USO DE MARCADORES MICROSATELITES EN
CARACTERIZACIÓN ZOOGENÉTICA Y SELECCIÓN
DE REPRODUCTORES
O. Roberto Martínez López,
Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas – CEMIT
Dirección General de Investigación Científica y Tecnológica – DGICT
Universidad Nacional de Asunción – UNA
RED CONBIAND - Paraguay
CARACTERIZACIÓN ZOOGENÉTICA
SELECCIÓN DE REPRODUCTORES
MARCADORES MICROSATELITES
Circuito de la información
La historia comienza así: ¿¿¿Son genéticamente iguales...???
Raza Hereford Raza Pampa Chaqueño
¿¿¿Son genéticamente iguales...???
Raza Serpentina
Centro y sur de Portugal
Raza Moxotó
Semi-árido Pernambuco, Brasil
¿¿¿Son genéticamente iguales...???
Raza Nelore Raza Brahman
Como se determina una raza bovina???
Antes y Ahora : Patrón Racial (m)
Ahora y después¿? : Caracterización genética
con marcadores moleculares
¿¿¿Marcadores Moleculares???
Caracterización Animal
Caracterización
Animal
C. Etnozoológica C. Fenotípica
C. Productiva
C. Reproductiva
C. Carcasa
Morfológica y
Zoométrica
C. Genética
Nivel Protéico Marcadores
Moleculares
Microsatélites
Cromosoma Y
C. Geográfica
Fonte: FAO
¿¿¿Qué hacer...???
Marcadores tipo: Microsatelites ?????
SSR fragmentos cortos ADN, 1 a 6 pb, que se repiten en el tándem, de forma aleatoria
en el genoma de los seres vivos
Comparando SSR con otros ventajas:
Alto grado de polimorfismo,
Herencia mendeliana simple,
Co-dominantes
Fáciles de medir y analizar,
Fiabilidad 100%,
Repetitivos y automatizables.
Se encuentran generalmente en regiones no codificadas del genoma y distribuidos
uniformemente
Fonte: Goldstein e Schlotterer, (1999); Prosdocimi, (2001); Graça, (2002).
Marcadores Microsatélites – SSR
- Permite que el ADN de una región seleccionada, sea
amplificada un billón de veces Primers
Con la técnica de la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR),
luego de sus 3 etapas………….
A= ADENINA T = TIMINA C = CITOSINA G = GUANINA
•Donde encontrar un microsatelite?? •En una región polimórfica dentro del genoma POLIMORFISMO: Una variación existente en el genoma, caracteristico en cada individuo, o población, o raza, o especie…
C R O M O S O M A S
G E N E S
A L E L O S
F R E C U E N C I A S
B A S E S
P R O T E I N A S
M O L E C U L A S
E T C
REGIÓN POLIMÓRFICA
MICROSATELITES OTROS MARCADORES
INRA 18
TGLA 22
BM 1824
SPS 115
BM 2113
CRSM 60
ILSTS 6
HEL 9
AFLP
RAPD
VNTR
RFLP
Etc.
ETH 22
HAUT 24
HAUT 27
INRA 35
TGLAA 12
HEL 13
ETH 185
CSSM 66
-INDIVIDUO 1 = INDIVIDUO 3 EN EL MICROSATELITE “X” ESTUDIADO -INDIVIDUO 1 Y 3 SON DIFERENTES AL INDIVIDUO 2 EN EL MICROSALITE
“x” ESTUDIADO.
Caracterización Zoogenética
Caracterizar = Identificar genotípicamente y
establecer un rango típico
Nuevas poblaciones zoogenéticas, o sea,
razas locales, criollas o autóctonas.
Caracterización Animal
Caracterización
Animal
C. Etnozoológica C. Fenotípica
C. Productiva
C. Reproductiva
C. Carcasa
Morfológica y
Zoométrica
C. Genética
Nivel Protéico Marcadores
Moleculares
Microsatélites
Cromosoma Y
C. Geográfica
Fonte: FAO
Animales Domésticos = Especies sufrieron Intervención del Hombre
c/ objeto utilizarlos para producción u otro fin. Histórico y Actual
+ Contemporánea = Compañía
Ejm: Mamíferos, aves, etc.
Animales Silvestres = Especies condición de vida sin intervención
DIRECTA del hombre o, cuyo procesos reproductivos, morfológicos,
genéticos o de comportamiento no han sido alterados con fines
específicos Hombre
-Valor productivo/económico
Valor comercial
-Valor recreativo y estético
-Valor científico
-Valor ecológico
-Valor cultural
Porqué caracterizar la zoogenética local?
VALOR
….realmente todo terminó ahí??
Especie Raza País Rasgo
Bovina N’dama Senegal Resistencia a la Tripanosomiasis.
Bovina Blanco
Orejinegro Colombia
-Resistencia a la infestación con la mosca Dermatobia hominis
(Nuche/Ura/Berne) y a la Brucella abortus
-Animales de trabajo para zonas de ladera, mansedumbre
Bovina San Martinero Colombia Tolerancia al clima cálido y húmedo, alta fertilidad, alta longevidad,
excelente habilidad materna, mansedumbre
Porcina Taihu China -Aprovecha productos forrajeros en su alimentación,
-Producen camadas medias de 16 cochinillos, su carne es jugosa y sabrosa
Porcina Casco de mula Colombia -Resistente a la fiebre aftosa
Equina Pantaneiro Brasil -Resistencia a la anemia infecciosa equina
Caprina Jamunapari India -Raza lechera que puede sobrevivir en climas áridos y estériles
Bovina Pantaneira Brasil -Buenísima reproducción en el pantanal
-Resistencia a parásitos
Bovina Patágónica Argentina -Longevidad Reproduc. = 8-10 crías/vida
Ovina Patagónica Argentina -Rusticidad y prolificidad =Paatagonia
San Martinero Blanco Ojinegro
Cerdo Mula Criolla Colombiana
Criollo Lageano
Criollo Alto Andino Perú Criollo Yacumeño Boliviano
Figura 6: toro NOA (NM) Figura 5: vaca NOA (NH)
Figura 7: vaca patagónica (PH) Figura 8: toro patagónico (NH)
2 Caracterizar
3 Conservar
4 Mejorar
5 Producir
comercialmente
A (1), B(2), C(3), D(4), E(5), de la gestión de los RGA
Procedimientos para la gestión de RGA
Informe país 2004 Comisión nacional consultiva (CNC = FCV/UNA, ARP, VMG/MAG, otras instituciones)
Bovinos con Características Criollas (4)
Pampa Chaqueño = Amenazada-Mantenida
Criollo Pilcomayo (General Diaz) = Amenzada-Mantenida
Criollo Ñeembucú = Critica
Criollo Arroyense = Crítica
BOBINOS PARAGUAYOS CON CARACTERÍSTICAS CRIOLLAS
Pampa Chaqueño
Región Occidental .
Asociación de Criadores
Resistencia y adaptación
Criollo Pilcomayo:
Chaco (Tte. E. Martínez, Gral.
Díaz y el rió Pilcomayo).
Adaptación campos bajos
Criollo Arroyense:
• Zona de Arroyos y Esteros y 25 Diciembre
• Cruzamiento con Cebuíno
Criollo Ñeembucú:
• Zona pantanosa de los esteros del Ñeembucú
•Capacidad de habitar el humedal “barrera”
Dócil,
Rústico,
Precoz,
Alta tasa reproductiva
Calidad de la carcasa
•FELIUS (Cattle breeds of the world, USA, 1985), Cruzas de Criollo con R. Europeas = Criollo-
Hereford / Pampa Características interesantes de productividad en el semi-árido chaqueño
Asociación de Criadores del Pampa Chaqueño = 90’s
Identificación y colecta
Centrales de Pruebas
Formación de rebaños élites
Pruebas de comportamiento reproductores
Multiplicación de vientres
Determinación de Padrón racial
1994 Solicitación de Reconocimiento = Raza Bovina Py
Fuente: ANALES, 2002
Comisión Técnica P. F. da A. R. P. RECHAZÓ
ARGUMENTO: Después de una Inspección Visual (1994):
1 Predominio de genes aportados x R. Británicas Hereford
2 Terneros Bien alimentados = Resurgen las cualidades del Hereford. “O sea, las
cualidades de la raza Hereford se encuentran latentes”
3 Terneros productos PCh. X Cebú y H. x Cebú = Similares
Fuente: Resolución Técnica de la ARP (1994).
¿¿¿Son genéticamente iguales...???
ENTONCES... ¿A qué denominamos raza?
En Paraguay, Como está regido esto ???
Las razas bovinas deben ser fenotipicamente y/o exteriormente diferentes???
En España, Francia, Portugal, Italia, EUA caracterización genética para
diferenciar grupos, además de uma revisión de historia y geografia.
En España es exigencia presentar “Caracterización Genética” para solicitar el
reconocimiento (catalogado) de una raza de un animal doméstico.
Esto es regido por el Comite Español de Razas de Ganado
Analizar las distancias genéticas entre el Pampa Chaqueño, el Criollo
Pilcomayo y razas importadas como la raza inglesa Hereford, por
medio de marcadores microsatélites.
Trabajo-Objetivos
Caracterizar genéticamente los bovinos Pampa Chaqueño y Criollo
Pilcomayo, estudiando su variabilidad genética
BOVINOS
Materias e Métodos
Pampa Chaqueño: 4 Rebaños/95 animales (M/F)
Hereford: 2 criadores/ 30 animales (M/F) y 15 Hereford de Mexico
Criollo Pilcomayo: 1 rebaño/ 36 animales (M/F)
- Obtención de las muestras
-Bovinos colectados en el Paraguay: Material biológico Pelos de la cola
-4 haciendas criadoras de PCH, 1 hacienda de C. Pilcomayo e, 2 de Hereford
-Aproximadamente 50 pelos/animal --Siempre: Pelos con raíces (bulbos)
-Método: Extraídos manualmente (metodología Linkgen, São Paulo)
-Guardados en sobres
debidamente identificados
-Conservadas a temperatura
ambiente hasta su llegada al
laboratório
LAVADO y CENTRIFUGADO
EXTRACCIÓN de ADN
PURIFICACIÓN
Pelo y tejido
DISOLUCIÓN
-Localización Laboratório de Genética Molecular da UCO Córdoba/España
-Extracción ADN Realizada x medio de una Resina comercial (Kit
BLOODCLEAN)
-Metodología BIOTOOLS – Biotechnological & Medical Laboratories
ANÁLISIS DE LABORATORIO
- Permite que el ADN de una región seleccionada, sea
amplificada un billón de veces Primers
ANÁLISES DE LABORATORIO
Eletroforese Géis de policrilamida a 8%.
Seqüenciador automático ABI Prism 377XL
ANÁLISES DE LABORATORIO
Bandas de DNA obtidas nos géis a partir da eletroforese, observados com o programa GENESCAN
Número de Alélos (Genepop® 3.1)
Frecuencias Genotípicas (Genepop® 3.1)
Heterozigosis (Genetix® 4.05.02)
Contenido de Información Polimórfica (Excel® MS Toolkit)
Equilíbrio H-W (Genepop®)
Distancias Genéticas entre Poblaciones (Populations®1.2.28)
Árboles genéticos (Treeview®)
Análisis Multivariado (Genetix® 4.05.02)
Asignación de Indivíduos (Structure® 2.1)
Análisis Estadistico
Resultados
A. Caracterización de los Bovinos Criollos.
Estudio de 3 poblaciones bovinas del Paraguay
Resultados
PCH CNE HER
PCH 0 0.12199 0.140441
CNE 0.12199 0 0.281642
HER 0.140441 0.281642 0
Tabla 7. Distância Genética DA de Nei, entre o Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Ñeembucú (CNE)
e Hereford (HER). POPULATIONS
HER
0.1
PCH
CNE
Figura 4. Distâncias genéticas DA de Nei, obtidas pelo
método de Neigh Joining. TREEVIEW, Radial.
Limousine Charolaise
Resultados
HER PCH CNE
Figura 3. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual dos bovinos, Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 3D.
Resultados
Figura 10: Dendrograma de distâncias genéticas individuais entre todos os bovinos Pampa Chaqueño, Crioulo de Pilcomayo e Hereford. Referências:
(95) Pampa Chaqueño (36) Crioulo Pilcomayo (45) Hereford (Paraguay y Mexico)
PCH
CNE HER
K2
K3
K4
K5
K6
Resultados
K 6 P
PCH
CNE HER
: Estrutura genéticas de las poblaciones
paraguayas, primero individualmente de K2 a
K6
Y despues por poblaciones. STRUCTURE.
Resultados
Figura 8. Determinação da amplitude do valor de K com ótimo obtido a partir do
logaritmo de probabilidade de asignaçao de indivíduos.
B. RELACIÓN GENETICA ENTRE LOS CRIOLLOS PARAGUAYOS Y OTRAS
RAZAS DEL MUNDO
Resultados
População/Raça Codigo Origem/Pais
1 Pampa Chaqueño PCH Paraguai Paraguai
2 Crioulo Ñeembucú CNE Paraguai Paraguai
3 Crioulo Mexicano CMX Mexico Mexico
4 Crioulo Argentino CAR Argentina Argentina
5 Crioulo Colombiano CCO Colombia Colombia
6 Crioulo Uruguaio CUR Uruaguai Uruguai
7 Berrenda Vermelha CPR Espanha Espanha
8 Berrenda Preto BNM Espanha Espanha
9 Marismeña MAR Espanha Espanha
10 Pajuna PAJ Espanha Espanha
11 Retinto RET Espanha Espanha
12 De Lidia LID Espanha Espanha
13 Negra Andaluza NAN Espanha Espanha
14 Vaca Canaria VCA Espanha Espanha
15 Palmera PAL Espanha Espanha
16 Frisona FRI Holanda Mexico
17 Pardo Suizo SPA Suiza Mexico
18 Hereford HER Inglaterra Paraguai
19 Holando Zebú HOC Cruza Mexico
20 Brahma BRH Brasil EUA
21 Gir GIR Brasil India
22 Nelore NEL Brasil India
Tabela 10: Poblaciones o razas utlilizadas en esta parte del estudio,
Figura 13. Distância genética DA de Nei, pelo método do vizinho mais próximo (DANJ), entre 19
populações bovinas.
0.1
PCH
HER
93
CAR
CUR
84
48
MEX
CNE
CCO
98 95
46
VCA
PAL
97
FRI
SPA
38
27
9
MAR
RET
BPR
PAJ
58
12
4
LID
BNM
NAN
46
13
Resultados
Espanhois
CMX HOC
CCO
CNE
CAR
PCH CUR
HER
SPA FRI
VCA PAL
NAN
Figura. AFC para la diferenciación genética de 19 poblaciones bovinas. GENETIX. Versión 3D.
Resultados
K2
K3
K4
Figuras 16: Indivíduos asignados a grupos geneticos mediante el programa Structure. De K2 a K22.
K18
K19
K17
Resultados
K 20
K 21
K 22
Resultados
Resultados
-74000
-72000
-70000
-68000
-66000
-64000
-62000
-60000
-58000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
k
log
Serie1
Figura 17: Determinación del K óptimo, estimado por la relación entre el logartimo de
probabilidades de asignación de individuos y los diferentes valores de K.
Tanto en la Región Occidental o Chaco como en la Región Oriental del Paraguay, aún se encuentran recursos genéticos animales
locales, criollos o locales, los que deberían ser mejor atendidos, visualizando una
producción de alimentos en áreas “especiales”, de calidad a mediano y largo
plazo
Estudios genéticos en otras especies de animales
domésticos de Paraguay
Buscando Genética local = Adaptación y Rusticidad
CABRAS FINANCIACIÓN DE LA RED CONBIAND Y EL LABORATORIO DE GENETICA
ANIAMAL DE LA UNIVERSIDAD DE CORDOBA, ESPAÑA
Tesis de grado de Juan Manuel Gabaglio, DPA-CIA-FCA
Apoyo
CEMIT – DGICT - UNA
Fundación Carolina, España
Asociación Criadores de Pampa Chaqueño
CONACYT, Paraguay
Ubicación del área de estudio
Ruta transchaco
Puerto Elsa
Gral. Díaz
Monte Lindo
Materiales y Métodos
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de muestras
Animales
Arboles genéticos
Análisis factorial de correspondencia (3D)
Referencia: Mestizo Anglo Nubian Anglo Mestizo Boer Mestizo
OVEJAS
FINANCIACIÓN DE LA RED CONBIAND Y EL LABORATORIO DE GENETICA ANIAMAL DE LA UNIVERSIDAD DE CORDOBA, ESPAÑA
Tesis de grado de Giovanni Ochipinti y Ever Godoy, DPA-CIA-FCA
Apoyo
CEMIT – DGICT - UNA
Fundación Carolina, España
Asociación Criadores de Pampa Chaqueño
CONACYT, Paraguay
0.1
tipotexel
acriollada1
hamp5
43
corridale2
poba
61
polldorset6
doper3
santaines4
54
27
18
Árbol Genético para 7 poblaciones ovinas de
los humedales de Paraguay
Poll dorset
Referencia: Acriollado Santa Inés Población A Dorper
Corridale Hampshire Tipo Texel Poll Dorset
ASNOS
FINANCIACIÓN LABORATORIO DE GENETICA DE LA FACULTAD DE CIENCIA
ANIMAL DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELON, ESPAÑA
Cooperación del Dr. Higinia Carreras, DEAG-MAG
Apoyo
CEMIT – DGICT – UNA
FCA – CIA - UNA
Asnos colectados en Paraguay
Resultados
Figura 2. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual do Pampa
Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 2D.
HER PCH CNE
CERDOS (Inicio en Marzo 2011) COPERACIÓN DEL LABORATORIO DE GENETICA DE LA FACULTAD DE CIENCIA
ANIMAL DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELON, ESPAÑA
Muestras de Tejidos de la oreja de Cerdos
Biotipo: Kure Burro, Kure Bañado, Kure Alzado, Kure Ka’aguy, Kure
Saite, Kure Paraguay, Kure Moro, etc.
Zonas de muestreo: Lugares con “barreras naturales”, esteros,
bañados, pantanos, humedales en generales.
BOVINOS PARAGUAYOS CON CARACTERÍSTICAS CRIOLLAS
Pampa Chaqueño
Región Occidental .
Asociación de Criadores
Resistencia y adaptación
Criollo Pilcomayo:
Chaco (Tte. E. Martínez, Gral. Díaz
y el rió Pilcomayo).
Adaptación campos bajos
Criollo Arroyense:
• Zona de Arroyos y Esteros y 25 Diciembre
• Cruzamiento con Cebuíno
Criollo Ñeembucú:
• Zona pantanosa de los esteros del Ñeembucú
•Capacidad de habitar el humedal “Barrera natural”
OBJETIVOS DEL PROYECTO.
OBJETIVO(S) GENERAL(ES)
-Realizar un primer estudio hacia la caracterización genética de cerdos con características criollas, nativas o locales del Paraguay, mediante el uso de marcadores moleculares SNPs (Polimorfismo de un solo nucleótido).
OBJETIVO(S) ESPECIFICO(S)
-Identificar poblaciones porcinas criollas, nativas o locales del Paraguay
-Mapearlos genéticamente con relación a otras poblaciones porcinas
-Ubicarlos geográficamente en las zonas de colecta de muestras
-Asociar las poblaciones o animales identificadas genéticamente, con aspectos fenotípicos para mejor reconocimiento.
Visión de los animales con genética local, criolla o nativa en el Paraguay
HOY
Visión de los animales con genética local, criolla o nativa en el Paraguay
Selección y Cruzamiento
Posible presencia de genes asociados a caracteres de importancia económica:
Leptina, Miostatina, Calpaina y Calpastatina
Grasa, Ternura, Marmóreo, resistencia de corte de la carne
Entrada en vigencia de Condiciones o Reglamentos internacionales de
protección de ciertos Productos específicos:
Protección a la Denominación de Origen del Producto (DOP)
Productos c/valor agregado de acuerdo Índice Geográfica de Protección (IGP)
Procesos de Certificación de Carnes Ecológicas o NATURALES
Buenas Prácticas Agropecuarias, Bien-estar animal, etc.
Aplicada a la Reproducción Animal Transferencia de Embriones, Inseminación Artificial (..y tambien IATF), Sincronización de Celos, etc.
Aplicada a observaciones Cuantitativas Evaluaciones de CPM = Conformación – Peso - Musculatura Obtención de Diferencias Esperadas entre Progenies = DEP’s
Uso de Marcadores Genéticos (Microsatelites) en la producción y sanidad animal Mejoramiento
Análisis Autores Año Razas Nº SSR
Paternidad y Matriz de
parentesco
LARA et. al 2003 2 Poblaciones de Zebú 12
MARTINEZ A. M. et al 2003 Criolla –Mostrenca/España 12
USHA et al. 1995 Cruzas 5
HEYN et al. 1997 Angus 22
TROMMELN et al. 1993 Holstein
Origen y/o Evolución
MEDJURAC et al. 1994 14 razas europeas 5
MACHUGH 1996 Europeas, Indias y Africanas. 20
QUEVAL et al. 1998 Pblaciones africanas de origen taurino y zebuíno
10
Distanciamiento y
Similitud
SASTRE et al. 2003 3 criollas colombianas 7
BARRERA et al. 2003 Criollas colombianas 12
LARA et al. 2003 2 Poblaciones zebuínas de Brasil 12
MARTINEZ R. D. et al 2003 Criollo argentino 17
MARTINEZ A. M. et al 2003 Criolla -Mostrenca 26
ZAMORANO et al. 1998 Berrenda Negra/España 15
CARVALHO 2000 5 criollas portuguesas 7
Selección MACHADO et al. 2003 Gir, Nelore, Guzerá e Holstein 7
HEYN et al. 1997 Angus 22
Marcadores microsatelites en Estudios Genéticos Animales
Esquemas de selección, apareamiento y cruzamientos en animales. Ejm: Bovinos
Para aumentar endogamia dentro de un rebaño de vientres Nelore
Toros Nelore del racimo central (Ejm: NE 14, NE 04, NE 02, NE 15, etc)
Para explotar vigor hibrido dentro de un rebaño de vientres Nelore
Toros Nelore del racimo central (Ejm: GU 18, GU 15, GU 16, GU 13, etc)
Resultados
Figura 10: Dendrograma de distâncias genéticas individuais entre todos os bovinos Pampa Chaqueño, Crioulo de Ñeembucú e Hereford. Referências:
(95) Pampa Chaqueño (36) Crioulo Ñeembucú (45) Hereford (Paraguay y Mexico)
Resultados
HER PCH CNE
Figura 3. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual dos bovinos, Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 3D.
Selección de reproductores
Referencia: Mestizo Anglo Nubian Anglo Mestizo Boer Mestizo
Selección de reproductores
OTROS USOS PRACTICOS DE MARCADORES EN GANADERIA BOVINA
Programa Estadístico Computacional “STRUCTURE”
1. Identificar animales que pertenezcan a una determinada variedad dentro de una raza sintetica:
Ejm: Braford: ½ (50% de Hereford y 50% Cebu), ¾ (25% Hereford y 75% Cebu), 1/4 (75% Hereford y 25% Cebu), 3/8 (62,5% Hereford y 37,5% Cebu) y 5/8 (37,5% Hereford y 62,5 Cebu). Igual procedimiento para la raza Brangus, salvo excepción del 5/8 Brangus. Con el STRUCTURE
1. Identificar animales que pertenezcan a una determinada generación .En el caso de la raza Braford: Base, Preparatorio, Avanzado y Definitivo, mediante el uso de marcadores microsatélites. Igual procedimiento en la raza Brangus, pero; Preparatorio, Controlado, Avanzado y Definitivo. Con el STRUCTURE
2. Certificación de nivel de pureza para reproductores (machos y hembras) a remate o a feria. STRUCTURE
OTROS USOS PRACTICOS DE MARCADORES EN GANADERIA BOVINA
http://www.simposiorzgpy.org/