UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA-AMILASE OLEH
EKSTRAK AIR DAUN SALAM (Syzygium polyanthum (Wight) Walp.)
SECARA IN VITRO
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh:
Ayu Priscilla Dewanti
NIM: 168114003
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA-AMILASE OLEH
EKSTRAK AIR DAUN SALAM (Syzygium polyanthum (Wight) Walp.)
SECARA IN VITRO
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh:
Ayu Priscilla Dewanti
NIM: 168114003
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Janganlah takut, sebab Aku menyertai engkau, janganlah bimbang, sebab Aku ini
Allahmu; Aku akan meneguhkan, bahkan menolong engkau; Aku akan memegang
engkau dengan tangan kanan-Ku yang membawa kemenangan.
(Yesaya 41:10)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat
dan kasih karuniaNya penulis memberikan kelancaran dari awal penyusunan hingga
akhir dari penelitian, sehingga dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji
Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase Ekstrak Air Daun Salam (Syzygium
polyanthum (Wight) Walp.) secara In Vitro dengan baik dan lancar. Skripsi ini
disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar sarjana
farmasi (S.Farm) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
Penyusunan naskah skripsi ini tidak akan berjalan dengan lancer tanpa
adanya dukungan baik itu berupa moril dan meteril dari berbagai pihak. Oleh karena
itu, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada:
1. Tuhan Yesus yang telah memberikan jalan terbaik dan kekuatan pada
saat masa-masa sulit dalam proses penyusunan skripsi.
2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing skripsi yang selalu
sabar dalam memberikan arahan serta nasihat dalam proses penelitian
hingga penyusunan naskah skripsi ini.
3. Ibu Christine Patramurti, Apt. selaku Kepala Program Studi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma.
4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S,Si., M.Sc. selaku Kepala
Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
5. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku dosen penguji skripsi yang telah
memberikan saran, bantuan, dan kritik membangun untuk
menyelesaikan skripsi ini.
6. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji skripsi yang
telah memberikan saran, bantuan, dan kritik membangun untuk
menyelesaikan skripsi ini.
7. Ibu Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
telah dengan sabar membimbing selama perkuliahan di Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma.
8. Pak Dwi Priyana dan Pak Sarwanto selaku secretariat S1 Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah sabar selalu membantu
dalam pemberian segala macam bentuk informasi dari awal perkuliahan
hingga akhir.
9. Pak Wagiran, Pak Bimo, dan Pak Beye selaku laboran dan karyawan
yang telah membantu selama proses penelitian skripsi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
10. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang telah membantu dan memberikan saran selama masa
perkuliaha di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
11. Keluarga tercinta, Ibu Sri Dewi dan adik terkasih Devieska Amiani yang
selalu memberikan doa dan dukungan moril maupun materil dalam
proses perjalanan hidup hingga saat ini.
12. Yohana Trisnawati Ardiyanti selaku rekan satu tim “daun salam” yang
telah dengan sabar memberikan dukungan, teman dalam bertukar
pikiran, dan selalu memberikan segala macam informasi.
13. Teman-teman seperjuangan skripsi lainnya yaitu Fetiana Chrismaurin,
Fila Delfia, Maria Carolina, Agustinus Nara, dan Oskar Samuel Howay
yang telah memberikan saran dan dukungan selama proses penelitian
hingga penyusunan naskah skripsi ini.
14. Sobat yang saya anggap seperti saudara yang telah menghabiskan waktu
bersama-sama, berbagi kisah suka dan duka, memberikan bantuan,
saran, dan “kritik” selama proses perkuliahan dari awal semester hingga
saat ini, Luciana Astelia Indah Puspa Gery, Wiwy, Katharina Agnes F.B
Langkeru, dan Agatha Ati Maia.
15. Sahabat sejak masa sekolah, Elismanore Ahini, Elisa Yusefheni, dan
Resha Handriani yang selalu mendengarkan keluh kesah, memberikan
dukungan dan doa selama proses pembuatan skripsi.
16. Teman-teman FSMA 2016 yang telah memberikan pengalaman yang
luar biasa selama masa perkuliahan.
Penuis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan
dan jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu, penulis meminta maaf sebesar-
besarnya apabila terdapat kesalahan dalam penulisan. Penulis mengharapkan
adanya kritik dan saran yang membangun dari seluruh pihak agar hasil karya
ini menjadi lebih baik dan bermanfaat dalam perkembangan ilmu pengetahuan
terutama di bidang kefarmasian. Akhir kata penulis mengucapkan terimakasih.
Yogyakarta, 10 Agustus 2020
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .............................................................. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................................... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................ vi
PRAKATA ........................................................................................................ vii
DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ............................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xii
ABSTRAK ....................................................................................................... xiii
ABSTRACT ....................................................................................................... xiv
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ..................................................................................... 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 8
KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 18
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 19
LAMPIRAN ...................................................................................................... 24
BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 38
x
DAFTAR TABEL
Tabel I. Perhitungan Nilai Rf ............................................................................. 11
Tabel II. Persen Penghambatan Enzim Alfa-amilase Oleh Acarbose .................. 13
Tabel III. Nilai IC50 Acarbose ............................................................................ 13
Tabel IV. Persen Penghambatan Enzim Alfa-amilase Oleh Ekstrak Air Daun
Salam ................................................................................................. 14
Tabel V. Nilai IC50 Ekstrak Air Daun Salam ...................................................... 14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Plat KLT serbuk simplisia daun salam dan ekstrak air daunsalam dengan
fase gerak n-butanol: air: asam asam asetat (4:5:1) dan fase diam silika
gel GF254, bercak (A) pada UV 254 nm dan bercak (B) pada UV 366
nm............................................................................... 10
Gambar 2. Struktur Kuersetin............................................................................ 18
Gambar 3. Serbuk Simplisia Daun Salam .......................................................... 25
Gambar 4. Ekstrak Air Daun Salam .................................................................. 25
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambar Serbuk Simplisia Daun Salam dan Ekstrak Air Daun
Salam................................................................................................. 25
Lampiran 2. Surat Keterangan Merapi Farma Herbal ......................................... 26
Lampiran 3. Surat Keterangan Hasil Identifikasi Serbuk .................................... 27
Lampiran 4. Data Penimbangan Serbuk Simplisia Daun Salam dan Perhitungan
Rendemen....................................................................................... 28
Lampiran 5. Hasil Uji Kadar Air Serbuk Simplisia Daun Salam ......................... 29
Lampiran 6. Data Penimbangan Serbuk Simplisia Daun Salam dan Ekstrak Air
Daun Salam untuk KLT .................................................................. 29
Lampiran 7. Data Perhitungan Persen Penghambatan dan Nilai IC50 Acarbose dan
Esktrak Air Daun Salam ................................................................. 30
Lampiran 8. Surat Keterangan Analisa Data Statistik ......................................... 32
Lampiran 9. Hasil Pengujian Statistik ................................................................ 33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
ABSTRAK
Diabetes melitus merupakan salah satu penyakit gangguan fungsi
metabolik, terjadi akibat pankreas tidak dapat memproduksi insulin yang cukup
untuk tubuh atau tubuh tidak dapat menggunakan insulin secara efektif. Indonesia
menempati posisi ke enam negara dengan penderita diabetes terbanyak, yaitu
sebesar 10,3 juta orang. Peningkatan kadar gula didalam darah salah satu
penyebabnya adalah aktivitas pemecahan pati dari enzim alfa-amilase yang
merupakan produk dari kelenjar pankreas dan saliva. Enzim ini dapat memecah
molekul besar polisakarida yang tidak terlarut menjadi molekul yang dapat diserap
tubuh seperti maltosa, dekstrin, dan glukosa. Tanaman herbal yang dilaporkan
memiliki khasiat sebagai antidiabetes adalah daun salam. Daun salam memiki
senyawa aktif yaitu kuersetin dipercaya dapat menghambat enzim alfa-amilse
dalam proses pemecahan karbohidrat. Metode ekstraksi yang digunakan adalah
metode infusa dengan menggunakan pelarut air. Metode spektrofotometri dipilih
untuk melakukan pengujian terhadap aktivitas enzim alfa-amilase dengan cara
mengukur absorbansi sisa substrat yang membentuk kompleks warna biru dengan
iodine-iodida. Hasil nilai rata-rata persen penghambatan ekstrak air daun salam
pada konsentrasi 5mg/mL (15,83%), konsentrasi 10mg/mL (30,21%), konsentrasi
15mg/mL (38,55%), konsentrasi 20mg/mL (40,10%), konsentrasi 25mg/mL
(46,88%). Nilai rata-rata IC50 kontrol positif acarbose sebesar 17,62 mg/mL,
sedangkan nilai rata-rata IC50 ekstrak air daun salam sebesar 26,206 mg/mL. Hasil
pengolahan data secara statistik didapatkan adanya perbedaan penghambatan yang
bermakna antar konsentrasi dengan nilai p-value <0,05. Melalui uji T ditemukan
hasil yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara IC50
acarbose dan IC50 ekstrak air daun salam dengan nilai p-value <0,05.
Kata kunci: ekstrak air daun salam, metode infusa, daun salam, enzim alfa-amilase,
spektrofotometer UV-VIS, in vitro
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
ABSTRACT
Diabetes mellitus is a metabolic disease that occurred when the pancreas
could not secrete sufficient insulin or when the human body unable to utilize insulin
effectively. Indonesia is in the 6th place being the country with the most diabetes
cases, which is about 10,3 million people. One of the causes of the rising of the
blood glucose is activity of enzyme alpha-amylase, an enzyme produced in the
pancreas and saliva glands. The enzyme break downs the undissolved
polysaccharide into smaller species such as maltose, dextrin, and glucose. A species
of herbal plants, bay leaf (Syzygium polyanthum (Wight) Walp.) had been reported
to have an anti-diabetic effect. Syzygium polyanthum (Wight) Walp.) contains
quercetin as the active compound which is responsible for the inhibitory effect of
alpha-amylase in the carbohydrate break down process. The extraction method
chosen was water extraction. The method to examine the activity of alpha-amylase
was spectrophotometry. This method measured the absorbance of the remained
substrate that formed the blue complex with the iodine-iodide. The result of the
inhibitory percent value for each concentration was 15,83% (5mg/mL), 30,21%
(10mg/mL), 38,55% (15 mg/mL), 40,10% (20mg/mL), and 46,88% (25mg/mL).
The IC50 value of the positive control (acarbose) was 17,62 mg/mL, while the value
of the extract was 26,206 mg/mL. The statistic result showed that there is a
significant difference between concentrations (p-value <0,05). The result of the T-
test showed the difference between the IC50 of the acarbose and the water extract
of Syzygium polyanthum (Wight) Walp.) (p-value <0,05).
Keywords: Syzygium polyanthum (Wight) Walp. water extract, infusion method,
bay leaf, alpha amylase, spectrophotometer UV-VIS, in vitro
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Diabetes melitus merupakan salah satu penyakit gangguan fungsi metabolik.
Gangguan ini terjadi akibat pankreas tidak dapat memproduksi insulin yang cukup
untuk tubuh atau tubuh tidak dapat menggunakan insulin secara efektif
(Perkumpulan Endokrinologi Indonesia, 2015). Hampir setengah juta orang hidup
dengan diabetes. Angka ini diperkirakan meningkat melebihi 592 juta dalam kurun
waktu kurang dari 25 tahun. Sekitar 80% penderita diabetes berasal dari negara-
negara berpendapatan rendah sampai menengah. Indonesia menempati posisi ke
enam negara dengan penderita diabetes terbanyak, yaitu sebesar 10,3 juta orang.
Jumlah ini diperkirakan akan meningkat 1,5 kali lipat dalam kurun waktu 28 tahun
yaitu mencapai 16,7 juta orang pada tahun 2045 (International Diabetes Federation,
2017).
Terapi yang diberikan pada penderita diabetes melitus salah satunya
menggunakan strategi menghambat penyerapan gula ke dalam tubuh dengan
melibatkan enzim pencernaan. Salah satu enzim yang berperan adalah enzim alfa
amilase. Enzim ini merupakan produk yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas dan
saliva, memecah molekul besar polisakarida yang tidak terlarut menjadi molekul
yang dapat diserap tubuh seperti maltosa, dekstrin, dan glukosa (Ariandi, 2016).
Pengobatan herbal merupakan salah satu alternatif yang diminati oleh
masyarakat Indonesia karena dianggap memiliki beberapa kelebihan, yaitu mudah
didapatkan, mudah diramu sendiri dan harganya yang terjangkau. Salah satu
tanaman herbal yang berkhasiat sebagai antidiabetes adalah daun salam. Penelitian
secara in vivo menggunakan ekstrak air daun salam diberikan pada tikus
menunjukkan efek yang tinggi dalam menurunkan kadar gula darah yaitu sebesar
53,45% pada hari ke 21 saat perlakuan, disusul pada dosis 300 mg/kgBB dengan
42,4% dan dosis 200 mg/kgBB sebesar 34,5% (Lelono dan Tachibana, 2013). Pada
penelitian lain secara in vivo menggunakan ekstrak air daun salam yang telah
melelui proes filtrasi dan penguapan pada vakum (50-60mmHg), kemudian
dikeringkan dengan teknologi spray drying. Rasio tanaman dan air yang digunakan
adalah 1:4, menunjukkan hasil bahwa ekstrak air daun salam memiliki aktivitas
sebagai antidiabetes dengan memberikan dosis ekstrak air daun salam sebanyak 200
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
mg/kgBB pada tikus jantan dengan berat badan antara 100-150 g (Widharna et al,
2015). Elya et al (2015) melakukan penelitian aktivitas antidiabetes ekstrak etanol
daun salam secara in vitro terhadap enzim alfa amilase. Didapatkan hasil bahwa
ekstrak etanol daun salam memiliki aktivitas penghambatan enzim alfa amilase.
Pada penelitian ini menggunakan daun salam sebagai bahan uji, daun ini
merupakan salah satu jenis tanaman yang mudah diperoleh sehingga sering
dimanfaatkan masyarakat untuk pengobatan alternatif. Salah satu senyawa yang
terdapat pada daun salam adalah flavonoid. Senyawa ini dilaporkan memiliki
aktivitas sebagai antidiabetes melalui penghambatan aktivitas enzim alfa amilase
melalui pembentukan ikatan hidrogen dengan gugus polar pada sisi alosterik enzim
yang berdekatan dengan sisi katalitik enzim. Hasil dari interaksi tersebut dapat
mengubah konfigurasi molekul enzim sehingga menyebabkan penurunan aktivitas
enzim, flavonoid yang terkandung dalam daun salam yaitu kuersetin (Prahastuti et
al, 2011; Rivai et al, 2019). Melalui sebuah penelitian yang dilakukan oleh Rivai et
al (2019) melaporkan bahwa ekstrak air daun salam dengan metode infusa memiliki
kadar flavonoid sebanyak 0.486%. Kemudian dari penelitian lain melakukan
pengujian terhadap aktivitas penghambatan enzim dengan menggunakan kuersetin
secara in vitro didapatkan hasil kuersetin memiliki aktivitas dalam menghambat
enzim alfa amilase dilihat dari nilai IC50 507.61 μg/L (Oboh et al, 2014).
Pengobatan tanaman herbal pada awalnya dikenal dengan istilah jamu
godog yaitu rebusan simplisia segar dan kering menggunakan pelarut air. Perebusan
ini berguna untuk memindahkan zat-zat berkhasiat ke dalam air. Jamu godog juga
dapat diseduh langsung dengan air panas tanpa proses perebusan, biasanya
menggunakan simplisia yang berasal dari bunga atau daun (Sudradjat, 2016). Pada
penelitian ini melakukan ekstraksi senyawa kuersetin dengan metode infusa,
dimana simplisia kering akan dilakukan perebusan menggunakan air. Metode ini
digunakan untuk bahan lunak seperti daun dan bunga (BPOM RI, 2012). Metode
ini dipilih karena memiliki cara kerja yang sama seperti yang dilakukan masyarakat
dalam pengolahan obat tradisional. Meskipun senyawa kuersetin memiliki
kelarutan dalam air panas rendah, menurut Owczarek et al (2016) apabila
melakukan ekstraksi menggunakan pelarut air komponen lain dari tanaman tersebut
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
akan membantu kelarutan dari kuersetin dalam air, disebut dengan natural deep
eutectic solvents (NADES).
Melihat dari semakin meningkatnya angka kejadian diabetes melitus di
Indonesia menjadi masalah serius dalam bidang kesehatan, pengobatan herbal yang
dipercayai masyarakat sebagai salah satu alternatif pengobatan, dan daun salam
berkhasiat dipercayai dapat berkhasiat sebagai pengobatan antidiabetes. Maka
penelitian ini perlu dilakukan untuk menambah informasi dalam pengembangan
ilmu kefarmasian mengenai pengobatan tradisional. Selain itu, penelitian ini juga
bertujuan untuk mengetahui seberapa besar persen penghambatan ekstrak air daun
salam dalam menghambat aktivitas enzim alfa-amilase seta nilai IC50 yang
dihasilkan.
METODE PENELITIAN
Alat
Gelas beaker, tabung reaksi, batang pengaduk, labu takar, gelas ukur, cawan
porselen, pipet ukur, pipet tetes, mikropipet, timbangan analitik, hot plate, panci
infusa, spektrofotometer UV-Vis Shimadzu, plat silika gel GF254, bejana
kromatografi, kertas saring.
Bahan
Serbuk daun salam, enzim alfa amilase Sigma-Aldrich, tablet acarbose 50
mg, pati kentang, larutan iodine-iodine Merck, DMSO (dimethyl sulfoxide), n-
butanol, asam asetat, aquadest, aquabidest.
Tata Cara Penelitian
Pengumpulan Bahan dan Identifikasi Serbuk Daun Salam
Serbuk daun salam diperoleh dari Merapi Farma Herbal, Yogyakarta. Daun
salam yang digunakan ditanam pada daerah Hargobinangun, Pakem, Sleman,
Yogyakarta. Identifikasi serbuk daun salam dilakukan secara mikroskopis pada
Laboratorium Departemen Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan menggunakan metode destilasi toluena
(Departemen Kesehatan RI, 2010). Pereaksi toluena jenuh air dibuat dengan
mencampur toluene P dengan sedikit air kemudian dipisah menggunakan corong
pisah. 10g serbuk simplisia daun salam dan 200ml toluene jenuh air dimasukkan ke
dalam labu. Toluene jenuh air dimasukkan ke dalam tabung penerima melalui
pendingin sampai batas alat penampung dipanaskan selama 15 menit. Setelah
toluena mendidih, penyuling diatur dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes per detik.
Kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik selama 5 menit. Setelah
itu, tabung penerima didinginkan hingga suhu ruang dan volume air dibaca setelah
air dan toluena terpisah. Kadar air dihitung dengan rumus:
% Kadar air : volume air (ml)
berat simplisia yang ditimbang (g)×100%
Pembuatan Ekstrak Air Daun Salam
Infusa dibuat dengan menimbang serbuk 10g dan ditambahkan 100 mL
aquadest. Kemudian dipanaskan diatas penangas air selama 15 menit terhitung
mulai suhu 90oC sambil sesekali diaduk. Kemudian disaring menggunakan kertas
saring dan ditambahkan air panas secukupnya hingga diperoleh volume 100mL.
Filtrat diuapkan diatas penangas air hingga diperoleh ekstrak kental dengan berat
yang konstan (BPOM RI, 2012). Kemudian menentukan rendemen dengen
menggunakan rumus:
Rendemen: bobot ekstrak
bobot serbuk simplisia daun salam ×100%
Uji Kualitatif Kuersetin
Uji kualitatif kuersetin dilakukan mengikuti metode uji yang tercantum pada
Farmakope Herbal Indonesia. Metode yang digunakan yaitu kromatografi lapis tipis
(KLT). Sebelum melakukan pengujian bejana kromatografi dijenuhkan terlebih
dahulu dengan menempatkan kertas saring ke dalam bejana yang telah berisi fase
gerak n-butanol; air; asam asetat (4:5:1) tinggi dan lebar kertas saring disesuaikan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
dengan ukuran bejana kromatografi. Kemudian ditutup dan kertas saring dibiarkan
basah seluruhnya.
Pembuatan larutan uji dilakukan dengan cara menimbang serbuk daun
salam sebanyak 1g, diaduk di atas penangas air dengan 10 mL etanol selama 10
menit dicampurkan ke dalam labu ukur 10 mL. Fase gerak n-butanol; air; asam
asetat dengan perbandingan 4:5:1. Fase diam yang digunakan adalah silica gel
GF254. Larutan pembanding yaitu kuersetin dibuat 0,1%. Larutan uji ekstrak dibuat
dengan konsentrasi 5 mg/mL dengan cara menimbang 50 mg ekstrak air daun salam
dilarutkan dalam 10 mL etanol.
Plat silika dipanaskan terlebih dahulu menggunakan oven pada suhu 120oC
selama 30 menit sebelum melakukan penotolan larutan uji dan larutan pembanding.
Masing-masing ditotolkan sebanyak 10µL pada lempeng dengan jarak 1,5-2 cm
dari tepi bawah plat yang berukuran panjang 15 cm dan lebar 5 cm biarkan hingga
mengering. Plat yang telah kering kemudian dimasukkan ke dalam bejana
kromatografi dan tunggu fase gerak merambat sampai batas jarak rambat. Plat
dikeluarkan dan dikeringkan, bercak diamati dengan sinar tampak ultraviolet
gelombang pendek 254 nm dan ultraviolet gelombang panjang 366 nm. Jarak tiap
bercak dari titik penotolan diukur serta catat panjang gelombang tiap bercak yang
diamati. Tentukan nilai Rf dari setiap totolan (Departemen Kesehatan RI, 2008).
Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase
Pada tahap awal pengujian aktivitas ekstrak perlu dilakukan optimasi
metode yaitu dengan melakukan penentuan operating time (OT) dan panjang
gelombang maksimum. Panjang gelombang maksimum dilakukan dengan
membuat campuran 1 mL pati, 1 mL ekstrak konsentrasi 5 mg/mL, 1 mL enzim alfa
amilase, 2 mL buffer fosfat ditunggu selama 30 menit, untuk menghentikan reaksi
ditambahkan 1 mL HCL 1M dan 0,5 mL larutan iodine-iodida sebagai reagen
pewarna, setelah itu serapan panjang gelombang dibaca dengan spektrofotometer
UV- VIS pada panjang gelombang 400-800 nm. Operating time (OT) dilakukan
dengan mencampurkan 1 mL pati, 1 mL ekstrak konsentrasi 5 mg/mL, 1 mL enzim
alfa amilase, 2 mL buffer fosfat. Hal ini dilakukan untuk 6 waktu pengukuran yaitu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
5 menit, 10 menit, 15 menit, 20 menit, 25 menit. Kemudian reaksi dihentikan
dengan menambahkan 1 mL HCL 1M dan 0,5 mL larutan iodine-iodida sebagai
reagen pewarna, serapan panjang gelombang maksimum dibaca pada
spektrofotometer UV- VIS.
Pengujian terhadap penghambatan enzim diadopsi dari penelitian Berawi et
al (2017) dan Kamtekar et al (2014) yang telah dimodifikasi. Larutan buffer fosfat
pH 6,9 dibuat dengan cara menimbang 240 mg Na Fosfat dan 39,15 mg NaCl
dilarutkan dengan aquabidest sampai 100 mL. Larutan pati kentang 1% dibuat
dengan melarutkan 250 mg ke dalam 25 mL aquabidest. Larutan enzim alfa amilase
dibuat dengan 1 mL enzim alfa amilase ditambahkan pelarut buffer fosfat pH 6,9
pada labu ukur 100 mL hingga batas tanda. Ekstrak air daun salam sebagai sampel
dibuat dalam lima konsentrasi yaitu 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL,
25 mg/mL dilarutkan menggunakan DMSO 1% dalam labu ukur 10 mL. Larutan
uji sampel dibuat dengan mencampurkan 1 mL larutan pati kentang, 1 mL larutan
sampel, 2 mL larutan buffer fosfat, 1 mL larutan enzim ke dalam tabung reaksi dan
waktu OT selama 10 menit segera dimulai. Setelah waktu OT berhenti untuk
menghentikan reaksi ditambahkan 1 mL HCL 1M, reagen pewarna yaitu iodine-
iodida sebanyak 0,5 mL ditambahkan dan absorbansi dibaca pada panjang
gelombang 662, 5 nm.
Larutan blanko dibuat dengan mencampurkan 1 mL pati kentang, 1 mL
DMSO, 1 mL larutan enzim, dan 2 mL buffer fosfat. Untuk kontrol blanko dibuat
dengan mencampurkan 1 mL pati kentang, 1 mL DMSO, dan 3 mL buffer fosfat.
Kedua larutan ini di tunggu 10 menit, kemudian ditambahkan 1 mL HCL 1M dan
iodine-iodida sebanyak 0,5 mL, absorbansi dibaca pada panjang gelombang 662, 5
nm. Larutan kontrol sampel dibuat dengan mencampurkan 1 mL pati kentang, 1 mL
dari masing-masing konsentrasi ekstrak, dan 3 mL larutan buffer fosfat. Seluruh
larutan di tunggu 10 menit, kemudian ditambahkan 1 mL HCL 1M dan iodine-
iodida sebanyak 0,5 mL, absorbansi dibaca pada panjang gelombang 662, 5 nm.
Kontrol positif pada penelitian ini menggunakan tablet acarbose 50 mg
dengan lima konsentrasi yaitu 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25
mg/mL dilarutkan menggunakan DMSO 1%. Larutan acarbose dibuat dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
mencampur 1 mL larutan pati kentang, 1 mL dari masing-masing konsentrasi
larutan acarbose, 1 mL larutan enzim, dan 2 mL larutan buffer fosfat. Larutan
kontrol acarbose dibuat dengan mencampur 1 mL larutan pati kentang, 1 mL dari
masing-masing konsentrasi larutan acarbose, dan 3 mL buffer fosfat. Larutan
acarbose dan kontrol acarbose ditunggu selama 10 menit. Kemudian ditambahkan
1 mL HCL 1M untuk menghentikan reaksi dan 0,5 mL iodeine-iodida, absorbansi
dibaca pada panjang gelombang 662, 5 nm.
Persen inhibitor di hitung menggunakan rumus:
% Inhibitor: (Ac'-Ac'')-(As-Ab)
(Ac'-Ac'') x 100
Dimana:
Ac’ : absorbansi blanko
Ac’’ : absorbansi kontrol blanko
As : absorbansi sampel
Ab : absorbansi kontrol sampel
Nilai IC50 merupakan nilai dari konsentrasi sampel yang dapat menghambat
aktivitas enzim sebesar 50%. Perhitungan nilai IC50 menggunakan regresi linear
yaitu y= bx+a dimana konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan persen
penghambatan sumbu y. Nilai IC50 dihitung dengan rumus (Elya et al, 2015):
IC50: 50-a
b
Analisis Data
Pengukuran aktivitas penghamatan enzim oleh ekstrak air daun salam
dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Data yang diperoleh berupa persen
penghambatan enzim oleh ekstrak air daun salam. Analisis data penghambatan
enzim oleh ekstrak air daun salam diukur secara statistik diawali dengan menguji
distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Apabila didapatkan data terdistribusi
normal (nilai P > 0,05) maka dilanjutkan dengan ANOVA satu arah dan jika
ditemuka perbedaan maka dilanjutkan dengan uji Post-Hoc dengan taraf
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
kepercayaan 95%. Jika ditemukan perbedaan data tidak terdistribusi normal (nilai
P <0,05), maka dilanjukan dengan uji Kruskal-Wallis. Apabila ditemukan
perbedaan maka dapat dilanjutkan menggunakan uji Mann-Whitney pada taraf
kepercayaan 95%. Pengukuran dua kelompok uji menggunakan uji-T tidak
berpasangan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak air daun
salam dalam menghambat enzim alfa amilase secara in vitro serta mengetahui
persen penghambatan enzim alfa amilase oleh ekstrak air daun salam. Serbuk
simplisia daun salam pada penelitian ini didapatkan dari Merapi Farma Herbal,
Yogyakarta (Lampiran 2). Identifikasi terhadap sebuk tersebut dilakukan pada
Laboratorium Departemen Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,
hasil dari identifikasi tersebut menunjukan bahwa serbuk yang digunakan berasal
dari daun salam dengan nama latin Syzygium polyanthum (Wight) Walp. suku
Myrtaceae (Lampiran 3).
Penetapan Kadar Air
Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar air dari serbuk simplisia daun
salam menggunakan metode destilasi toluen. Metode ini dipilih mengukuti panduan
Farmakope Herbal Indonesia. Volume air yang didapatkan dari penetapan kadar air
simplisia yang ditimbang sebanyak 10 g adalah 0,5 mL, setelah dihitung
menggunakan rumus persen kadar air diketahui bahwa kadar air simplisia yaitu 5%.
Hal ini menandakan bahwa kadar air telah memenuhi persyaratan Farmakope
Herbal Indonesia (2008) yaitu <10%. Penentuan kadar air berkaitan dengan
kemurnian ekstrak, apabila terlalu tinggi (>10%) akan menyebabkan timbulnya
cemaran mikroba yang menyebabkan kerusakan pada ekstrak (Saifudin et al, 2011).
Ekstraksi Daun Salam dengan Pelarut Air
Proses ekstraksi serbuk simplisia daun salam pada penelitian menggunakan
metode infusa yang bertujuan untuk mengekstraksi senyawa aktif dari daun salam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
yaitu kuersetin. Metode infusa merupakan teknik ekstraksi sederhana menggunakan
pelarut air pada suhu 90oC selama 15 menit, bahan yang digunakan dalam teknik
esktrasi infusa pada umumnya dari bahan lunak seperti daun dan bunga (BPOM RI,
2012). Waktu 15 menit terhitung ketika suhu mencapai 90oC, setelah 15 menit hasil
infusa disaring menggunakan kertas saring hingga diperoleh volume 100mL. Filtrat
yang dihasilkan kemudian diuapkan pada penangas air sampai terbentuk ekstrak
kental. Meskipun kuersetin akan mengalami degradasi pada suhu 100°C, namun
pada penelitian yang dilakukan oleh Loncaric et al (2017) mengatakan bahwa
dibawah 100°C degradasi yang dilami oleh kuersetin tidak signifikan sehingga
metode ini digunakan pada tahap ekstrasi.
Setelah itu ekstrak ditimbang dan ditentukan rendemen ekstrak tersebut.
Rendemen merupakan rasio jumlah ekstrak yang didapatkan dari berat simplisia
yang digunakan dalam proses ekstraksi dengan menggunakan satuan persen (%),
semakin tinggi nilai rendemen yang dihasilkan menandakan jumlah ekstrak yang
dihasilkan semakin banyak. Hasil rendemen yang didapatkan dari tiga replikasi
ekstrak replikasi 1 adalah 16,24%, replikasi 2 adalah 41,01%, dan replikasi 3 adalah
14,81%. Pada Famakope Herbal Indonesia (2010) tertulis bahwa nilai rendemen
ekstrak kental daun salam tidak kurang dari 12,2%, dilihat dari hasil rendemen yang
didapatkan ekstrak daun salam pada penelitian ini sudah memenuhi persyaratan
yang ditetapkan pada Farmakope Herbal Indonesia.
Uji Kualitatif Kuersetin
Pada penelitian ini melakukan uji kualitatif terhadap senyawa aktif
kuersetin menggunakan teknik analisis kromatografi lapis tipis (KLT). Secara
umum KLT didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses
migrasi dalam sistem yang terdiri dari dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam berfungsi sebagai zat penyerap atau bertindak dalam melarutkan zat terlarut
sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Sedangkan fase gerak
berfungsi sebagai pembawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat
terlarut lainnya. Pada KLT hasil dari pengujian diidentifikasi dari pengamatan
bercak dengan nilai Retardation factor (Rf) yang merupakan perbandingan antara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
jarak senyawa dari titik awal dan jarak palarut dari titik awal. Nilai Rf memiliki
kemiripan dan ukuran yang hampir sama antara larutan uji dan pembanding pada
lempeng yang sama (Depkes RI, 2010). Nilai Rf yang menunjukan keterpisahan
yang baik berkisar 0,2-0,8 (Srivastava., 2011).
(A) (B)
Gambar 1. Plat KLT serbuk simplisia daun salam dan ekstrak air
daunsalam dengan fase gerak n-butanol: air: asam asam
asetat (4:5:1) dan fase diam silika gel GF254, bercak (A)
pada UV 254 nm dan bercak (B) pada UV 366 nm
Keterangan gambar: A. Pembanding Kuersetin, B. Serbuk Simplisia Daun
Salam, C. Ekstrak Air Daun Salam
Tabel I. Perhitungan Nilai Rf
Titik Jarak Bercak
(cm)
Jarak
Elusi
Nilai Rf Warna bercak
254 nm 366 nm
A 7,2 10 0,72 Kuning
kecoklatan Kebiruan
B
7 10 0,7 Kuning
kecoklatan Kebiruan
8,9 10 0,89 - Merah muda
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
C 7 10 0,7 Kuning
kecoklatan Kebiruan
Berdasarkan hasil KLT yang disajika pada Gambar 1 nilai Rf yang
didapatkan dari pembanding adalah 0,72, serbuk simplisia daun salam 0,7, dan
ekstrak air daun salam adalah 0,7. Nilai Rf yang didapatkan mendekati nilai Rf
pembanding. Hal ini menandakan bahwa pada serbuk simplisia daun salam dan
ekstrak air daun salam ditemukan adanya kuersetin. Temuan ini diperkuat dengan
penelitian yang dilakukan oleh Loncaric et al (2017) mengatakan bahwa kelarutan
kuersetin didalam air dapat ditingkatkan dengan meningkatkan suhu pemanasan
dan waktu proses pembuatan, berkaitan dengan proses ekstraksi infusa dimana
suhu yang digunakan adalah 90°C selama 15 menit. Hal ini juga didukung oleh teori
Natural Deep Eutectic Solvents (NADES). NADES merupakan campuran dari dua
atau lebih komponen yang terdapat dalam tumbuhan (misalnya amina, glukosa,
alkohol, dan asam karboksilat) yang dapat membantu kelarutan senyawa didalam
pelarut polar (air) (Owczarek et al., 2016). Pada ekstrak air daun salam ditemukan
beberapa senyawa yaitu glikosida, terpenoid, alkaloid, flavonoid, dan tanin
(Widjajakusuma et al., 2019). Umumnya flavonoid yang ditemukan pada tanaman
aglikonnya berikatan dengan glukosa yang disebut dengan flavonoid glikosida,
senyawa ini mudah larut dalam air. Turunan dari flavonol yaitu kuersetin
merupakan salah satu golongan dari flavonoid glikosida, dimana glukosa berikatan
pada 3,7-OH dalam kuersetin. Glikosida yang ditemukan pada ekstrak air dapat
berperan sebagai NADES dengan berikatan pada kuersetin, sehingga membantu
kelarutan kuersetin dalam air.
Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase
Pengujian aktivitas enzim dilakukan secara in vitro. Pengujian ini didasari
oleh pemecahan substrat untuk menghasilkan produk berwarna yang diukur
absorbansinya pada panjang gelombang yang telah ditentukan (Pujiyanto et al,
2019). Sebelum melakukan pengujian optimasi metode dilakukan terlebih dahulu
dengan menentukan panjang gelombang maksimum yang bertujuan untuk melihat
serapan maksimum dari hasil reaksi larutan uji. Pengukuran panjang gelombag
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
maksimum perlu dilakukan karena pada tahap ini memiliki kepekaan yang tinggi,
sehingga perubahan absorbansi untuk setiap konsentrasi adalah paling besar,
absorbansi dibaca pada panjang gelombang 400-800 nm. Kemudian dilanjutkan
dengan penentuan operating time (OT) bertujuan untuk mengetahui waktu
pengukuran yang stabil (Gandjar dan Rohman, 2007). Didapatkan hasil panjang
gelombang maksimum 662,5 nm dengan nilai absorbansi 0,660 dan OT 10 menit
dengan nilai absorbansi 0,601.
Pati kentang pada penelitian ini berfungsi sebagai substrat dari enzim.
Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah DMSO 1%. Pelarut ini dipilih
karena memiliki kemampuan melarutkan senyawa polar maupun non polar
(Andayani et al, 2016). Pemilihan HCL asam kuat untuk menghentikan reaksi
enzimatis didasarkan oleh perubahan pH yang ekstrim akan menyebabkan enzim
mengalami denaturasi sehingga aktivitas enzim akan mengalami penurunan hingga
tidak ada lagi aktivitas (Hames et al, 2000). Enzim memiliki stabilitas yang baik
berada pada pH 4-8 (Kishore et al, 2012). Oleh karena itu, pada penelitian ini
menggunakan buffer fosfat dengan pH 6,9 untuk menjaga kestabilan enzim selama
proses pengujian agar enzim tetap bekerja secara optimal. Reagen pewarna pada
penelitian ini menggunakan iodine-iodida, dimana reagen ini akan berikatan ikatan
dengan substrat membentuk warna biru, sehingga absorbansinya dapat dibaca pada
spektrofotometer UV- Vis dengan panjang gelombang yang telah ditentukan.
Pada pengujian aktivitas penghambatan enzim terdapat beberapa kelompok
uji yang akan diberikan perlakukan. Kelompok tersebut adalah kelompok blanko,
kontrol blanko, sampel, dan kontrol sampel. Kelompok ini memiliki tujuannya
masing-maisng yaitu kelompok blanko bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim
dalam memecah substrat yaitu pati kentang tanpa dihambat oleh ekstrak, kelompok
kontrol blanko untuk mengetahui apakah pelarut memiliki aktivitas tanpa
menambahkan ekstrak dan enzim, kelompok sampel bertujuan untuk mengetahaui
aktivitas penghambatan oleh sampel salam terhadap enzim alfa amilase, dan
kelompok kontrol sampel bertujuan untuk mengetahaui aktivitas sampel tanpa
ditambahkan enzim.
Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa-Amilase oleh Acarbose
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Pada penelitian ini menggunakan acarbose sebagai kontrol positif dalam
pengujian aktivitas penghambatan enzim. Larutan acarbose dibuat dengan berbagai
variasi konsentrasi yaitu 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL.
Selain larutan uji acarbose dilakukan juga pengujian pada kelompok lain yaitu
kelompok blanko, kontrol blanko, dan kontrol acarbose.
Tabel II. Persen penghambatan alfa-amilse oleh acarbose
Konsentrasi
(mg/mL)
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata
5 24,87 % 30,57% 26,42% 27,28%
10 33,68% 39,90% 38,34% 37,30%
15 46,11% 47,15% 49,74% 47,66%
20 51,30% 52,33% 55,44% 53,02%
25 62,18% 60,10% 64,77% 62,35%
Tabel III. Nilai IC50 acarbose
Replikasi IC50 (mg/mL) Rata-rata
1 18,45
17,62 mg/mL 2 17,79
3 16,63
Pada Tabel II menunjukkan nilai persen penghambatan acarbose terhadap
enzim alfa-amilase. Persamaan regresi linear yang didapatkan tabel penghambatan
oleh acarbose replikasi 1 adalah y = 1,8448x + 15, 956 dengan nilai r = 0,995 dan
nilai IC50 sebesar 18,45 mg/mL. Pada replikasi 2 adalah y = 1,4298x + 24,563
dengan nilai r = 0,996 dan nilai IC50 sebesar 17,79 mg/mL. Pada replikasi 3 adalah
y = 1,876x + 18,802 dengan nilai r = 0,993 dan nilai IC50 sebesar 16,63 mg/mL.
Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase oleh Ekstrak Air Daun
Salam
Ekstrak daun salam yang telah didapatkan dari proses ekstraksi dengan
menggunakan pelarut air dimanfaatkan sebagai larutan uji yang bertujuan untuk
mengetahaui aktivitas penghambatan oleh ekstrak air daun salam terhadap enzim
alfa-amilase dengan variasi konsentrasi 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20
mg/mL, 25 mg/mL. Pada pengujian aktivitas penghamabatan enzim oleh ekstrak
tidak hanya melakukan pengujian terhadap larutan uji tetapi kelompok lain juga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
mendapat perlakukan. Kelompok tersebut adalah kelompok blanko, kontrol blanko,
dan kontrol sampel.
Tabel IV. Persen penghambatan enzim alfa-amilase oleh ekstrak air
daun salam
Konsentrasi
(mg/mL)
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata
5 13,18% 17,03% 17,30% 15,83%
10 27,88% 32,82% 29,94% 30,21%
15 41,75% 37,5% 36,40% 38,55%
20 42,17% 40,38% 37,77% 40,10%
25 48,62% 43,13% 48,90% 46,88%
Tabel V. Nilai IC50 Ekstrak Air Daun Salam
Replikasi IC50 (mg/mL) Rata-rata
1 24,34
26,206 mg/mL 2 28,24
3 26,04
Pada Tabel IV menunjukkan nilai persen penghamabatan ekstrak air daun
salam terhadap enzim alfa-amilase. Persamaan regresi linear yang didapatkan tabel
penghambatan oleh ekstrak air replikasi 1 adalah y = 1,905x + 3,615 dengan nilai r
= 0,960 dan nilai IC50 sebesar 24,34 mg/mL. Pada replikasi 2 adalah y = 1,195x +
16,244 dengan nilai r = 0,916 dan nilai IC50 sebesar 28,24 mg/mL. Pada replikasi 3
adalah y = 1,43x + 12,753 dengan nilai r = 0,993 dan nilai IC50 sebesar 26,04
mg/mL.
Perbedaan nilai persen penghambatan antar replikasi pada konsentrasi
5mg/mL acarbose dan antar replikasi pada konsentrasi 5, 10, 15, 20mg/mL ekstrak
air daun salam disebabkan karena adanya endapan pada larutan setelah penambahan
HCL pada saat melakukan proses penghentian reaksi enzimatik. Hal ini
menyebabkan hasil pembacaan yang bias pada instrumen spektrofotometer UV-
Vis. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis yaitu cahaya monokromatik akan
melalui suatu larutan, sebagian cahaya tersebut akan diserap, sebagian lagi
dipantulkan, dan sebagiannya lagi dihamburkan. Apabila suatu larutan masih
terdapat partikel-partikel akan terjadi hambatan cahaya, sehingga menyebabkan
absorbansi yang dibaca oleh instrumen menjadi bias. Oleh karena itu, larutan yang
digunakan dalam analisis harus dipastikan benar-benar jernih (USP., 2011).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Selanjutnya melakukan pengujian statistik (Lampiran 9) untuk memastikan
nilai yang telah didapatkan memiliki kebermaknaan antara persen penghambatan
dengan masing-masing konsentrasi. Tahapan pertama yaitu melakukan uji
distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk, apabila didapatkan nilai p-value
>0,05 maka nilai tersebut terdistribusi normal. Hasil yang didapatkan untuk persen
penghambatan ekstrak air daun salam dan acarbose menunjukkan nilai p-value
>0,05. Hal ini dapat dikatakan bahwa nilai dari kedua sampel tersebut terdistribusi
normal. Tahapan selanjutnya yaitu uji ANOVA satu arah untuk mengetahui
perbedaan antar kelompok. Secara deskriptif rata-rata aktivitas tertinggi dari
ekstrak air daun salam dan acarbose terdapat pada konsentrasi 25 mg/mL. Pada uji
homogenitas terhadap ekstrak air daun salam didapatkan nilai signifikansi sebesar
0,828 dan acarbose sebesar 0,758 menunjukkan bahwa kedua kelompok tersebut
memiliki nilai yang homogen ditandai dengan nilai siginifikansi >0,05. Untuk uji
ANOVA satu arah apabila nilai signifikansi <0,05 menunjukkan nilai rata-rata antar
kelompok memiliki perbedaan yang bermakna. Hasil yang didapatkan dari ekstrak
air daun salam adalah 0,00 dan acarbose adalah 0,00, sehingga disimpulkan bahwa
kedua kelompok tersebut memiliki perbedaan yang bermakna. Pengujian
selanjutnya yang dilakukan yaitu uji lanjutan Post Hoc dan dianalisis menggunakan
uji Sheffe taraf kepercayaan 95% untuk melihat apakah terdapat perbedaan yang
bermakna pada setiap kelompok konsentrasi. Nilai persen penghambatan antar
konsentrasi dibandingkan satu dengan yang lain. Setelah dibandingkan didapatkan
hasil p-value <0,05. Namun pada konsentrasi 15 mg/mL vs 20 mg/mL dari ekstrak
air daun salam memiliki p-value >0,05, serta konsentrasi 15 mg/mL vs 20 mg/mL
acarbose memiliki p-value >0,05. Secara statistik perbandingan konsentrasi yang
telah disebutkan tidak memiliki perbedaan yang bermakna antar konsentrasi.
Nilai IC50 merupakan nilai dari konsentrasi sampel yang dapat menghambat
aktivitas enzim sebesar 50%. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang
menyatakan hubungan antara konsentrasi ekstrak sebagai variable x dengan persen
penghambatan sebagai variabel y. Hasil yang didapatkan dari pengujian
menunjukkan bahwa ekstrak air daun salam memiliki aktivitas penghambatan
enzim alfa-amilase dengan rata-rata nilai IC50 sebesar 26,206 mg/mL dan acarbose
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
dengan rata-rata sebesar 17,62 mg/mL. Semakin kecil nilai IC50 menandakan bahwa
semakin besar aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa-amilase. Berdasarkan
nilai IC50 yang didapatkan dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 ekstrak air daun
salam lebih besar dibandingkan dengan nilai IC50 acarbose. Hal ini menandakan
bahwa aktivitas pengambatan dari ekstrak air daun salam lebih rendah
dibandingkan dengan acarbose. Untuk memastikan IC50 esktrak air daun salam dan
acarbose memiliki perbedaan, maka dilakukan analisis statistik dengan uji T tidak
berpasangan. Hasil pengujian normalitas didapatkan bahwa kelompok IC50 ekstrak
air daun salam dan IC50 acarbose terdistribusi normal dengan nilai p-value >0,05.
Hasil uji T tidak berpasangan didapatkan hasil p-value <0,05 yang menandakan
bahwa kedua kelompok uji memiliki perbedaan yang bermakna secara statistik.
Penelitian yang dilakukan oleh Laoufi et al (2017) nilai IC50 acarbose yang
didapatkan yaitu 0,044±0,01 mg/mL menggunakan buffer sodium fosfat pH 6,9
sebagai pelarut enzim, DNSA sebagai pelarut larutan sampel, dan dipanaskan pada
water bath selama 7 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Penelitian lain
yang dilakukan oleh Riaz et al (2020) mendapatkan hasil nilai IC50 acarbose sebesar
0,83mg/mL menggunakan HCL 1M untuk menghentikan reaksi enzimatik dan
iodine sebagai reagen pewarna, absorbansi diukur menggunakan microplate reader.
Mumtaz et al (2018) juga melakukan penelitian uji aktivitas penghambatan enzim
alfa-amilase menggunakan acarbose sebagai kontrol positif dan mendapatkan nilai
IC50 sebesar 152,66±7,32 µg/mL dengan buffer fosfat pH 6,9 sebagai pelarut enzim,
diinkubasi pada suhu 25°C selama 10 menit dan diberikan DNS sebagai reagen
pewarna, absorbansi diukur menggunakan Elisa 96-ell micro-plate. Sedangkan
pada penelitian ini didapatkan nilai IC50 sebesar 17,62 mg/mL. Perbedaan yang
cukup jauh dengan penelitian sebelumnya disebabkan karena penggunaan bahan
yang berbeda yaitu pada penelitian ini menggunakan reagen pewarna iodine dan
untuk menghentikan reaksi enzimatis menggunakan HCL 1 M serta pada penelitian
ini menggunakan instrumen yang berbeda yaitu menggunakan spektrofotometer
UV-Vis.
Berawi et al (2017) melekukan penelitian secara in vitro menggunakan dua
metode ekstraksi yaitu menggunakan air dengan suhu lebih dari 90°C dan metode
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
maserasi terhadap daun salam, didapatkan hasil nilai rata-rata IC50 sebesar 0,431
mg/mL. Buffer fosfat pH 6,9 sebagai pelarut, pati sebagai substrat, iodine sebagai
reagen pewarna, dan HCL 1M sebagai katalis dalam menghentikan reaksi
enzimatik, absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer. Elya et al (2015)
juga melakukan penelitian secara in vitro menggunakan ekstrak etanol daun salam
dan didapatkan hasil nilai IC50 sebesar 90,34±1,43 µg/mL menggunakan pati
sebagai substrat dan DNS sebagai reagen pewarna serta untuk menghentikan reaksi
enzimatik, kemudian dilakukan pemanasan selama 15 menit. Sedangkan pada
penelitian ini didapatkan nilai IC50 sebesar26,206 mg/mL. Perbedaan nilai IC50 yang
cukup jauh disebabkan karena bahan yang digunakan berbeda terutama pada pelarut
yang digunakan yaitu menggunakan pelarut DMSO 1%, metode ektsraksi terhadap
daun salam yaitu metode infusa, dan pada saat proses pengukuran menggunakan
spektrofotometer UV-Vis ditemukan adanya partikel-partikel yang membuat nilai
absorbansi menjadi bias.
Enzim pencernaan (alfa-amilase) bertanggung jawab dalam memecah
molekul besar pati dari makanan yang dikonsumsi menjadi molekul kecil yang
dapat diserap ke dalam tubuh. Pengujian aktivitas enzim dapat dilakukan secara in
vitro dengan mengukur hasil pemecahan substrat oleh enzim yang telah diberikan
reagen pewarna biru yaitu iodin. Intensitas warna biru pada sampel uji berbanding
lurus dengan aktivitas penghambatan enzim, dengan kata lain penurunan intensitas
warna biru yang didapatkan menunjukkan terjadinya penghambatan terhadap
aktivias enzim dalam memecah substrat (Thangaraj., 2016).
Gambar 2. Struktur Kuersetin (Megar et al., 2020)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Temuan aktivitas penghambatan enzim pada ekstrak air daun salam diduga
karena adanya kandungan flavonoid. Flavonoid berperan sebagai inhibitor non
kompetitif pada enzim sehingga menurunkan efektivitas enzim pada proses
enzimatik. Kuersetin sebagai senyawa yang dipercayai memiliki aktivitas
penghambatan enzim merupakan salah satu jenis flavonol turunan dari grup
flavonoid. Interaksi yang terjadi pada penghambatan enzim berkaitan dengan gugus
hidroksil yang dimiliki oleh kuersetin. Melalui proses tersebut menyebabkan
penyerapan glukosa ke dalam darah dapat dikontrol, sehingga peningkatan kadar
gula darah pada penderita diabetes melitus dapat dicegah (Yuan et al., 2014).
Menurut Martinez-Gonzalesz et al (2019) kuersetin menunjukkan ikatan hidrogen
dengan residu asam amino Glutamin63, Arginin195, Aspartat197 serta ikatan Van der
Waals dengan residu asam amino Leusin165 dan Triptofan59 pada sisi aktif enzim
sehingga enzim mengalami penurunan aktivitas.
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
Ekstrak air daun salam memiliki aktivitas dalam menghambat enzim alfa-
amilase secara in vitro dengan nilai rata-rata persen penghambatan pada konsentrasi
5mg/mL yaitu 15,83%, konsentrasi 10mg/mL yaitu 30,21%, konsentrasi 15mg/mL
yaitu 38,55%, konsentrasi 20mg/mL yaitu 40,10%, konsentrasi 25mg/mL 46,88%.
Serta nilai rata-rata IC50 kontrol positif acarbose sebesar 17,62 mg/mL, sedangkan
nilai rata-rata IC50 ekstrak air daun salam sebesar 26,206 mg/mL. Hasil analisa
statistik yang dilakukan pada nilai IC50 ditemukan bahwa ekstrak air daun salam
dan acarbose memiliki perbedaan yang bermakna secara statistik dengan p-value
<0,05.
SARAN
Untuk penelitian selanjutnya dapat melakukan isolasi senyawa aktif daun
salam yang selektif dalam menghambat enzim alfa-amilase. Pengujian secara in
vitro juga dapat dilakukan untuk melihat efek ekstrak air daun salam dalam
menurunkan kadar gula darah dengan menghambat pemecahan molekul besar pati
menjadi molekul yang dapat diserap oleh tubuh. Untuk metode lain yang memiliki
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
sensitivitas lebih tinggi dapat digunakan dalam melakukan pengukuran persen
penghambatan ekstrak air daun salam terhadap enzim alfa-amilase. Perhitungan
IC50 dapat menggunakan persamaan polinomial terutama untuk penelitian yang
melibatkan enzim secara in vitro.
DAFTAR PUSTAKA
Andayani, R., Mubarak, Z., Rinanda, D.R., 2016. Aktivitas Antibakteri Tepung
Cacing Tanah (Lumbricus rubellus) Terhadap Enterococus faecalis Secara
In Vitro. Journal of Syiah Kuala Dentistry Society. 1 (2), 201-210.
Ariandi, 2016. Pengenalan Enzim Amilase (Alpha-Amylase) dan Reaksi
Enzimatisnya Menghidrolisis Amilosa Pati Menjadi Glukosa. 7 (1),
74–82.
Badan Pengawas Obat dan Makanan., 2012. Acuan Sediaan Herbal. Volume 7.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Edisi 1. Jakarta: Direktorat Obat Asli Indonesia Badan Pengawas Obat dan
Makanan RI.
Berawi, K.N., Shidarti, L., Nurdin, S.U., Lipoeto, N.I., Wahid, I., Jamsari.,
Nurcahyani, E., 2017. Comparison Effectiviness od Antidiabetic Activity
Extract Herbal Mixture of Soursop Leaves (Annona muricata), Bay Leave
(Syzygium polyanthum) and Peganggang Leaves (Centella asiatica).
Biomedical and Pharmacology Journal, 10 (3), 1481-1488.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia., 2008. Farmakope Herbal Indonesia
Edisi I. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Depaetemen Kesehatan Republik Indonesia., 2010. Suplemen I Farmakope
Herbal Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Elya, B., Handayani, R., Sauriasari, R., Azizahwati, Hasyyati, U.S., Permana, I.T.,
and Permatasari, Y.I., 2015. Antidiabetic Activity and Phytochemical
Screening of Extracts from Indonesian Plants by Inhibition of Alpha
Amylase, Alpha Glucosidase and Dipeptidyl Peptidase IV. Pakistan
Journal of Biological Sciences, 18 (6), 279–284.
Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi AnalisisI, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Hames, B.D., Hooper, N.M., 2000. Biochemistry: The Instant Notes. 2nd edition,
Hongkong: Spinger-verlag.
International Diabetes Federation, 2017. IDF Diabetes Atlas. 8th ed. Intternational
Diabetes Federation.
Kamtekal, S., Keer, V., Patil, V., 2014. Estimation of Phenolic Content, Flavonoid
Content, Antioxidant and Alpha Amylase Inhibitory Activity of Marketed
Polyherbal Formulation. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(9),
61-65.
Kishore. D., Kundu, S., Kayastha, A.M., 2012. Thermal, Chemical and pH
Induced Denaturation of a Multimeric β-Galactosidase Reveals Multiple
Unfolding Pathways. Plos One, 7 (11), 1-9.
Laoufi, H., Benariba, N., Adjdir, A., Djaziri, R., 2017. In Vitro α-amylase and α-
glucodidase Inhibitory Activity of Ononis angustissima Extracts. Journal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
of Applied Pharmaceutical Science, 7(2), 191-198.
Lelono, R.A.A. and Tachibana, S., 2013. Preliminary Studies of Indonesian
Eugenia polyantha Leaf Extracts as Inhibitors of Key Enzymes for Type 2
Diabetes. Journal of Medical Sciences, 13 (2), 103–110.
Loncaric, A., Pablo. L. J., Maria. G.E., Marta. L., 2017. Increasing water solubility
of Quercetin by increasing the temperature, Juan Pablo Lamas Castro, 89-
89.
Magar, T.R., Sohng, J.K., 2020. A Review on Structure, Modification and
Structure-Activity Relation of Quercetin and Its Derivatives, J. Microbiol.
Biotechnol, 30(1), 11-20.
Martinez-Gonzalesz, A.I., Diaz-Sanchez, A.G., de la Rosa, L.A., Bustos-Jaimes, I.,
Alvarez-Parrilla, E., 2019. Inhibition of α-amylase by Flavonoids: Structure
Activity Relationship (SAR), Spectrochimica Acta Part A: Molecular and
Biomolecular Spectroscopy, 206, 437-447.
Mumtaz, M.W, Al-Zuaidy, Hamid, A.A., Danish, M., Akhtar, M.T. Mukhtar, H.,
2018. Metabolite Profiling and Inhibitory Properties of Leaf Extracts of
Ficus benjamina Towards α-glucosidase and α-amylase. International
Journal of Food Properties, 21(1), 1560-1574.
Oboh, G., Ademosun, A.O., Ayeni, P.O., Omojokun, O.S., Bello, F., 2014.
Comparative Effect of Quercetin and Rutin on α-amylase, α-glucosidase,
and Some Pro-oxidant-induce Lipid Peroxidation in Rat Pancreas.
Comparative Clinical Pathology, 24 (5).
Owczarek, K. et al., 2016. Natural Deep Eutectic Solvents in Extraction Process.
Chemistry and Chemical Technology, 10 (4), 601.
Perkumpulan Endokrinologi Indonesia, 2015. Konsensus Pengelolaan dan
pencegahan diabetes melitus tipe 2 di indonesia 2015. PB. Perkeni.
Prahastuti, S., Tjahjani, S., Hartini, E., 2011. The Effect of Bay Leaf Infusion
(Sygyzium polyanthum) to Decrease Blood Total Cholesterol Level in
Dyslipidemia Model Wistar Rats. Jurnal Medika Planta, 1(4).
Pujiyanto, S., Wijanarka., Raharja, B., Anggreini, V., 2019. Aktivitas Inhibitor α-
Amilase Ekstrak Etanol Tanaman Brotowali (Tinaspora crispa L.). Bioma:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Berkala Ilmiah Biologi, 21 (2), 91-99.
Riaz, Z., Ali, M.N., Quershi, Z., Mohsin, M., 2020. In Vitro Investigation and
Evaluation of Novel Drug Based on Polyherbal Extract against Type 2
Diabetes. Journal of Diabetes Research, article ID 7357462.
Rivai, H., Yulianti, S., Chandra, B., 2019. Qualitative and Quantitative Analysis of
Hexan, Acetone, Ethanol, and Water Extract from Bay Leaves (Sygyzium
polyanthum (Weight) Walp.). The Pharmaceutical and Chemical Journal,
6(3), 13-20.
Saifudin, A., Rahayu, V., Taruna., Hilwan, Y., 2011. Standarisasi Bahan Obat
Alam. Edisi Pertama. Yogyakarta: Graha Ilmu.
Srivastava, M.M., 2011. High-Performance Thin-Layer Chromatography
(HPTLC). Springer, Berlin.
Sudradjat, S.E., 2016. Mengemal Berbagai Obat Herbal dan Penggunaanya.
Jurnal Kedokteran Meditek, 22(60), 62-71.
USP., 2011. <851> Spectrophotometry and Light-Scattering. The United States
Pharmacopeial Convention, 410-415.
Tangaraj, P., 2016. Pharmacological Assays of Plant-Based Natural Products.
Springer, India.
Widharna, R.M., Tamayanti, W.D., Hendriati, L., Hamid, I.S., Widjajakusuma,
E.C., 2015. Antidiabetic effect of the aqueous extract mixture of
Andrographis paniculata and Syzygium polyanthum Leaf. Europan Journal
of Medicinal Plants, 6(2), 82-91.
Widjajakusuma, E.C., Jonosewojo, A., Hendriati, L., Wijaya, S., Ferawati.,
Surjadhana, A., Sastrowardoyo, W., Monita, N., Muna, N. M., Fajarwati, R.
P., Ervina, M., Esar, S.Y., Soegianto, L., Lang, T., Heriyanti, C., 2019.
Phytochemical Screening and Preliminary Clinical Trial of The Aqueous
Extract Mixture of Andrographis paniculata (Burm. f.) Wall. ex Nees and
Syzygium polyanthum (Wight.) Walp Leaves in Metformin Treated Patients
With Type 2 Diabetes. Phytomedicine, 55, 137-147.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Yuan, E., Liu, B., Wei, Q., Yang, J., Chen, L., Li, Q., 2014. Structure Activity
Relationship of Flavonoids as Potent α-Amylase Inhibitors. Natural
Product Communications. 9(8); 1174-1176.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 1. Gambar Serbuk Simplisia Daun Salam dan Ekstrak Air Daun Salam
Gambar 3. Serbuk Simplisia Daun Salam
Gambar 4. Esktrak Air Daun Salam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 2. Surat Keterangan Merapi Farma Herbal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 3. Surat Keterangan Identifikasi Serbuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 4. Data penimbangan Serbuk Simplisia Daun Salam dan Perhitungan
Rendemen Ekstrak
- Data penimbangan serbuk simplisia
Setiap replikasi pembuatan ekstrak ditimbang 10 g serbuk simplisia
Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Wadah 82,9841 44,8848 60,4566
Wadah + Isi 72,9836 54,8857 70,4569
Isi 10,0005 10,0009 10,0003
- Data penimbangan ekstrak
Replikasi 1 (g) Replikasi 3 (g) Replikasi 3 (g)
Wadah 52,0613 55,1317 52,4859
Wadah + Isi 53,6857 51,0303 51,0042
Isi 1,6244 4,41014 1,4817
- Perhitungan rendemen
Replikasi 1
% Rendemen: 1,6244
10,0005 × 100% = 16,24%
Replikasi 2
% Rendemen: 4,1014
10,0009 × 100% = 41, 01%
Replikasi 3
% Rendemen: 1,4817
10,0003 × 100% = 14,81%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Lampiran 5. Hasil Uji Kadar Air Serbuk Simplisia Daun Salam
- Penimbangan
Wadah 63,9128 g
Wadah + Isi 73,9128 g
Isi 10,0000 g
- Volume yang didapatkan 0,5 mL
- % Kadar Air = 0,5 mL
10,0000 g x 100% = 5%
Lampiran 6. Penimbangan Serbuk Simplisia dan Ekstrak Air Daun Salam untuk
KLT
- Serbuk simplisia Daun Salam
Wadah 62,6620 g
Wadah + Isi 63,6620 g
Isi 1,0000 g
- Ekstrak Air Daun Salam
Wadah 62,6555 g
Wadah + Isi 63,6555 g
Isi 1,0000 g
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Penghambatan
Enzim Alfa-Amilase oleh Ekstrak Air Daun Salam
Syzygium polyanthum (Wight) Walp. Secara In Vitro”
memiliki nama lengkap Ayu Priscilla Dewanti, lahir di
Jaar, 2 November 1998. Penulis merupakan anak pertama
dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Oktavianus
Triwibowo dengan Ibu Sri Dewi. Riwayat pendidikan
formal yang ditempuh penulis yaitu Sekolah Dasar di SDN
1 Jaar (2004-2010), Sekolah Menengah Pertama di SMPN
1 Tamiang Layang (2010-2013), dan Sekolah Menengah
Atas di SMAN 1 Tamiang Layang (2013-2016). Pada
tahun 2016 penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma. Selama masa perkuliahan penulis mengikuti berbagai macam
kegiatan di fakultas antara lain sebagai bendahara Desa Mitra 2 (2017), sebagai
sekertaris Live In PMK Apostolos (2018), sebagai anggota divisi dana dan usaha
Pharmacy Performance (2017), sebagai anggota divisi pendaftaran Seminar
Nasional Sadhar Entrepreneurship (2018), sebagai anggota divisi P3K TITRASI
(2018), sebagai peserta dalam Latihan Kepemimpinan Managerial Mahasiswa
Farmasi (2016), serta pernah mengikuti Seminar Nasional Faction 2018 “Healthy
Skin Makes a Dazzing New You”. Selain itu penulis pernah menjadi asisten
praktikum Farmakognosi Fitokimia (2018).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI