Disciplina de Engenharia de Proteínas Curso de Ciências Biológicas 2º Semestre de 2018 Aula 2: Purificação de Proteínas (revisão) e Determinação de Estruturas (difração de raio-X) Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
69
Embed
Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · Trabalhando com Proteínas •Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais. •Separadas
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Determinação da Estrutura Tridimensional de Proteínas por
Difração de Raios-X
Níveis estruturais das proteínas
Fonte: Lehninger, 2010. 5ªed.
Estrutura proteica
• A conformação tridimensional (3D) depende da sequência de aminoácidos
• A função depende da estrutura
• Cada proteína existe em um ou em pequeno número de formas estruturalmente estáveis
• As principais forças para a estabilização de estruturas são forças não-covalentes
Estrutura tridimensional
• Arranjo espacial de todos os átomos de uma proteína conformação
• As conformações possíveis de uma proteína incluem qualquer estado estrutural que ela possa assumir sem a quebra das ligações covalentes.
• Porém, poucas são as conformações nativas.
• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)
Determinação da estrutura
tridimensional proteica
• O primeiro passo para o estudo sobre as propriedades de um composto orgânico é a determinação de suas estruturas cristalinas.
• Diversas propriedades estão intimamente ligadas à maneira como os átomos estão dispostos pela molécula.
Mas...o que são cristais?
• Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja estrutura se repete numa forma periódica tridimensional.
• Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e vice-versa.
Sólidos cristalinos
• Formas regulares e simétricas assim como a ordenação das partículas que os formam.
Como observar os cristais?
• O estudo da estrutura cristalina não é possível através da microscopia óptica.
• Os microscópios ópticos possuem uma limitação
física, ditada pelo comprimento de onda da luz visível.
Como observar os cristais?
• Para resolver objetos tão pequenos quanto proteínas, precisamos usar raios X, que possuem comprimentos de onda na faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).
Cristalografia de raios-x
• Uma das técnicas mais conhecidas para a determinação dos padrões de uma estrutura é cristalografia por difração de raios-X.
• O primeiro passo é obter proteína com alto grau de pureza!!!
• Segundo, obter cristais!!!
Cristalografia de raios-x
Cristalografia de raios-x
• Raio X incide no cristal, onde parte de sua energia é absorvida e reemitida em todas as direções (cada átomo se torna uma fonte secundária de raios X);
Padrão de difração dos raios x
Fonte: Paula Kuser Falcão.
Cristalografia de raios-x
• Não há lentes que reagrupem os raios X para formar a imagem.
• Ao invés disso, o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente e a imagem é reconstruída por técnicas matemáticas.
Cristalografia de raios-x
• A difração de raios-X aplicada à análise de cristais de macromoléculas biológicas tem influenciado a bioquímica estrutural, tendo contribuído para o conhecimento da estrutura 3D de proteínas, ácidos nucleicos, vírus e outras macromoléculas.
Padrão de difração dos raios x
Cristalografia de raios-x
• A quantidade de informação obtida em uma cristalografia por raios X depende do grau de organização estrutural da amostra.
• Informações da estrutura 3D detalhadas precisam de cristais proteicos altamente ordenados.
• Dificuldade em cristalizar várias proteínas.
Cristalografia de raios-x
• O ambiente físico em um cristal não é idêntico ao em solução ou na célula viva.
• Poucas informações são fornecidas em termos de movimentos moleculares no interior da proteína.
A partir da cristalografia de raios-x, é
possível...
• Compreender melhor os princípios básicos da arquitetura proteica;
• Estudar em nível atômico os centros catalíticos de enzimas;
• Compreender a especificidade das reações que as enzimas catalisam;
• Compreender a relação existente entre sequencia primária, estrutura e função.
ESQUEMA DA DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS