Disciplina: Métodos de Análise e Purificação de Proteínas
Prof. Dr. Marcos Túlio de Oliveira
Créditos a Ms. Flávia Campos Freitas Vieira e Prof. Pisauro.
Métodos de
Purificação de
Proteínas Nativas
Métodos de Purificação de Proteínas
1. Trabalhando com proteínas;
2. Purificação Proteica;
3. Métodos Cromatográficos;
4. Análise de Proteínas.
Trabalhando com Proteínas
• Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais;
• Separadas de outras de forma pura, para a determinação de suas propriedades;
• Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.
Trabalhando com Proteínas
• SEMPRE! trabalhar com proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!!
• Usar tampão correto (pH, cofatores, estabilizadores, etc.)
Trabalhando com Proteínas
Como purificar uma proteína
Métodos clássicos
Diferença de propriedades das proteínas: carga,
tamanho, ligantes.
Métodos modernos
Clonagem de DNA, sequenciamento
genômico, chips de proteínas, etc.
Trabalhando com Proteínas
• Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso.
• Mais de um método de purificação utilizado.
• Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes.
• Iniciar com métodos de baixo custo.
Estratégia Geral para Obtenção da Proteína
Purificada
• Extração Isolamento
1. Material de Partida ------ Extrato Bruto
2. Desintegração celular
Fracionamento
•Solubilidade
•Tamanho
•Carga
•Afinidade Ligação
Separação
Diálise
Ultra filtração
Coluna Cromatografica
Purificação Proteica: Fonte Proteica
Purificação Proteica: Isolamento
Extrato Bruto
Agitação com pequenas partículas (beads)
Material Duro
French Press
Choque osmótico • Transferência rápida de uma solução isotônica
para uma solução hipotônica. • Devido a osmose as células ficam túrgidas
provocando a lise da membrana.
Ruptura por tratamento químico • Usa-se solvente orgânico ou detergente para
romper diferentes tipos de tecidos, células e organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes e ácidos.
Material Mole
Vamos começar a purificação!
• Centrifugação diferencial é usada para separar organelas, pedaços de membranas e citosol (fração solúvel do citoplasma) do extrato celular.
Centrifugação diferencial
Purificação Proteica: Fracionamento
• Fracionamento Separação das proteínas do extrato em diferentes frações com base no tamanho, carga.
Função do pH, temperatura, concentração de sais e outros fatores.
Diferenças na solubilidade proteica
Purificação Proteica: Fracionamento
• Salting out
• Precipitação proteica com elevada concentração salina.
• ((NH4)2SO4) sulfato de amônio
• A adição de um sal na quantidade correta pode precipitar algumas proteínas e manter outras em solução
Purificação Proteica: Preparação
• Solução proteica passa por modificações para uma purificação eficiente.
• Diálise: separa proteínas de pequenos solutos se aproveitando do maior tamanho das proteínas.
• Ex: Remoção de sulfato de
amônio da amostra.
Métodos Cromatográficos
• Poderoso método de fracionamento.
• Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros.
• Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.
Cromatografia em Coluna
Lehninger, 5ª ed. 2010
Métodos Cromatográficos
Tipos de Cromatografia em Coluna:
o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);
o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;
o Afinidade;
o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).
Cromatografia de troca iônica
• Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado pH.
• Resina: o Trocadora de cátions (grupos aniônicos);
o Trocadora de ânions (grupos catiônicos).
Cromatografia de troca iônica
• Afinidade afetada:
o pH (determina o estado de ionização da molécula);
o concentração dos íons dos sais livres que competem na solução circundante.
Cromatografia de troca catiônica
• Matriz carregada negativamente.
• Proteínas com carga líquida positiva migram mais lentamente.
• Expansão da solução proteica na fase móvel: o separação de proteínas com diferentes
propriedades
o espalhamento difusional.
Lehninger, 5ª ed. 2010
Cromatografia de troca catiônica
• Tamanho da coluna aumenta, a resolução de dois tipos de proteínas com cargas líquidas também aumenta.
• A velocidade da solução proteica diminui com o tamanho da coluna.
• Quanto mais devagar a solução proteica gasta na coluna, a resolução diminui (espalhamento difusional).
Cromatografia de exclusão por tamanho
• Ou gel-filtração.
• Separação por tamanho.
• Fase sólida: grânulos de polímero com ligações cruzadas, com poros de tamanho específico.
• Proteínas grandes saem da coluna antes que as pequenas.
Cromatografia de exclusão por tamanho
• Proteínas grandes não entram nas cavidades e são eluídas mais rapidamente.
• Enquanto proteínas menores percorrem um caminho maior dentro dos poros.
Lehninger, 5ª ed. 2010
Cromatografia de afinidade
• Baseado na afinidade de ligação.
• Resina: ligante (grupo químico covalentemente ligado).
• Proteínas com afinidade se ligam ao ligante.
Lehninger, 5ª ed. 2010
Cromatografia de Afinidade
Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada
Proteínas ligadas podem
ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes
• Formado um complexo entre proteína e ligante.
• As proteínas que não se ligam são lavadas da coluna.
• Proteína de interesse é eluída com uma elevada concentração de sal e do ligante livre.
• O sal interfere nas ligações iônicas que ligam a proteína ao ligante.
• O ligante livre se liga a coluna de afinidade.
Lehninger, 5ª ed. 2010
Cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC)
• Bombas de alta pressão aceleram o movimento de moléculas de proteína através da coluna.
• Reduzindo o tempo de trânsito na coluna, a difusão de bandas é diminuída e a resolução aumentada.
Como analisar o resultado da purificação? (como visualizar proteínas e determinar a
pureza da amostra?)
• Absorbância 280nm
• SDS-PAGE
A280
A280
Eletroforese de Proteínas
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.
• Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.
• Contribui com grande carga negativa. • SDS (sodium dodecyl sulfate) desdobra parcialmente
as proteínas, assumindo forma semelhantes.
Eletroforese de Proteínas
Ação do SDS
SDS-PAGE
Eletroforese de Proteínas
Vantagens
• Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar proteínas.
• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza.
• Permite determinação do ponto
isoelétrico e massa molecular
aproximada.
Eletroforese de Proteínas
• Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular.
• Polipeptídeos menores migram mais rápido.
• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.
• Aproximação da massa
molecular para proteínas
desconhecidas.
Eletroforese Bidimensional
• Combinação sequencial da focalização isoelétrica e SDS-PAGE.
• Separação de mistura complexa proteica.
• Mais sensível que os métodos
isolados.
• Massa molecular e pI.
Resumindo...
• Proteínas são separadas e purificadas com base nas diferenças de suas propriedades.
• Proteínas podem ser seletivamente precipitadas por mudanças no pH ou temperatura e, particularmente, pela adição de certos sais.
• Métodos cromatográficos faz uso de diferenças de tamanho, afinidades de ligação, carga e outras propriedades
• Todos os procedimentos de purificação exigem um método para quantificação ou análise da proteína de interesse na presença de outras proteínas.
Proteina X • Citoplasmática • Peso molecular (616,487 g/mol) • Caráter ácido • Possui calda poli His
Proteina X • Coletar o material • Romper a membrana celular para liberação do
EXTRATO BRUTO • Centrifugar • Descartar as partes que não serão utilizadas e
manter as partes utilizáveis • Utilizar métodos cromatográficos (Ni-Sepharose)
Próxima aula: Métodos de Purificação de Proteínas Recombinantes