USO DE MARCADORES MICROSATELITES EN CARACTERIZACIÓN ZOOGENÉTICA Y SELECCIÓN DE REPRODUCTORES O. Roberto Martínez López, Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas – CEMIT Dirección General de Investigación Científica y Tecnológica – DGICT Universidad Nacional de Asunción – UNA RED CONBIAND - Paraguay
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USO DE MARCADORES MICROSATELITES EN
CARACTERIZACIÓN ZOOGENÉTICA Y SELECCIÓN
DE REPRODUCTORES
O. Roberto Martínez López,
Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas – CEMIT
Dirección General de Investigación Científica y Tecnológica – DGICT
Universidad Nacional de Asunción – UNA
RED CONBIAND - Paraguay
CARACTERIZACIÓN ZOOGENÉTICA
SELECCIÓN DE REPRODUCTORES
MARCADORES MICROSATELITES
Circuito de la información
La historia comienza así: ¿¿¿Son genéticamente iguales...???
Raza Hereford Raza Pampa Chaqueño
¿¿¿Son genéticamente iguales...???
Raza Serpentina
Centro y sur de Portugal
Raza Moxotó
Semi-árido Pernambuco, Brasil
¿¿¿Son genéticamente iguales...???
Raza Nelore Raza Brahman
Como se determina una raza bovina???
Antes y Ahora : Patrón Racial (m)
Ahora y después¿? : Caracterización genética
con marcadores moleculares
¿¿¿Marcadores Moleculares???
Caracterización Animal
Caracterización
Animal
C. Etnozoológica C. Fenotípica
C. Productiva
C. Reproductiva
C. Carcasa
Morfológica y
Zoométrica
C. Genética
Nivel Protéico Marcadores
Moleculares
Microsatélites
Cromosoma Y
C. Geográfica
Fonte: FAO
¿¿¿Qué hacer...???
Marcadores tipo: Microsatelites ?????
SSR fragmentos cortos ADN, 1 a 6 pb, que se repiten en el tándem, de forma aleatoria
en el genoma de los seres vivos
Comparando SSR con otros ventajas:
Alto grado de polimorfismo,
Herencia mendeliana simple,
Co-dominantes
Fáciles de medir y analizar,
Fiabilidad 100%,
Repetitivos y automatizables.
Se encuentran generalmente en regiones no codificadas del genoma y distribuidos
uniformemente
Fonte: Goldstein e Schlotterer, (1999); Prosdocimi, (2001); Graça, (2002).
Marcadores Microsatélites – SSR
- Permite que el ADN de una región seleccionada, sea
amplificada un billón de veces Primers
Con la técnica de la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR),
luego de sus 3 etapas………….
A= ADENINA T = TIMINA C = CITOSINA G = GUANINA
•Donde encontrar un microsatelite?? •En una región polimórfica dentro del genoma POLIMORFISMO: Una variación existente en el genoma, caracteristico en cada individuo, o población, o raza, o especie…
•FELIUS (Cattle breeds of the world, USA, 1985), Cruzas de Criollo con R. Europeas = Criollo-
Hereford / Pampa Características interesantes de productividad en el semi-árido chaqueño
Asociación de Criadores del Pampa Chaqueño = 90’s
Identificación y colecta
Centrales de Pruebas
Formación de rebaños élites
Pruebas de comportamiento reproductores
Multiplicación de vientres
Determinación de Padrón racial
1994 Solicitación de Reconocimiento = Raza Bovina Py
Fuente: ANALES, 2002
Comisión Técnica P. F. da A. R. P. RECHAZÓ
ARGUMENTO: Después de una Inspección Visual (1994):
1 Predominio de genes aportados x R. Británicas Hereford
2 Terneros Bien alimentados = Resurgen las cualidades del Hereford. “O sea, las
cualidades de la raza Hereford se encuentran latentes”
3 Terneros productos PCh. X Cebú y H. x Cebú = Similares
Fuente: Resolución Técnica de la ARP (1994).
¿¿¿Son genéticamente iguales...???
ENTONCES... ¿A qué denominamos raza?
En Paraguay, Como está regido esto ???
Las razas bovinas deben ser fenotipicamente y/o exteriormente diferentes???
En España, Francia, Portugal, Italia, EUA caracterización genética para
diferenciar grupos, además de uma revisión de historia y geografia.
En España es exigencia presentar “Caracterización Genética” para solicitar el
reconocimiento (catalogado) de una raza de un animal doméstico.
Esto es regido por el Comite Español de Razas de Ganado
Analizar las distancias genéticas entre el Pampa Chaqueño, el Criollo
Pilcomayo y razas importadas como la raza inglesa Hereford, por
medio de marcadores microsatélites.
Trabajo-Objetivos
Caracterizar genéticamente los bovinos Pampa Chaqueño y Criollo
Pilcomayo, estudiando su variabilidad genética
BOVINOS
Materias e Métodos
Pampa Chaqueño: 4 Rebaños/95 animales (M/F)
Hereford: 2 criadores/ 30 animales (M/F) y 15 Hereford de Mexico
Criollo Pilcomayo: 1 rebaño/ 36 animales (M/F)
- Obtención de las muestras
-Bovinos colectados en el Paraguay: Material biológico Pelos de la cola
-4 haciendas criadoras de PCH, 1 hacienda de C. Pilcomayo e, 2 de Hereford
-Aproximadamente 50 pelos/animal --Siempre: Pelos con raíces (bulbos)
-Método: Extraídos manualmente (metodología Linkgen, São Paulo)
-Guardados en sobres
debidamente identificados
-Conservadas a temperatura
ambiente hasta su llegada al
laboratório
LAVADO y CENTRIFUGADO
EXTRACCIÓN de ADN
PURIFICACIÓN
Pelo y tejido
DISOLUCIÓN
-Localización Laboratório de Genética Molecular da UCO Córdoba/España
-Extracción ADN Realizada x medio de una Resina comercial (Kit
BLOODCLEAN)
-Metodología BIOTOOLS – Biotechnological & Medical Laboratories
ANÁLISIS DE LABORATORIO
- Permite que el ADN de una región seleccionada, sea
amplificada un billón de veces Primers
ANÁLISES DE LABORATORIO
Eletroforese Géis de policrilamida a 8%.
Seqüenciador automático ABI Prism 377XL
ANÁLISES DE LABORATORIO
Bandas de DNA obtidas nos géis a partir da eletroforese, observados com o programa GENESCAN
Número de Alélos (Genepop® 3.1)
Frecuencias Genotípicas (Genepop® 3.1)
Heterozigosis (Genetix® 4.05.02)
Contenido de Información Polimórfica (Excel® MS Toolkit)
Equilíbrio H-W (Genepop®)
Distancias Genéticas entre Poblaciones (Populations®1.2.28)
Árboles genéticos (Treeview®)
Análisis Multivariado (Genetix® 4.05.02)
Asignación de Indivíduos (Structure® 2.1)
Análisis Estadistico
Resultados
A. Caracterización de los Bovinos Criollos.
Estudio de 3 poblaciones bovinas del Paraguay
Resultados
PCH CNE HER
PCH 0 0.12199 0.140441
CNE 0.12199 0 0.281642
HER 0.140441 0.281642 0
Tabla 7. Distância Genética DA de Nei, entre o Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Ñeembucú (CNE)
e Hereford (HER). POPULATIONS
HER
0.1
PCH
CNE
Figura 4. Distâncias genéticas DA de Nei, obtidas pelo
método de Neigh Joining. TREEVIEW, Radial.
Limousine Charolaise
Resultados
HER PCH CNE
Figura 3. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual dos bovinos, Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 3D.
Resultados
Figura 10: Dendrograma de distâncias genéticas individuais entre todos os bovinos Pampa Chaqueño, Crioulo de Pilcomayo e Hereford. Referências:
Zonas de muestreo: Lugares con “barreras naturales”, esteros,
bañados, pantanos, humedales en generales.
BOVINOS PARAGUAYOS CON CARACTERÍSTICAS CRIOLLAS
Pampa Chaqueño
Región Occidental .
Asociación de Criadores
Resistencia y adaptación
Criollo Pilcomayo:
Chaco (Tte. E. Martínez, Gral. Díaz
y el rió Pilcomayo).
Adaptación campos bajos
Criollo Arroyense:
• Zona de Arroyos y Esteros y 25 Diciembre
• Cruzamiento con Cebuíno
Criollo Ñeembucú:
• Zona pantanosa de los esteros del Ñeembucú
•Capacidad de habitar el humedal “Barrera natural”
OBJETIVOS DEL PROYECTO.
OBJETIVO(S) GENERAL(ES)
-Realizar un primer estudio hacia la caracterización genética de cerdos con características criollas, nativas o locales del Paraguay, mediante el uso de marcadores moleculares SNPs (Polimorfismo de un solo nucleótido).
OBJETIVO(S) ESPECIFICO(S)
-Identificar poblaciones porcinas criollas, nativas o locales del Paraguay
-Mapearlos genéticamente con relación a otras poblaciones porcinas
-Ubicarlos geográficamente en las zonas de colecta de muestras
-Asociar las poblaciones o animales identificadas genéticamente, con aspectos fenotípicos para mejor reconocimiento.
Visión de los animales con genética local, criolla o nativa en el Paraguay
HOY
Visión de los animales con genética local, criolla o nativa en el Paraguay
Selección y Cruzamiento
Posible presencia de genes asociados a caracteres de importancia económica:
Leptina, Miostatina, Calpaina y Calpastatina
Grasa, Ternura, Marmóreo, resistencia de corte de la carne
Entrada en vigencia de Condiciones o Reglamentos internacionales de
protección de ciertos Productos específicos:
Protección a la Denominación de Origen del Producto (DOP)
Productos c/valor agregado de acuerdo Índice Geográfica de Protección (IGP)
Procesos de Certificación de Carnes Ecológicas o NATURALES
Buenas Prácticas Agropecuarias, Bien-estar animal, etc.
Aplicada a la Reproducción Animal Transferencia de Embriones, Inseminación Artificial (..y tambien IATF), Sincronización de Celos, etc.
Aplicada a observaciones Cuantitativas Evaluaciones de CPM = Conformación – Peso - Musculatura Obtención de Diferencias Esperadas entre Progenies = DEP’s
Uso de Marcadores Genéticos (Microsatelites) en la producción y sanidad animal Mejoramiento
Análisis Autores Año Razas Nº SSR
Paternidad y Matriz de
parentesco
LARA et. al 2003 2 Poblaciones de Zebú 12
MARTINEZ A. M. et al 2003 Criolla –Mostrenca/España 12
USHA et al. 1995 Cruzas 5
HEYN et al. 1997 Angus 22
TROMMELN et al. 1993 Holstein
Origen y/o Evolución
MEDJURAC et al. 1994 14 razas europeas 5
MACHUGH 1996 Europeas, Indias y Africanas. 20
QUEVAL et al. 1998 Pblaciones africanas de origen taurino y zebuíno
10
Distanciamiento y
Similitud
SASTRE et al. 2003 3 criollas colombianas 7
BARRERA et al. 2003 Criollas colombianas 12
LARA et al. 2003 2 Poblaciones zebuínas de Brasil 12
MARTINEZ R. D. et al 2003 Criollo argentino 17
MARTINEZ A. M. et al 2003 Criolla -Mostrenca 26
ZAMORANO et al. 1998 Berrenda Negra/España 15
CARVALHO 2000 5 criollas portuguesas 7
Selección MACHADO et al. 2003 Gir, Nelore, Guzerá e Holstein 7
HEYN et al. 1997 Angus 22
Marcadores microsatelites en Estudios Genéticos Animales
Esquemas de selección, apareamiento y cruzamientos en animales. Ejm: Bovinos
Para aumentar endogamia dentro de un rebaño de vientres Nelore
Toros Nelore del racimo central (Ejm: NE 14, NE 04, NE 02, NE 15, etc)
Para explotar vigor hibrido dentro de un rebaño de vientres Nelore
Toros Nelore del racimo central (Ejm: GU 18, GU 15, GU 16, GU 13, etc)
Resultados
Figura 10: Dendrograma de distâncias genéticas individuais entre todos os bovinos Pampa Chaqueño, Crioulo de Ñeembucú e Hereford. Referências:
Figura 3. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual dos bovinos, Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 3D.
1. Identificar animales que pertenezcan a una determinada variedad dentro de una raza sintetica:
Ejm: Braford: ½ (50% de Hereford y 50% Cebu), ¾ (25% Hereford y 75% Cebu), 1/4 (75% Hereford y 25% Cebu), 3/8 (62,5% Hereford y 37,5% Cebu) y 5/8 (37,5% Hereford y 62,5 Cebu). Igual procedimiento para la raza Brangus, salvo excepción del 5/8 Brangus. Con el STRUCTURE
1. Identificar animales que pertenezcan a una determinada generación .En el caso de la raza Braford: Base, Preparatorio, Avanzado y Definitivo, mediante el uso de marcadores microsatélites. Igual procedimiento en la raza Brangus, pero; Preparatorio, Controlado, Avanzado y Definitivo. Con el STRUCTURE
2. Certificación de nivel de pureza para reproductores (machos y hembras) a remate o a feria. STRUCTURE
OTROS USOS PRACTICOS DE MARCADORES EN GANADERIA BOVINA