OKUŽENOST HMELJA OKUŽENOST HMELJA ((Humulus lupulusHumulus lupulus L.) Z VIROIDI L.) Z VIROIDI
Vlasta KNAPIČ Vlasta KNAPIČ 11, Branka JAVORNIK , Branka JAVORNIK 22
❂1 Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Žalec❂2 BF, Center za žlahtnjenje in rastlinsko biotehnologijo
Viroidi ❂ So najmanjši rastlinski patogeni, ki se v
rastlinski celici sami razmnožujejo. ❂ Na hmelju:
• latentna bolezen hmelja - HLVd • zkrnelost hmelja - HSVd
❂ Viroid = gola, infekciozna nukleinska kislina
Zgradba viroidov - Zgradba viroidov - ss RNAss RNA
Terminalna cona 1 Konzervirani center Terminalna cona 2
Cona patogenosti Cona variabilnosti
C C C C G G
G G G G C C U
C
Viroidna RNA = nosilka dednih informacij= nosilka strukture viroida
Detekcija viroidovDetekcija viroidov
❂ Niso vidni z elektronskim mikroskopomNiso vidni z elektronskim mikroskopom❂ Serološki testi niso mogočiSerološki testi niso mogoči✔ Določljivi so z molekularnimi tehnikami:Določljivi so z molekularnimi tehnikami:
• elektroforeza na PAGEelektroforeza na PAGE
• Molekularna hibridizacija z obeleženo sondo
• prepis z reverzno transkriptazo in PCR namnožitev
Ekstrakcija viroidne RNA iz celiceEkstrakcija viroidne RNA iz celice❂ TESSM TESSM ekstrakcijski puferekstrakcijski pufer
• razbije celico, homogeizira vzorec, inhibira RNAzerazbije celico, homogeizira vzorec, inhibira RNAze
❂ 3 x 3 x fenolna ekstrakcijafenolna ekstrakcija > odstrani beljakovine> odstrani beljakovine
❂ Na acetatNa acetat + izopropanol + izopropanol > precipitira NK iz supernatanta> precipitira NK iz supernatanta
❂ (razgradnja NK z DNAzo I )(razgradnja NK z DNAzo I )❂ čiščenje NK z čiščenje NK z LiClLiCl
• viroidna RNA topna v 0,8 M LiClviroidna RNA topna v 0,8 M LiCl
• druge RNA in DNA se precipitirajo v skupekdruge RNA in DNA se precipitirajo v skupek
• po centrifugiranju je viroidna RNA v supernatantupo centrifugiranju je viroidna RNA v supernatantu
✄ po vsakem koraku sledi centrifugiranje po vsakem koraku sledi centrifugiranje pri 10 do 15000 obr/min za 15 do 20 minutpri 10 do 15000 obr/min za 15 do 20 minut
R-PAGE - povratna elektroforezaReturn Polyacrylamid Gel Electrophoresis
❂ Gel deluje kot molekularno sitoGel deluje kot molekularno sito❂ Skozenj potujejo negativno nabite Skozenj potujejo negativno nabite
molekule NKmolekule NK
❂ Lažje molekule potujejo hitrejeLažje molekule potujejo hitreje
❂ ds RNA potuje hitreje kot dsDNAds RNA potuje hitreje kot dsDNA
❂ viroidna ssRNAviroidna ssRNA (250 - 375 nt) potuje (250 - 375 nt) potuje še hitreje, je pri 7% PAGE medše hitreje, je pri 7% PAGE med
❂ barvili ksilen-cianol in bromfenol barvili ksilen-cianol in bromfenol modromodro
R-PAGE - izbira gela
❂ Gostoto gela daje:Gostoto gela daje:• razmerje akrilaamid : bisakrilamidrazmerje akrilaamid : bisakrilamid
od 29 : 1 do 30 : 1od 29 : 1 do 30 : 1
• koncentracija gelakoncentracija gela
6 % - 8 %6 % - 8 %
❂ Gostejši ko je gelGostejši ko je gel
• bolje loči majhne molekulebolje loči majhne molekule
• dlje traja elektroforezadlje traja elektroforeza
❂ 7 % PAGE traja 2,5 - 3 ure7 % PAGE traja 2,5 - 3 ure
• R-PAGE pa še 1,5 ureR-PAGE pa še 1,5 ure
R-PAGE - Priprava elektroforeze
❂ Med stekleni plošči (16x18 cm) Med stekleni plošči (16x18 cm) vlijemo gelvlijemo gel
❂ Raztopljene NK nanesemo v žepke Raztopljene NK nanesemo v žepke gelagela• 15 ali 20 vzorcev na 1 gel15 ali 20 vzorcev na 1 gel
❂ Gel vstavimo v posodo s pufromGel vstavimo v posodo s pufrom
• Trizma base, borova kislina, EDTATrizma base, borova kislina, EDTA
❂ Priključimo električni tokPriključimo električni tok
• 88 mA, napetost do 10 V/cm poti88 mA, napetost do 10 V/cm poti
• gele hladimo, saj med EF narste gele hladimo, saj med EF narste upornost in tok padaupornost in tok pada
R-PAGE - Potek elektroforeze
❂ Navzdol potuje viroid v linearni oblikiNavzdol potuje viroid v linearni obliki❂ Preden tok obrnemo, ga denaturiramoPreden tok obrnemo, ga denaturiramo
• segrejemo pufer na 70 °Csegrejemo pufer na 70 °C• 5% TBE pufer zamenjamo z 1,25% TBE5% TBE pufer zamenjamo z 1,25% TBE
❂ Vzorci in gel so med EF brezbarvniVzorci in gel so med EF brezbarvni❂ Gel barvamo s srebrom, da zaznamo črte Gel barvamo s srebrom, da zaznamo črte
nukleinskih kislinnukleinskih kislin
❂ meja 5 ng viroida v črti na gelu (10 ng/g rastlinskega tkiva)
Denaturacija viroidovDenaturacija viroidovC C C C G G
G G G G C C U
50°C
70°C
90°C
paličasti okvir
lopar
kolobar
ravna vijačnica
Spremembe oblik:
❂ dovolj viroida v hmeljudovolj viroida v hmelju– storžki / mladi polno razviti lististoržki / mladi polno razviti listi
❂ uspešna ekstrakcijauspešna ekstrakcija– kontaminacija z RNAzamikontaminacija z RNAzami
❂ uspešno čiščenjeuspešno čiščenje– brez beljakovin, polisaharidov, polifenolovbrez beljakovin, polisaharidov, polifenolov– odstranjene DNK in velike RNKodstranjene DNK in velike RNK
❂ uspešno barvanjeuspešno barvanje– fiksiranje RNA v ocetni kislinifiksiranje RNA v ocetni kislini
– barvanje s AgNObarvanje s AgNO33, razvijanje z Na, razvijanje z Na22COCO33 + + NaNa22SS22OO33
R-PAGE - Viroidno črto v gelu zaznamo, če je:Viroidno črto v gelu zaznamo, če je:
1 - krompir1 - krompir
2, 3 - AU2, 3 - AU
4 - apolon4 - apolon
R-PAGE - Viroidne črte v geluViroidne črte v gelu
15¸.12.98
1 2 3 4 1 2 3 4
1 2 3 4
formamidTE pufer
F/TE/F/voda
A - A - supernatantisupernatanti po po
precipitaciji z precipitaciji z LiClLiCl (1x)(1x)
B - B - v vodi raztopljeni v vodi raztopljeni skupkiskupki NK po 1. LiCl NK po 1. LiCl
C - C - brez LiCl,brez LiCl, z DNAzo z DNAzo tretirani skupki v TEtretirani skupki v TE
D - D - supernatantsupernatant po 2. po 2. precipitaciji z precipitaciji z LiCl (2x)LiCl (2x)
E - E - 2 x LiCl 2 x LiCl skupki skupki NKNK
7 % PAGE - Primerjava čiščenja z LiCl
A B C D E
18.01.99, PAGE 7% (AA:bisAA=29:1)
A,B,C,E ekstrakcija iz 1,5 g v 30 ml PAD ekstrakcija iz 1 g v 4x 2 ml epf.3,7, 11, 16, 20 - Storžki magnuma4, 8, 13, 17 - list aurore
M - markerM - marker
1 - AUR Log1 - AUR Log
2 - AUR Log2 - AUR Log
3 - AUR kretenska3 - AUR kretenska
4 - H. japonicus4 - H. japonicus
5 - APO 5 - APO Koroška/s.Koroška/s.
6 - MAG 6 - MAG
7 - PL kontrola 7 - PL kontrola
8 - SG št. 3328 - SG št. 332
9 - 12>PL kontrola9 - 12>PL kontrola
6 % PAGE - Primerjava čiščenja z LiCl
M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 M
List
6.11.97, PAGE I (AA:bisAA=30:0,75)
154
234220
298
6 % R-PAGE - Hmeljev latentni viroid
M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 M M - markerM - marker
- 1 - 1 H. japonicusH. japonicus
+2 AUR Log+2 AUR Log
- 3 - 3 H. japonicusH. japonicus
+4 APO Koroška/s. +4 APO Koroška/s.
+5 SG št. 332 brez LiCl +5 SG št. 332 brez LiCl
+6 MAG/simptomi +6 MAG/simptomi
+7 SG št. 332 / LiCl+7 SG št. 332 / LiCl
+8 MAG/simptomi /LiCl+8 MAG/simptomi /LiCl
+9 - 11 PL kontrola+9 - 11 PL kontrola
6.11.97, R-PAGE II (AA:bisAA=30:0,75)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
M - markerM - marker
1 - AUR Log 41 - AUR Log 4
2 - AUR Log 12 - AUR Log 1
3 - AUR kretenska3 - AUR kretenska
4 - 4 - H. japonicusH. japonicus
5 - APO Koroška/s.5 - APO Koroška/s.
6 - MAG Radlje6 - MAG Radlje
7 - AUR Log 47 - AUR Log 4
8 - AUR Log 18 - AUR Log 1
9 - AUR kretenska9 - AUR kretenska
10 - 10 - H. japonicusH. japonicus
11 - APO Koroška/s.11 - APO Koroška/s.
12 - MAG Radlje12 - MAG Radlje
13, 14>PL kontrola13, 14>PL kontrola
6 % R-PAGE - HLVd
Brez LiCl Čiščenje z LiCl
24.10.97, R-PAGE 6% (AA:bisAA=30:0,75)
➣ 1 - magnum (storžki)1 - magnum (storžki)
➣ 2 - negativna kontrola M2 - negativna kontrola M
➣ 3 - aurora (storžki)3 - aurora (storžki)
➣ 4 - aurora 4 - aurora
➣ 5 - aurora5 - aurora
➣ 6, 7 - neg. PSTVd iz 6, 7 - neg. PSTVd iz gomoljagomolja
➣ 8, 9 - savinjski golding8, 9 - savinjski golding
➣ 10 - aurora (listi)10 - aurora (listi)
➣ 11, 12 - apolon11, 12 - apolon
7 % PAGE - Viroidni pas viden že v prvi smeri
09.12.98
BFB
XCY
raztapljanje NK v formamidu (denaturant )
HLVd pozitivni vzorci hmeljaHLVd pozitivni vzorci hmeljaM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
➣ 1 - Marker
➣ 2 - aurora ‘93 list
➣ 3 - aurora ‘96/list/BV
➣ 4 - 7 aurora 89/storžki
➣ 8 - savinjski golding
➣ 9 - apolon ‘93
➣ 13, 14 - magnum 97
Rezultati analize HLVd v hmeljuRezultati analize HLVd v hmelju
❂ Vsi pregledani vzorci hmelja so bili HLVd Vsi pregledani vzorci hmelja so bili HLVd pozitivni pozitivni
❂ Vzorci : zreli celi storžkiVzorci : zreli celi storžki❂ Fenolna ekstrakcija z LICl obarjanjem Fenolna ekstrakcija z LICl obarjanjem ❂ Detekcijo motijo polifenoli in polisaharidiDetekcijo motijo polifenoli in polisaharidi❂ Na 7% PAG še dovolj dobro ločimo viroidno Na 7% PAG še dovolj dobro ločimo viroidno
RNA od rastlinskihRNA od rastlinskih
Hmeljev stunt viroidHmeljev stunt viroid❂ Je karantenski organizem na JaponskemJe karantenski organizem na Japonskem❂ močno znižuje pridelek, rastlina odmremočno znižuje pridelek, rastlina odmre❂ v letih 1996, 1997 in 1998 smo opazili v letih 1996, 1997 in 1998 smo opazili
simptome:simptome:• zaostajanja v rasti v juniju (aurora)zaostajanja v rasti v juniju (aurora)• deformacija polnorazvitih listov (aurora, magnum)deformacija polnorazvitih listov (aurora, magnum)• odklanjanje rastnih vršičkov (apolon, aurora)odklanjanje rastnih vršičkov (apolon, aurora)• razbarvanje mlajših listov (aurora)razbarvanje mlajših listov (aurora)
❂ simptomatične rastline so rastle v vrstah ali simptomatične rastline so rastle v vrstah ali krogihkrogih
Analiza Hop stunt viroidaAnaliza Hop stunt viroida (Sano, 1998)(Sano, 1998)
Univerza Hirosaki, Faculty of Agriculture and Life Science, Japonska)Univerza Hirosaki, Faculty of Agriculture and Life Science, Japonska)
➣ Ekstrakcija RNAEkstrakcija RNA/ 2M LiCl/ 2M LiCl
➣ 20 20 µµ l vzorca na l vzorca na 7,5% poliakrilamidni gel7,5% poliakrilamidni gel
➣ povratna elektroforezapovratna elektroforeza
➣ “ “recover” pasu s HSVd iz gelarecover” pasu s HSVd iz gela
➣ ponovna elektroforeza na 7,5% ponovna elektroforeza na 7,5% denaturacijskem geludenaturacijskem gelu (8M urea) (8M urea)
➣ barvanje sbarvanje s srebrovim nitratom srebrovim nitratom
PAGE
R-PAGE
PAGE/d
Northern blot za HSVdNorthern blot za HSVd (Sano, 1998) (Sano, 1998)
➨ prenos z gela na naylon prenos z gela na naylon membranomembrano
➨ hibridizacijahibridizacija z DIG označeno z DIG označeno cRNA sondo cRNA sondo
1 2 3 4 5 6 7 8
C
L
1, 2, 3 - AURORA - 89
4, 5 - APOLON - 93
6, 7 - MAGNUM - 97
8 - HSVd pozitivno
Ekstrakcija RNA/ 2M LiCl
20 µ l vzorca na 7,5% R-PAGE
“recover” HSVd iz gela
ponovna elektroforeza na 7,5% denaturacijskem gelu (8M urea)
Dot-blot za HSVdDot-blot za HSVd (Sano, 1998) (Sano, 1998)
Označenasonda
RNA
DIG
Anti_DIGantibody
Hranilni
pufer
Alkalna fosfataza
DETEKCIJA
Sevanje
svetlobe
Ekstrakcija RNAEkstrakcija RNA/ 2M LiCl/ 2M LiCl➨ 5 5 µµ l vzorca l vzorca denaturira denaturira
✜ v 20 v 20 µµ l denat. Raztopinel denat. Raztopine
✜ pri 68°C za 15 minpri 68°C za 15 min
➨ točkovno nakaplja točkovno nakaplja na na pozitivno nabito naylon pozitivno nabito naylon membranomembrano
➨ hibridizacijahibridizacija z DIG z DIG označeno HSVd cRNA označeno HSVd cRNA sondosondo
➨ Vsi vzorci slov. kultivarjev Vsi vzorci slov. kultivarjev so bili na HSVd negativniso bili na HSVd negativni
2D-PAGE za HSVd (Sano, 1998)
➨ po molekulski teži razporejene NK po molekulski teži razporejene NK izpostavimo toku v pravokotni izpostavimo toku v pravokotni smeri smeri v denaturacijskih razmerahv denaturacijskih razmerah
➨ viroid pri tem zaradi krožne oblike viroid pri tem zaradi krožne oblike potuje počasneje - ga prepoznamopotuje počasneje - ga prepoznamo
➨ Vsi vzorci so bili na HSVd negativniVsi vzorci so bili na HSVd negativni
➨ ta metoda bi pokazala tudi druge - ta metoda bi pokazala tudi druge - viroidom podobne povzročiteljeviroidom podobne povzročitelje
ZaključkiZaključki➨ Povratna elektroforeza na Povratna elektroforeza na
poliakrilamidnem gelupoliakrilamidnem gelu je primerna metoda je primerna metoda za serijsko določanje viroidov v hmeljuza serijsko določanje viroidov v hmelju
➨ Je sorazmerno poceniJe sorazmerno poceni➨ V enem postopku lahko analiziramo 40 V enem postopku lahko analiziramo 40
vzorcevvzorcev➨priprava vzorcev traja 2 dnipriprava vzorcev traja 2 dni
➨elektroforeza in barvanje 1 danelektroforeza in barvanje 1 dan
➨ Je sorazmerno natančnaJe sorazmerno natančna
ZaključkiZaključki➨ Različne elektroforetske metodeRazlične elektroforetske metode so ovrgle so ovrgle
sum, da je hmelj okužen s HSVdsum, da je hmelj okužen s HSVd➨ Pravilno določitev sta potrdili Northern-Pravilno določitev sta potrdili Northern-
blot in dot blot metoda hibridizacije:blot in dot blot metoda hibridizacije:➨ Pregledani kultivarji, ki so kazali Pregledani kultivarji, ki so kazali
simptome zakrnele rasti, niso okuženi s simptome zakrnele rasti, niso okuženi s HSVd :HSVd :➨aurora, apolon in magnumaurora, apolon in magnum
➨ Niso okuženi z drugimi znanimi subviralnimi Niso okuženi z drugimi znanimi subviralnimi povzročiteljipovzročitelji
ZaključkiZaključki
➨ Z R-PAGE smo dokazali HLVd Z R-PAGE smo dokazali HLVd ➨ S hmeljevim latentnim viroidom so S hmeljevim latentnim viroidom so
okuženi pregledani kultivarji:okuženi pregledani kultivarji:➨ auroraaurora
➨apolonapolon
➨savinjski goldingsavinjski golding
➨magnummagnum