Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica, Investigación y Cáncer T.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. Concepción, 16 de Agosto de 2004
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Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones ... · -IIV-Madura: CD1a y CD3mb ... CH3-C-O Cl O COOH H Cl HO OH Cl O COOH H Cl HO O Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation...
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Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica,
Investigación y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.
Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
• Linfocitos T totales :CD3(+)• Linfocitos T Helper :CD3(+)CD4(+)• Linfocitos T Sup/Citot :CD3(+)CD8(+)• Linfocitos B :CD3(-)CD19(+)• Linfocitos Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS
“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos
celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”
HEMATOPOYESISSTEM CELL
CFU-MLCFU-GEMM
LINFOCITO B LINFOCITO TCFU
ERITROIDEMEGACARIOCITO
CFUBASOFILO
CFUEOSINOFILO
CFU-GM
ERITROCITO BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO
CFU-L
PLAQUETAS MONOCITO
RETENCION DE ANTIGENOS
• Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados
CD19 CD19
Transformación
MalignaCELULA
PRE-B NORMALCELULA
LEUCEMICA
CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)
•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg
• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda
Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II:Común)
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
Cellular Function
• Phagocytosis• Killing index of phagocytes• Intracellular cytokines• Calcium flux• Oxidative burst• Membrane potential
Phagosome
O2
O2-
H2O2
NADPH + H+
NADP+
HMP
NADPHOxidase
GSSG
GSHGR GP
H2O2SOD
O2-
H+
H2O
Catalase
H2O + O2
PCB
SOD
PCB(Reduced GSH level)
PKC(PMA)
?
?+
O2-
OH.
Lipid Peroxidation
Phospolipase A2 activityLeukotrienes
H2O2
Human Neutrophil
Stimulant
PCB
DCFH-DA DCFH DCFDCF
COOHH
Cl
O
O-C-CH3
OCH3-C-O
Cl
O
COOHH
Cl
OHHO
Cl
O
COOHH
Cl
OHO
Cl
O
Fluorescent
Hydrolysis
Oxidation
2’,7’-dichlorofluorescin
2’,7’-dichlorofluorescin diacetate
2’,7’-dichlorofluoresceinCellular Esterases
H2O2
DCFH-DA
DCFHDCFH--DADA
DCFHDCFH
DCF
H OH O2 22 2Lymphocytes
Monocytes
Neutrophils
log FITC Fluorescence.1
1000100101
0
20
40
60
coun
ts
PMA-stimulated PMNControl
80
• Adulto normal• No estimulado :• Estimulado con PMA :
25.86 %76.98 %
Estallido respiratorio en Granulocitos
No estimulado
Estimulado
Estallido respiratorioCaso clínico:
• Paciente de sexo femenino• 8 años• Infecciones dérmicas recurrentes por S.aureus.• Granulomas fríos en cara y piernas• Déficit parcial de IgA.
• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos.
• Inicio de terapia antibiótica con claritromicina 250 mg/12 hrs por 30 días.
• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos, post terapia.
DCFA DCFADespués de terapia antibiótica
Estallido respiratorio en Granulocitos
No estimulado: 33.35 %
Estimulado: 42.66 %
No estimulado: 68.97 %
Estimulado: 57.48 %
DCFA DCFA
DCFA DCFA
DCFA
Estallido respiratorio en Monocitos
No estimulado: 25.97 %
Estimulado: 57.06 %
No estimulado: 76.26 %
Estimulado: 76.81 %
Después de terapia antibiótica
DCFA
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores, live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores.
Microbial Identification Using Antibodies
Enumeration & identification of target organisms in mixed populations
Examples include:• Legionella spp. in water cooling towers• Cryptosporidium & Giardia in water reservoirs• Listeria monocytogenes in milk• E.coli O157:H7 in contaminated meat• Bacillus anthracis & Yersinia pestis biowarfare agents
Agentes antibacterianos:• Microbiología tadicional (18-24 horas)• Citometría de flujo (pocas horas)• Evaluación de parámetros metábolicos:
• Potencial de membrana• Tamaño celular• Cantidad de ADN• Pruebas de suceptibilidad:
• Efecto bacteriostático• Efecto bactericida
Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC
Universidad de Concepción, ChileHospital del Trabajador Concepción, Chile
In vitro STUDIES OF pH EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES.
pH 3
pH 7
pH 10
pH 3
pH 7
pH 10
Strain ATCC43504 Strain 747LO-Skolen, Helsingør, Denmark, July 4-7, 2002