Pvr99 vd

OKUŽENOST HMELJA OKUŽENOST HMELJA ((Humulus lupulusHumulus lupulus L.) Z VIROIDI L.) Z VIROIDI

Vlasta KNAPIČ Vlasta KNAPIČ 11, Branka JAVORNIK , Branka JAVORNIK 22

❂1 Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Žalec❂2 BF, Center za žlahtnjenje in rastlinsko biotehnologijo

Viroidi ❂ So najmanjši rastlinski patogeni, ki se v

rastlinski celici sami razmnožujejo. ❂ Na hmelju:

• latentna bolezen hmelja - HLVd • zkrnelost hmelja - HSVd

❂ Viroid = gola, infekciozna nukleinska kislina

Zgradba viroidov - Zgradba viroidov - ss RNAss RNA

Terminalna cona 1 Konzervirani center Terminalna cona 2

Cona patogenosti Cona variabilnosti

C C C C G G

G G G G C C U

C

Viroidna RNA = nosilka dednih informacij= nosilka strukture viroida

Detekcija viroidovDetekcija viroidov

❂ Niso vidni z elektronskim mikroskopomNiso vidni z elektronskim mikroskopom❂ Serološki testi niso mogočiSerološki testi niso mogoči✔ Določljivi so z molekularnimi tehnikami:Določljivi so z molekularnimi tehnikami:

• elektroforeza na PAGEelektroforeza na PAGE

• Molekularna hibridizacija z obeleženo sondo

• prepis z reverzno transkriptazo in PCR namnožitev

Rastlinska celicaRastlinska celica

Ekstrakcija viroidne RNA iz celiceEkstrakcija viroidne RNA iz celice❂ TESSM TESSM ekstrakcijski puferekstrakcijski pufer

• razbije celico, homogeizira vzorec, inhibira RNAzerazbije celico, homogeizira vzorec, inhibira RNAze

❂ 3 x 3 x fenolna ekstrakcijafenolna ekstrakcija > odstrani beljakovine> odstrani beljakovine

❂ Na acetatNa acetat + izopropanol + izopropanol > precipitira NK iz supernatanta> precipitira NK iz supernatanta

❂ (razgradnja NK z DNAzo I )(razgradnja NK z DNAzo I )❂ čiščenje NK z čiščenje NK z LiClLiCl

• viroidna RNA topna v 0,8 M LiClviroidna RNA topna v 0,8 M LiCl

• druge RNA in DNA se precipitirajo v skupekdruge RNA in DNA se precipitirajo v skupek

• po centrifugiranju je viroidna RNA v supernatantupo centrifugiranju je viroidna RNA v supernatantu

✄ po vsakem koraku sledi centrifugiranje po vsakem koraku sledi centrifugiranje pri 10 do 15000 obr/min za 15 do 20 minutpri 10 do 15000 obr/min za 15 do 20 minut

R-PAGE - povratna elektroforezaReturn Polyacrylamid Gel Electrophoresis

❂ Gel deluje kot molekularno sitoGel deluje kot molekularno sito❂ Skozenj potujejo negativno nabite Skozenj potujejo negativno nabite

molekule NKmolekule NK

❂ Lažje molekule potujejo hitrejeLažje molekule potujejo hitreje

❂ ds RNA potuje hitreje kot dsDNAds RNA potuje hitreje kot dsDNA

❂ viroidna ssRNAviroidna ssRNA (250 - 375 nt) potuje (250 - 375 nt) potuje še hitreje, je pri 7% PAGE medše hitreje, je pri 7% PAGE med

❂ barvili ksilen-cianol in bromfenol barvili ksilen-cianol in bromfenol modromodro

R-PAGE - izbira gela

❂ Gostoto gela daje:Gostoto gela daje:• razmerje akrilaamid : bisakrilamidrazmerje akrilaamid : bisakrilamid

od 29 : 1 do 30 : 1od 29 : 1 do 30 : 1

• koncentracija gelakoncentracija gela

6 % - 8 %6 % - 8 %

❂ Gostejši ko je gelGostejši ko je gel

• bolje loči majhne molekulebolje loči majhne molekule

• dlje traja elektroforezadlje traja elektroforeza

❂ 7 % PAGE traja 2,5 - 3 ure7 % PAGE traja 2,5 - 3 ure

• R-PAGE pa še 1,5 ureR-PAGE pa še 1,5 ure

R-PAGE - Priprava elektroforeze

❂ Med stekleni plošči (16x18 cm) Med stekleni plošči (16x18 cm) vlijemo gelvlijemo gel

❂ Raztopljene NK nanesemo v žepke Raztopljene NK nanesemo v žepke gelagela• 15 ali 20 vzorcev na 1 gel15 ali 20 vzorcev na 1 gel

❂ Gel vstavimo v posodo s pufromGel vstavimo v posodo s pufrom

• Trizma base, borova kislina, EDTATrizma base, borova kislina, EDTA

❂ Priključimo električni tokPriključimo električni tok

• 88 mA, napetost do 10 V/cm poti88 mA, napetost do 10 V/cm poti

• gele hladimo, saj med EF narste gele hladimo, saj med EF narste upornost in tok padaupornost in tok pada

R-PAGE - Potek elektroforeze

❂ Navzdol potuje viroid v linearni oblikiNavzdol potuje viroid v linearni obliki❂ Preden tok obrnemo, ga denaturiramoPreden tok obrnemo, ga denaturiramo

• segrejemo pufer na 70 °Csegrejemo pufer na 70 °C• 5% TBE pufer zamenjamo z 1,25% TBE5% TBE pufer zamenjamo z 1,25% TBE

❂ Vzorci in gel so med EF brezbarvniVzorci in gel so med EF brezbarvni❂ Gel barvamo s srebrom, da zaznamo črte Gel barvamo s srebrom, da zaznamo črte

nukleinskih kislinnukleinskih kislin

❂ meja 5 ng viroida v črti na gelu (10 ng/g rastlinskega tkiva)

Denaturacija viroidovDenaturacija viroidovC C C C G G

G G G G C C U

50°C

70°C

90°C

paličasti okvir

lopar

kolobar

ravna vijačnica

Spremembe oblik:

❂ dovolj viroida v hmeljudovolj viroida v hmelju– storžki / mladi polno razviti lististoržki / mladi polno razviti listi

❂ uspešna ekstrakcijauspešna ekstrakcija– kontaminacija z RNAzamikontaminacija z RNAzami

❂ uspešno čiščenjeuspešno čiščenje– brez beljakovin, polisaharidov, polifenolovbrez beljakovin, polisaharidov, polifenolov– odstranjene DNK in velike RNKodstranjene DNK in velike RNK

❂ uspešno barvanjeuspešno barvanje– fiksiranje RNA v ocetni kislinifiksiranje RNA v ocetni kislini

– barvanje s AgNObarvanje s AgNO33, razvijanje z Na, razvijanje z Na22COCO33 + + NaNa22SS22OO33

R-PAGE - Viroidno črto v gelu zaznamo, če je:Viroidno črto v gelu zaznamo, če je:

1 - krompir1 - krompir

2, 3 - AU2, 3 - AU

4 - apolon4 - apolon

R-PAGE - Viroidne črte v geluViroidne črte v gelu

15¸.12.98

1 2 3 4 1 2 3 4

1 2 3 4

formamidTE pufer

F/TE/F/voda

A - A - supernatantisupernatanti po po

precipitaciji z precipitaciji z LiClLiCl (1x)(1x)

B - B - v vodi raztopljeni v vodi raztopljeni skupkiskupki NK po 1. LiCl NK po 1. LiCl

C - C - brez LiCl,brez LiCl, z DNAzo z DNAzo tretirani skupki v TEtretirani skupki v TE

D - D - supernatantsupernatant po 2. po 2. precipitaciji z precipitaciji z LiCl (2x)LiCl (2x)

E - E - 2 x LiCl 2 x LiCl skupki skupki NKNK

7 % PAGE - Primerjava čiščenja z LiCl

A B C D E

18.01.99, PAGE 7% (AA:bisAA=29:1)

A,B,C,E ekstrakcija iz 1,5 g v 30 ml PAD ekstrakcija iz 1 g v 4x 2 ml epf.3,7, 11, 16, 20 - Storžki magnuma4, 8, 13, 17 - list aurore

M - markerM - marker

1 - AUR Log1 - AUR Log

2 - AUR Log2 - AUR Log

3 - AUR kretenska3 - AUR kretenska

4 - H. japonicus4 - H. japonicus

5 - APO 5 - APO Koroška/s.Koroška/s.

6 - MAG 6 - MAG

7 - PL kontrola 7 - PL kontrola

8 - SG št. 3328 - SG št. 332

9 - 12>PL kontrola9 - 12>PL kontrola

6 % PAGE - Primerjava čiščenja z LiCl

M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 M

List

6.11.97, PAGE I (AA:bisAA=30:0,75)

154

234220

298

6 % R-PAGE - Hmeljev latentni viroid

M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 M M - markerM - marker

- 1 - 1 H. japonicusH. japonicus

+2 AUR Log+2 AUR Log

- 3 - 3 H. japonicusH. japonicus

+4 APO Koroška/s. +4 APO Koroška/s.

+5 SG št. 332 brez LiCl +5 SG št. 332 brez LiCl

+6 MAG/simptomi +6 MAG/simptomi

+7 SG št. 332 / LiCl+7 SG št. 332 / LiCl

+8 MAG/simptomi /LiCl+8 MAG/simptomi /LiCl

+9 - 11 PL kontrola+9 - 11 PL kontrola

6.11.97, R-PAGE II (AA:bisAA=30:0,75)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

M - markerM - marker

1 - AUR Log 41 - AUR Log 4



4 - 4 - H. japonicusH. japonicus

5 - APO Koroška/s.5 - APO Koroška/s.

6 - MAG Radlje6 - MAG Radlje




10 - 10 - H. japonicusH. japonicus

11 - APO Koroška/s.11 - APO Koroška/s.

12 - MAG Radlje12 - MAG Radlje

13, 14>PL kontrola13, 14>PL kontrola

6 % R-PAGE - HLVd

Brez LiCl Čiščenje z LiCl

24.10.97, R-PAGE 6% (AA:bisAA=30:0,75)

➣ 1 - magnum (storžki)1 - magnum (storžki)

➣ 2 - negativna kontrola M2 - negativna kontrola M

➣ 3 - aurora (storžki)3 - aurora (storžki)

➣ 4 - aurora 4 - aurora

➣ 5 - aurora5 - aurora

➣ 6, 7 - neg. PSTVd iz 6, 7 - neg. PSTVd iz gomoljagomolja

➣ 8, 9 - savinjski golding8, 9 - savinjski golding

➣ 10 - aurora (listi)10 - aurora (listi)

➣ 11, 12 - apolon11, 12 - apolon

7 % PAGE - Viroidni pas viden že v prvi smeri

09.12.98

BFB

XCY

raztapljanje NK v formamidu (denaturant )

HLVd pozitivni vzorci hmeljaHLVd pozitivni vzorci hmeljaM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

➣ 1 - Marker

➣ 2 - aurora ‘93 list

➣ 3 - aurora ‘96/list/BV

➣ 4 - 7 aurora 89/storžki

➣ 8 - savinjski golding

➣ 9 - apolon ‘93

➣ 13, 14 - magnum 97

Rezultati analize HLVd v hmeljuRezultati analize HLVd v hmelju

❂ Vsi pregledani vzorci hmelja so bili HLVd Vsi pregledani vzorci hmelja so bili HLVd pozitivni pozitivni

❂ Vzorci : zreli celi storžkiVzorci : zreli celi storžki❂ Fenolna ekstrakcija z LICl obarjanjem Fenolna ekstrakcija z LICl obarjanjem ❂ Detekcijo motijo polifenoli in polisaharidiDetekcijo motijo polifenoli in polisaharidi❂ Na 7% PAG še dovolj dobro ločimo viroidno Na 7% PAG še dovolj dobro ločimo viroidno

RNA od rastlinskihRNA od rastlinskih

Hmeljev stunt viroidHmeljev stunt viroid❂ Je karantenski organizem na JaponskemJe karantenski organizem na Japonskem❂ močno znižuje pridelek, rastlina odmremočno znižuje pridelek, rastlina odmre❂ v letih 1996, 1997 in 1998 smo opazili v letih 1996, 1997 in 1998 smo opazili

simptome:simptome:• zaostajanja v rasti v juniju (aurora)zaostajanja v rasti v juniju (aurora)• deformacija polnorazvitih listov (aurora, magnum)deformacija polnorazvitih listov (aurora, magnum)• odklanjanje rastnih vršičkov (apolon, aurora)odklanjanje rastnih vršičkov (apolon, aurora)• razbarvanje mlajših listov (aurora)razbarvanje mlajših listov (aurora)

❂ simptomatične rastline so rastle v vrstah ali simptomatične rastline so rastle v vrstah ali krogihkrogih

Analiza Hop stunt viroidaAnaliza Hop stunt viroida (Sano, 1998)(Sano, 1998)

Univerza Hirosaki, Faculty of Agriculture and Life Science, Japonska)Univerza Hirosaki, Faculty of Agriculture and Life Science, Japonska)

➣ Ekstrakcija RNAEkstrakcija RNA/ 2M LiCl/ 2M LiCl

➣ 20 20 µµ l vzorca na l vzorca na 7,5% poliakrilamidni gel7,5% poliakrilamidni gel

➣ povratna elektroforezapovratna elektroforeza

➣ “ “recover” pasu s HSVd iz gelarecover” pasu s HSVd iz gela

➣ ponovna elektroforeza na 7,5% ponovna elektroforeza na 7,5% denaturacijskem geludenaturacijskem gelu (8M urea) (8M urea)

➣ barvanje sbarvanje s srebrovim nitratom srebrovim nitratom

PAGE

R-PAGE

PAGE/d

Northern blot za HSVdNorthern blot za HSVd (Sano, 1998) (Sano, 1998)

➨ prenos z gela na naylon prenos z gela na naylon membranomembrano

➨ hibridizacijahibridizacija z DIG označeno z DIG označeno cRNA sondo cRNA sondo

1 2 3 4 5 6 7 8

C

L

1, 2, 3 - AURORA - 89

4, 5 - APOLON - 93

6, 7 - MAGNUM - 97

8 - HSVd pozitivno

Ekstrakcija RNA/ 2M LiCl

20 µ l vzorca na 7,5% R-PAGE

“recover” HSVd iz gela

ponovna elektroforeza na 7,5% denaturacijskem gelu (8M urea)

Dot-blot za HSVdDot-blot za HSVd (Sano, 1998) (Sano, 1998)

Označenasonda

RNA

DIG

Anti_DIGantibody

Hranilni

pufer

Alkalna fosfataza

DETEKCIJA

Sevanje

svetlobe

Ekstrakcija RNAEkstrakcija RNA/ 2M LiCl/ 2M LiCl➨ 5 5 µµ l vzorca l vzorca denaturira denaturira

✜ v 20 v 20 µµ l denat. Raztopinel denat. Raztopine

✜ pri 68°C za 15 minpri 68°C za 15 min

➨ točkovno nakaplja točkovno nakaplja na na pozitivno nabito naylon pozitivno nabito naylon membranomembrano

➨ hibridizacijahibridizacija z DIG z DIG označeno HSVd cRNA označeno HSVd cRNA sondosondo

➨ Vsi vzorci slov. kultivarjev Vsi vzorci slov. kultivarjev so bili na HSVd negativniso bili na HSVd negativni

2D-PAGE za HSVd (Sano, 1998)

➨ po molekulski teži razporejene NK po molekulski teži razporejene NK izpostavimo toku v pravokotni izpostavimo toku v pravokotni smeri smeri v denaturacijskih razmerahv denaturacijskih razmerah

➨ viroid pri tem zaradi krožne oblike viroid pri tem zaradi krožne oblike potuje počasneje - ga prepoznamopotuje počasneje - ga prepoznamo

➨ Vsi vzorci so bili na HSVd negativniVsi vzorci so bili na HSVd negativni

➨ ta metoda bi pokazala tudi druge - ta metoda bi pokazala tudi druge - viroidom podobne povzročiteljeviroidom podobne povzročitelje

ZaključkiZaključki➨ Povratna elektroforeza na Povratna elektroforeza na

poliakrilamidnem gelupoliakrilamidnem gelu je primerna metoda je primerna metoda za serijsko določanje viroidov v hmeljuza serijsko določanje viroidov v hmelju

➨ Je sorazmerno poceniJe sorazmerno poceni➨ V enem postopku lahko analiziramo 40 V enem postopku lahko analiziramo 40

vzorcevvzorcev➨priprava vzorcev traja 2 dnipriprava vzorcev traja 2 dni

➨elektroforeza in barvanje 1 danelektroforeza in barvanje 1 dan

➨ Je sorazmerno natančnaJe sorazmerno natančna

ZaključkiZaključki➨ Različne elektroforetske metodeRazlične elektroforetske metode so ovrgle so ovrgle

sum, da je hmelj okužen s HSVdsum, da je hmelj okužen s HSVd➨ Pravilno določitev sta potrdili Northern-Pravilno določitev sta potrdili Northern-

blot in dot blot metoda hibridizacije:blot in dot blot metoda hibridizacije:➨ Pregledani kultivarji, ki so kazali Pregledani kultivarji, ki so kazali

simptome zakrnele rasti, niso okuženi s simptome zakrnele rasti, niso okuženi s HSVd :HSVd :➨aurora, apolon in magnumaurora, apolon in magnum

➨ Niso okuženi z drugimi znanimi subviralnimi Niso okuženi z drugimi znanimi subviralnimi povzročiteljipovzročitelji

ZaključkiZaključki

➨ Z R-PAGE smo dokazali HLVd Z R-PAGE smo dokazali HLVd ➨ S hmeljevim latentnim viroidom so S hmeljevim latentnim viroidom so

okuženi pregledani kultivarji:okuženi pregledani kultivarji:➨ auroraaurora

➨apolonapolon

➨savinjski goldingsavinjski golding

➨magnummagnum

❂ Ali HLVd v stresnih Ali HLVd v stresnih razmerah povzroča razmerah povzroča

simptome?simptome?

Pvr99 vd

Education