PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO
M. Pía CerdeirasCATEDRA DE MICROBIOLOGÍA
FACULTAD DE QUIMICA
Requisitos para el desarrollo de un ACB• Selección de un agente superior.• Producción abundante y a un costo adecuado de
propágulos. • Formulación adecuada.• Vida útil del producto final adecuada, preferiblemente sin
refrigeración.• Eficacia alta y estable en condiciones de uso a través de un
sistema de aplicación adecuado.• Registro/aprobación.
• Patente
Producción de ACBs
• Fermentación sumergida (sustrato líquido) (FSL)
• Fermentación sobre sustrato sólido (FSS).
Crecimiento
Crecimiento implica un aumento ordenado de todos los componentes de un organismo y
no solamente de alguno de ellos.
En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el número de
células más que un aumento en el tamaño celular
Crecimiento en cultivo en lote (batch)Luego de la adición de m.o. al medio líquido fresco se observa la
siguiente cinética de crecimiento
• Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen • Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo
condiciones particulares, tiempo de generación mínimo • Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0 ó estadísticamente = 0
cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte) – nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad– acumulación de desechos, inhibición del crecimiento
• Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de división celular
Fermentación sobre sustrato sólido
Existe falta de conocimiento en cuanto a patrones y cinética de crecimiento en FSS
• La disposición 3-D del micelio y del sustrato.
• La heterogeneidad del sustrato en sí.• La dificultad de obtener medidas directas de
la biomasa microbiana formada.
Evaluación del crecimiento
1- Determinación del número de microorganismos
• Métodos directos: recuento total
• Métodos indirectos: recuento de viables
2- Determinación de la masa celular
• Métodos directos–Medida de la masa–Medida del volumen
• Métodos indirectos–Determinación del contenido de N, C, P, etc–Turbidimetría
3- Determinación de la actividad celular
–Actividad enzimática–Concentración de un metabolito–Medida de la respiración
Diferencias entre FSS y FSL
• Algunos hongos filamentosos no pueden ser crecidos en FSL.
• Algunos hongos sólo esporulan en FSS.
• Los sistemas de fermentación a nivel industrial están más desarrollados para la FSL.
• Los sistemas de FSL son más fáciles de controlar (temp., pH., etc.).
El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo• Relación C/N • Actividad de agua• Sistema de cultivo (FSL oFSS)• Momento de la cosecha• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo• Relación C/N • Actividad de agua• Sistema de cultivo (FSL oFSS)• Momento de la cosecha• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
Influencia del medio de cultivo sobre la eficiencia de las ascosporas de Talaromyces flavus contra
marchitamiento a VerticiliumSpores producedper petri dish2 x 1010
4 x 1010
8 x 109
El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo• Relación C/N • Actividad de agua• Sistema de cultivo (FSL oFSS)• Momento de la cosecha• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
Relación C/N del medio de cultivo afecta la morfología de los conidios de Colletotrichum
truncatum
10:1 30:1 80:1
Relación C/N del medio de cultivo afecta la calidad de los conidios de Colletotrichum
truncatum
Relación C/NParámetro de calidad
BajobajoaltoContenido de proteínas
bajobajoAltoFormación de apresorios
lentalentarápidaVelocidad de germinación
++++Producción de conidios
1:801:301:10
El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo• Relación C/N • Actividad de agua• Sistema de cultivo (FSL oFSS)• Momento de la cosecha• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
Efecto del potencial de agua (WP) sobre la cantidad y calidad de conidios de
Trichoderma harzianum
Medio WP Biomasa Log conidia Germinación Mpa g/l por g (%)
RM8+0% glicerol -0.8 358 A 10.72 A 4.0 A
RM8+3% glicerol -2.0 492 D 10.75 A 15.3 B
RM8+6% glicerol -2.8 447 C 10.86 B 35.9 C
RM8+9% glicerol -3.7 444 C 11.04 C 67.3 D
RM8+12% glicerol -4.8 400 B 10.76 A 37.0 D
El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo• Relación C/N • Actividad de agua• Sistema de cultivo (FSL oFSS)• Momento de la cosecha• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
Influencia del sistema de cultivo sobre la producción de conidios de Trichoderma
harzianumSistema de cultivo
Parámetro Sólido Líquido
Producción (log esporas/ml) 10.0 8.0
Tiempo de incubación (h) 76.0 48.0
Productividad (log esporas/ml/h) 8.1 6.3
Propiedades de esporas de Trichoderma harzianumproducidas por FSS y FSL
Esporas producidas porPropiedad FSS FSL
Resistencia a UV (LD50, min.)
4.0 2.4
Vida util (% ufc luego de 45 días a 25°C)
100.0 15.0
Hidrofobicidad ++ -Grosor de pared (nm) W2 W1 Total
119.0116.0235.0
30.0150.0180.0
El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB
• Medio de cultivo• Relación C/N • Actividad de agua• Sistema de cultivo (FSL oFSS)• Momento de la cosecha• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc
Efecto del momento de la cosecha sobre la viabilidad de clamidosporas de Gliocladium
virens
25°C4°C
88981.25 x 10816082981.2 x 10813573861.2 x 10812062781.0 x 10811329596.1 x 1079117415.2 x 1078712192.5 x 1066400043
Viabilidad luego de 300 días Productividad UFC ml –1
Cosecha (h)
Eyal et al., 1997
El método de producción puede afectar la morfología, cantidad y calidad de los
elemento de propagación
• Grosor de la pared de los conidios • Tipo y tamaño de los conidios• Velocidad de germinación• Hidrofobicidad• Vida útil• Productividad• Resistencia al UV• Eficiencia como biocontrolador
Formulación
La mezcla de ingredientes y la forma de preparar un principio activo para su empaque, almacenamiento y expedición al lugar de uso.
Cuatro funciones básicas de la formulación:
• Estabilizar el principio activo.
• Ayudar en su manejo y aplicación.
• Protegerlo de factores ambientales adversos en el sitio de acción, y por lo tanto aumentar su persistencia.
• Aumentar su actividad en el sitio de acción, ya sea por aumento real de la actividad, y/o por aumento de la reproducción, contacto o interacción con el patógeno diana.
Problemas hallados durante la formulación de ACBs.
Cosecha
Estabilización
Almacenamiento
Aplicación
Post-aplicación
Tipos de formulaciones
Productos secos
Polvos, gránulosPerlas de alginato, capsulasPolvos mojables
Productos líquidosSuspensiones acuosas u oleosasEmulsiones w/o o o/w
Aditivos (excipientes)
• Carriers• Binders• Adherentes• Surfactantes• Emulsificantes• Humectantes• Desecantes• Protectores solares
Supervivencia de Pseudomonas fluorescens en diferentes carrier a 25°C
Número de P. flourescens (10x UFC/g)a distintos días de almacenamiento
Carrier 0 30 60
Turba 6.6 a 5.2 a 4.4 aTalco 6.8 a 3.7 c 2.9 bLignita 6.4 a 4.9 b 2.7 b
(Rabidran & Vidhyasekaran, 1996)
Supervivencia de IK726 con y sin agregado de desecante
0 10 20 30 40 50 600123456789
Sphagnum-bran, 4°C
Sphagnum-bran + Si, 4°CSphagnum-bran, 20°C
Sphagnum-bran + Si, 20°C
Weeks
log
cfu/
g in
ocul
um