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12512Total Events: 15000

Quad Events % Gated % TotalUL 600 4.80 4.00UR 8866 70.86 59.11LL 1499 11.98 9.99LR 1547 12.36 10.31

EXAM EN R ESU LTAD O R AN G O R EFER EN CIA

LE U C O C ITO S TO TA LE S 8.500 x m m 3

LIN FO C ITO S A B SO LU TO S 2.295 x m m 3

LIN FO C ITO S T (C D 3) 1.91683.50

x m m 3

% 59.4 - 84.6 %

LIN FO C ITO S B (C D 19) x m m 3

% 6.4 - 22.6 %

LIN FO C ITO S T (C D 4) 12.04276

%x m m 3

28.5 - 60.5 %

LIN FO C ITO S T C IT/SU P (C D 8) 70.861.626

%x m m 3

11.1 - 38.3 %

R E LA C IO N T C D 4 / C D 8 0.17 1.2 - 2.1

C E LU LA S LIN FO ID E S N K(N A TU R A L K ILLE R )

x m m 3

INFECCION VIH SIDA

ACTIVACION DE LINFOCITOS T: CD38

• El aumento en la expresión de moléculas CD38 en LT CD8 es un fuerte indicador pronóstico de progresión hacia SIDA y muerte.

• Superior a:• Rto. LT CD4• Marcadores solubles• Combinación HLA-DR+ CD38+

J. Acquir Immune Defic Syndr Retrovirol 16:83-92, 1997Cytometry 26:1-7, 1996Cytometry 33:115-122, 1998

INFECCION VIH SIDA

GIORGI et al.

• Carcaterizaron el número de moléculas CD38 en LT CD8:

1.- < 2.470 =======> PROGRESOR LENTO2.- 2.470 - 3.899====> PROGRESOR BAJO3.- 3.900 - 7.250====> PROGRESOR ALTO4.- > 7.250 =======> PROGRESOR RAPIDO

• Basado en la probabilidad de desarrollar SIDA dentro de 3 años

Cytometry 33:123-132, 1998J. Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 16:83-92, 1997

Copyright Dennis Kunkel

INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos

celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”

HEMATOPOYESISSTEM CELL

CFU-MLCFU-GEMM

LINFOCITO B LINFOCITO TCFU

ERITROIDEMEGACARIOCITO

CFUBASOFILO

CFUEOSINOFILO

CFU-GM

ERITROCITO BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO

PLAQUETAS MONOCITO

RETENCION DE ANTIGENOS

• Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados

CD19 CD19

Transformación

MalignaCELULA

PRE-B NORMALCELULA

LEUCEMICA

CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg

•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb

•LMA : -LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)

Características normales

• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda

Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II:Común)

Cellular Function

• Phagocytosis• Killing index of phagocytes• Intracellular cytokines• Calcium flux• Oxidative burst• Membrane potential

Phagosome

NADPH + H+

NADPHOxidase

GSHGR GP

H2O2SOD

Catalase

H2O + O2

PCB(Reduced GSH level)

PKC(PMA)

Lipid Peroxidation

Phospolipase A2 activityLeukotrienes

Human Neutrophil

Stimulant

DCFH-DA DCFH DCFDCF

O-C-CH3

OCH3-C-O

Fluorescent

Hydrolysis

Oxidation

2’,7’-dichlorofluorescin

2’,7’-dichlorofluorescin diacetate

2’,7’-dichlorofluoresceinCellular Esterases

DCFH-DA

DCFHDCFH--DADA

DCFHDCFH

H OH O2 22 2Lymphocytes

Monocytes

Neutrophils

log FITC Fluorescence.1

1000100101

PMA-stimulated PMNControl

• Adulto normal• No estimulado :• Estimulado con PMA :

25.86 %76.98 %

Estallido respiratorio en Granulocitos

No estimulado

Estimulado

Estallido respiratorioCaso clínico:

• Paciente de sexo femenino• 8 años• Infecciones dérmicas recurrentes por S.aureus.• Granulomas fríos en cara y piernas• Déficit parcial de IgA.

• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos.

• Inicio de terapia antibiótica con claritromicina 250 mg/12 hrs por 30 días.

• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos, post terapia.

DCFA DCFADespués de terapia antibiótica

Estallido respiratorio en Granulocitos

No estimulado: 33.35 %

Estimulado: 42.66 %

Estimulado: 57.48 %

DCFA DCFA

Estallido respiratorio en Monocitos

Estimulado: 57.06 %

Estimulado: 76.81 %

Después de terapia antibiótica

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,

Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo.

Bacterias: Uso de Microesferas (beads)

Anti Ig humana conjugada

Suero paciente

Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806Cytometry 1994;18:103-108

Aplicaciones en Microbiología

Aplicaciones en Microbiología clínica

Detección directa:

• Bacterias

• Hongos

• Parásitos

• Virus

Light Scatter of Bacterial Spores

B.anthracis

B.subtilis

irradiated B.anthracis

Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores, live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores.

Microbial Identification Using Antibodies

Enumeration & identification of target organisms in mixed populations

Examples include:• Legionella spp. in water cooling towers• Cryptosporidium & Giardia in water reservoirs• Listeria monocytogenes in milk• E.coli O157:H7 in contaminated meat• Bacillus anthracis & Yersinia pestis biowarfare agents

Agentes antibacterianos:• Microbiología tadicional (18-24 horas)• Citometría de flujo (pocas horas)• Evaluación de parámetros metábolicos:

• Potencial de membrana• Tamaño celular• Cantidad de ADN• Pruebas de suceptibilidad:

• Efecto bacteriostático• Efecto bactericida

Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC

Universidad de Concepción, ChileHospital del Trabajador Concepción, Chile

In vitro STUDIES OF pH EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES.

Strain ATCC43504 Strain 747LO-Skolen, Helsingør, Denmark, July 4-7, 2002

Susceptibilidad bacteriana

Combinación de:• Tamaño (FSC)• Granularidad (SSC)• Fluorescencia:

• Fluorocromos para ADN y ARN• Fluorocromos para ensayos metabólicos:

• Unión a proteínas• Potencial de membrana

Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195Cytometry 1997;27:169-178

• S. aureus

• Depolarizaciónen 1 hora.

• Potencial demembranapermanece disminuido.

Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834

CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer

• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:

• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes

• Cáncer de Esófago• Linfoma

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINALEspectro de presentación.

Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa

Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

GranulomatosaCongestión ulcerativa

Cáncer

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa

Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):

• Células epiteliales C.P.A.

• Macrófagos Moduladores

• Linfocitos: TCD4 Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal InflamationFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

ENFERMEDAD DE CROHN COLITIS ULCEROSA

Proceso inflamatorio difuso continuo, limitado al colon

Afecta a todo el tracto digestivo

Inflamación superficial de la mucosa

Proceso transmural y granulomatoso

Presencia de pseudopólipos

Compromiso de mucosa discontinuo

Colon normal

CrohnCrohn

Macrófagos intestinales:

• Están localizados en la región subepitelial de la mucosa.• Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares

de la lamina propia. • Detección de su fenotipo:

• Inmunohistoquímica• Citometría de Flujo

• Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos encontrados en mucosa de EII y en personas que no la presentan

Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75 Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44

Pacientes:

UNIVERSO (n=70)

SOSPECHA CLINICA (+)ENDOSCOPIA (+) (n = 52) GRUPO

TESTIGO(n = 18)

HISTOLOGIA NO ESPECIFICA

(n = 38)

EII POR BIOPSIA (n = 14)

Método

Dgto. de EII: Clínico, endoscópico

e histológico Grupo de EII

Controles clínicos regulares Grupo testigo

Criterio de Exclusión

Consentimiento informado

Endoscopía

HLA-DRCD33

CD16CD33

Materiales y Métodos

Biopsia2 x 2 mm Disgregación

mecánica

30` oscuridad

FACSCalibur Software Cell-Questv.3.3

Mínimo de 10000 eventos

Pacientes según fenotipo HLA-DR en MI y diagnóstico de EII

Fenotipo MIEII-CH

100 (14)

p<0.001

Testigo

11.11 (2)

88.89 (16)

100 (18)

65.71 (46)

34.29 (24)

100 (70)

HLA-DR(+)

HLA-DR(-)

Sospecha Clínica

78.94 (30)

21.06 (8)

100 (38)

p<0.001

Subtotal

84.61 (44)

15.39 (8)

100 (52)

p<0.001

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.001

Fenotipo MIEII-CH

85.71 (12)

14.29 (2)

100 (14)

P>0.05

Testigo

55.55 (10)

44.45 (8)

100 (18)

74.28 (52)

25.72 (18)

100 (70)

CD16 (+)

CD16 (-)

Pacientes según fenotipo CD16 en MI y diagnóstico de EII

78.94 (30)

21.06 (8)

100 (38)

p<0.05

Subtotal

80.76 (42)

19.24 (10)

100 (52)

p<0.05

Sospecha Clínica

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.05

Especificidad

Sospechaclínica

EII-CH

Indices de validación para HLA-DR en EII

Sensibilidad

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global

Especificidad

Sospechaclínica

EII-CH

Indices de validación para CD16 en EII

Sensibilidad

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global

CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer

• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:

• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes

• Cáncer de Esófago• Linfoma

ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

•Tejido fresco o congelado.

•Tejido fijado en formalina -desparafinado.

Concordancia : 90 %.

TEJIDO FRESCO

Ventajas :

- Células enteras ( ADN, Ags. de membrana y citoplasma ).- Menor debris ( mejor resolución del histograma ).

Desventajas :

- No es posible la localización histológica de áreasde interés.

- Proceso inmediato o congelación.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

TEJIDO FIJADO EN FORMALINA Y DESPARAFINADO

Ventajas :

- Selección histológica de áreas de interés.- Permite estudio retrospectivo en individuos de curso clínico conocido.

Desventajas :

- Núcleos “desnudos”.- Fijación en formalina o microondas.- Mayor debris.

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica.

• Se obtiene una estimación de las fases delciclo celular.

• Se utilizan sustancias fluorescentes que tiene afinidad con el ADN (PI, DAPI, BrEt).

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999 J.L.C.N.

CICLO CELULARCICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS)

MITOSISM

1 hrG2(4n) G0 (2n)

4 hrPost Síntesis DNA

10 hrs

Síntesis ADN S G1 (2n) Pre-síntesis ADN

HISTOGRAMA DE ADN OBSERVADO

FASES G0G1

FASE S FASES G2+M

CONTENIDO DE ADN

Histograma Diploide o “Normal”

Histograma Aneuploide

Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

La ploidía del ADN se expresa como Indice de ADN ( IA ):

IA = G0G1 población en estudioG0G1 población de referencia

Población de referencia : tejido normal del cual se origina el tumor en estudio.

IA = 1 ADN diploide.IA > 1 ADN aneuploide.

ANEUPLOIDIA

•Grado de malignidad

•Pronóstico

Invasión

Metástasis

Evolución natural

Respuesta a tratamiento

PROLIFERACION CELULAR

•Tiempo libre de enfermedad.

•Sobrevida.

Proliferación Celular :

Fracción Fase S tiene valor predictivo positivo

S+G2M no debería usarse.

Fracción Fase S específica de células tumoraleses el parámetro citométrico más relevante como

factor pronóstico independiente.

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

• Estudio del comportamiento biológico de poblaciones celulares dentro de un tumor.

• Determinación de Fracción proliferativa (Fases S + G2M) de una población celular.

• Pronóstico y sobrevida de pacientes afectados de cáncer.

• Estudios de viabilidad.• Apoptosis.

Aplicaciones:

MUESTRAS USADAS PARA ANALISIS DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR POR

CITOMETRIA DE FLUJO

I Suspensiones Celulares:• Líneas Celulares.• Sangre Periférica• Médula Osea• Fluídos con alta celularidad (Liq. ascítico,

peritoneal, etc.)II Tumores Sólidos:

• Tejido sólido• Aspirado Celular

III Tejidos Embebidos en Parafina

Resultados en Cáncer Gástrico Avanzado :

PLOIDIA

FASE S

Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174

Fase Ses un factor pronóstico independiente

en Cáncer gástrico Avanzado

Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174

ESOFAGO

• Mucina 1• Ciclo celular• Ploidía de ADN• p53

Carcinoma superficial de

células escamosas

Marcadores pronósticos

• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Int J Cancer 1999;84(3):251-7• Cancer 1999:85(11):2322-8

LINFOMA

• Poblaciones Linfoides T• Poblaciones Linfoides B:

• Expresión de cadenas livianas tipo kappa• Expresión de cadenas livianas tipo lambda

• Ausencia de otros marcadores (CD5, CD10, CD34)

Helicobacter pyloriMALT

• Hematology 2001• BMC Gastroenterology 2 (WWW.biomedcentral.com/1471-230x/2/6)

Disponible en:

www.oncoinmun.co.cl

Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica,

Investigación y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.

Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Concepción, 16 de Agosto de 2004

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