REACTIA DE AGLUTINARE
Aglutinarea este un test serologic care se bazeaza pe mecanismul de
legare a Ac la un Ag particulat
rezultand un conglomerat vizibil cu ochiul liber
(aglutinat)
REACTIA DE AGLUTINARE
calitativa/semicantitativa > titrare: indicii despre concentratia relativa a Ag/Ac in proba
se desfasoara in 2 etape:
a) combinarea specifica a Ac cu Ag
pe suprafata celule /particule
b) formarea agregatelor vizibile aleAg
particulat
se utilizeaza in urmatoarele scopuri:
a) dg serologic al bolilor infectioase
b) detectarea Ac specifici tisulari in
bolile autoimune
c) detectarea prezentei DAg pe celule
d) tipizarea sangelui in vederea
transfuziei
COMPONENTELE ESENTIALE ALE
TESTELOR SEROLOGICE
ANTIGENELE(Ag)
ANTICORPI(Ac)
Ag si Ac IN REACTIA DE
AGLUTINARE IMUNA Ag sunt: particulate Cunoscute (laborator) in cantitate constanta
Ac sunt (aglutinine): participa la reactie > dilutii
seriate ale serului (bv) au capacitate de aglutinare
diferita (~ izotipuri)ex. Ig M dpdv functional sunt decavalente
teoretic si pentavalente practic
TITRUL
TITRUL aglutinant al serului = inversul celei mai mari dilutii care produce o aglutinare acceptabila
ex: daca dilutia de 1/512 a serului produce o
aglutinare evidenta,
>la dilutia imediat urmatoare (1/1024) aglutinarea
= absenta,
>titrul aglutinant este de 512 U, =
serul imun contine 512 unitati aglutinante.
Titrul aglutinant- exprima in:
nr de unitati aglutinante de Ac/unitata de volum.
FORMAREA COMPLEXELOR IMUNE
Dimensiunea unui CI depinde de:
valenta Ag
concentratia Ac.
Ac in exces > epitopii Ag se satureaza >>
CI de dimensiuni mici
Ag, Ac:concentratii echivalente: o retea extinsa de CI
Ag in exces > situsurile de combinare ale Ac se satureaza >
CI de dimensiuni mici
FACTORI CARE INFLUENTEAZA REACTIA DE AGLUTINARE
densitatea si dispozitia spatiala a D Ag de pe suprafata celulelor / particulelor
potentialul electric al reactantilor > variatiile de pH prezenta electrolitilor in mediul de suspensie ( la conc
fiziologica de NaCl) variatiile de temperatura durata incubatiei:
*pt aglutinarea bacteriana incubatia este de 1-2 ore la 37ºC;
Citirea finala a rezultatelor se face dupa 24 ore la temp camerei
REACTIA DE AGLUTINARE
Principiul reactiei
Ag particulat + Ac >> aglutinare
Formarea aglutinatului:
Ag se leaga la Fab a 2 Ac >>
punti intre Ag
Tipuri majore de aglutinare:
Aglutinarea bacteriana
Hemaglutinarea:
Imuna
Pasiva
virala
REACTIA DE AGLUTINARE METODOLOGIE
Ag particulat (vol. Cunoscut; orig-lab) (Ac?) Ser pacient (vol fix in dilutii seriate (scala geom= 2).
omogenizare reactanti > incubare ~2h.
Aglutinarea este vizibila cu ochiul liber = Ac sun prezenti in
serul bv=Dg+
!* La dilutii mari ale serului nu mai obtinem aglutinarea = Ag particulat
ramane in suspensie.
REACTIA DE AGLUTINAREAPLICATII
AGLUTINAREA BACTERIANA se foloseste in laborator pt a stabili titrul de Ac serici in bolile infectioase
EX: tifos exantematic, infectii cu Brucella,enterobacterii- Salmonella exista 2 forme:
a) aglutinare de tip H (hauch = val): produsa de o suspensie de celule bacteriene
flagelate in cursul careia se formeaza flocoane bacteriene mari si laxe;
*Ag flagelare aglutineaza (flagelilor bacterieni) interactioneaza cu Ac specifici
b) aglutinarea de tip O sau somatica (ohne hauch = fara val): produsa de bacteriile
imobile; se formeaza conglomerate celulare dense, compacte, in care
celulele bacteriene reactioneaza prin intermediul Ag somatice reprezentate
de LPS (lipopolizaharide =componente majore ale suprafetei celulelor Gram
-).
* Ag somatice interactioneaza cu Ac specifici serici.
AGLUTINAREA BACTERIANATESTUL WIDAL
Utilizare: Dg serologic al infectiilor cu Salmonella Typhi
Georges-Fernand-Isidor Widal si Sicard in 1896 au descris Reactia Widal
Acest test si-a dovedit valoarea de dg in cazurile in care nu se puteau obtine cultivarea celulelor
TESTUL WIDAL
Utilizare: dg febrei tifoide
Principiul testului Widal:
Ac (ser bv) reactioneaza cu
Ag (pe suport solid-lab)>aglutinare vizibila
TESTUL WIDAL
poate fi facut
in tub:dilutii seriate >
titrulpe lama: calitativa
DG SEROLOGIC AL INFECTIILOR CU SALMONELLA
serotipizare
identificarea tipurilor
serologice de Salmonella
utilizandu-se seruri
imune cu specificitate
cunoscuta prin reactia
de aglutinare in tub sau
pe lama
serodiagnostic
al febrelor tifoide/paratifoide
cu un set de Ag
standardizate:
Reactia de aglutinare =
T Widal in tuburi
SERODIAGNOSTIC: REACTIA DE AGLUTINARE
(T WIDAL) Materiale necesare:
1) Ag standardizate O, H:
suspensie celulara alcoolata
O ( 500 mil cel/ml)si
suspensie celulara formolata
pt H (500 mil/ml)
2) Dilutii seriate ale serurilor de
la bolnavi
Evidentiaza
Ac anti-H care sunt puternic
stimulati
1) prin vaccinare specifica
2) dupa infectie cu tulpini
flagelate
* suspensiile antigenice Vi
sunt alcoolate
AGLUTINAREA-CUM APARE DUPA REACTIE
Aglutinarea O este granulara Aglutinarea H este slaba si floculara
Citirea si interpretarea rezultatelor
Aglutininele anti-H si anti-O apar in ser in prima saptamana de boala;
titrul lor creste pana la maxim in zilele 16-29 de la debut si ramane ridicat in convalescenta si o scurta perioada dupa vindeare.
Aglutininele anti-H au un titru inalt ( 1/1000-1/5000) iar aglutininele anti-O : 1/250-1/1000.
reactie pozitiva: >1/500 pt aglutininele anti-O > 1/1000 pt aglutininele H.
AGLUTINAREA-REMEMBER
este o reactie Ag-Ac
Ac specifici din ser aglutineaza bacteria at c sunt prezenti Ag correspunzatori
Rezultatul este observabil ca o solutie particulata/ conglomerate vizibile
Gradata dupa intensitate ca fiind 1+, 2+, 3+, si 4+
4+ reprezinta un background clar cu o aglutinare de 100%
aglutinarea O este granulara
aglutinarea H este slaba si floculara
PROBLEME CU TESTUL WIDAL
detecteaza doar
Ac aglutinanti posibile aglutinari
nespecifice
Rezultatele aglutinarii:
Titrurile > 1:100= Ac+ pt Ag somatice si flagelare
Titrurile > 1:40= Ac + pt Ag Vi
*Titrurile pozitive variaza de la un laborator la altul!
CAUZE DE REZULTAT FALS-NEGATIV IN T. WIDAL
Ag bacteriene nu sunt expuse la suprafata si nu sunt accesibile reactiei cu Ac <Ag capsulare: mascheaza Ag O: se utilizeaza un preparat Ag bacterian supus in prealabil tratamentului termic pt a expune Ag O al suprafetei celulare.
Statusul de purtator : o inoculare inadecvata de Ag bacterian care la
nivelul gazdei nu reuseste sa induca producerea de Ac.
Dificultati tehnice /erori de procedura.
Tt anterioare cu ATB.
Variatii in prepararea kiturilor comerciale
HEMAGLUTINAREA
REACTIILE DE HEMAGLUTINARE UTILIZEAZA HEMATIILE CA:
Celule indicator
Ag
APLICATII:Tipizarea sangelui (hemaglutinare directa)Diagnosticul unor anumite boli (hemaglutinare pasiva)Identificatrea unor virusuri (hemaglutinarea virala )
HEMAGLUTINAREA DIRECTAPRINCIPII IMMUNOLOGICE
Componentele immunologice principale:
Ag (de pe RBC) & Ac
APLICATIE PRINCIPALA:
TIPIZAREA GRUPELOR DE SANGE
REGULA DE AUR:
Ag sunt pe suprafata RBC
Ac sunt in ser
SISTEMUL ABO AL GRUPELOR SANGVINE
Exprimat in → tesuturi & fluidele organismului inclusiv pe RBC, plachete & celule endoteliale
3 Ag: A, B, H
2 Ac: anti-A and anti-B
4 fenotipuri: A, B, AB, O →
A & B: transmitere fenotipica autozomal co-dominanta (exprimata pe group A / B / AB de pe RBC);
CLASIFICAREA Ac DE GRUP SANGVIN
Alloanticorpi:
•Reactioneaza cu Ag straine care nu sunt prezente pe propriile RBC
•Sunt produse ca rezultat al stimularii imune via transfuzii/sarcina
Autoanticorpii:
Reactioneaza cu Ag de pe propriile RBC/ acelasi Ag de pe celulele altui individ
REACTIVITATEA INCRUCISATA
Ac > reactie incrucisata cu Ag nespecific in cazul in care Ag impartasesc un epitop similar/ identic
TESTAREA GRUPELOR SANGVINE
DIRECT / FORWARD TYPING
BETH-VINCENT TESTTestare pt Ag
RBC pacient = Ag ? necunoscute
seruri (Ac) cunoscuti
METODA: pe lama/in tub
INDIRECT/REVERSE TYPING (SIMONIN TEST)
Testare pt Ac
Ag cunoscut (celula)
Ac ? necunoscut (serul pacientului)serul este combinat cu celule cu Ag cunoscut intr-o
proportie de 2:1
METODA: pe lama/in tub
Grup O, Rh+Fara aglutinare cu serul anti-A si anti-BDa aglutinare cu serul anti Rh
Grup B, Rh-Fara aglutinare cu serul anti-A si anti-RhDa aglutinare cu serul anti-B
SISTEMUL DE GROUP SANGVIN RhCLASIFICARE/NOMENCLATURA
WienerIPOTEZA ALELELOR MULTIPLE5 Ag: Rho, rh’, rh”, hr’, hr”RosenfeldSistem NumericRh1 - Rh5Fischer & Race3 allele: D/d, C/c and E/e5 Ag: D, C, E, c, ed → fara locus D → fara produsi antigenici
Antigenele Rh
Sistem complex reprezentat de cateva subunitati Ag : A, B, C, D, E.
Contine 3 proteine membranare integraleRhD/Rho ( important)RhCcEeRh> Asociate cu GP:(Rh50, RhAg)
Antigenul D → consta intr-o proteina: RhD→cel mai immunogenic > urmat de c, E, C e
TESTARE Rh
Testarea pt Ag Rho (D) :
Folosim ser uman
RBC (Ag=parte integrala din membrana, mult mai putin numeroase decat Ag ABO)
Mediu de reactie (proteine)
Rh-varianta Du
Weak D Antigen (Du)Varianta Rho >Aglutinare slaba/absenta a RBC cu serul anti-D → poate fi detectat doar cu reactivul anti-globulina umana (R Coombs) (anti-D bovin) Varianta slaba este produsa in 3 situatii:
Lipseste o parte din Ag DGena D este translocata pe cromozomul opus genei C → (+) impiedicare stericaMostenirea unei gene ce codifica mai putin Ag D
HEMAGLUTINAREA PASIVA
OBIECTIVE:detectarea titrurilor scazute de Ac serici (ex Rh Du)
PRICIPIU:Ac (bv ser) reactioneaza cu Ag adsorbit pe RBC > hemaglutinatinare
*(RBC = pasive, nu participa to reactie)
COMPONENTE:
Suport solid pt Ag solubil (cunoscut)RBC = celule indicator
Particule de latexCarbuneBentonita
Serul > Ac necunoscut
HEMAGLUTINAREA PASIVAAPPLICATII:
TESTUL ANTIGLOBULINIC
TESTUL ANTIGLOBULINIC
TESTUL ANTI-HUMAN GLOBULIN (AHG),
TEST COOMBS
UTILIZARI:Detectarea Ac (IgG) anti-eritrocitari cu specificitate pt sistemul
ABO/Rh
PRINCIPIUL TESTULUI ANTIGLOBULINIC
Metoda:1) RBC > sensibilizate prin acoperirea cu IgG / complement >Nu vor aglutina direct cand sunt centrifugate. Pt a obtine aglutinarea: 2) + alt Ac > reactioneaza cu RBC prin Fc (IgG) sau C3b/C3d 3) > "punte" intre : Ac /C' adaugat si IgG de pe RBC > aglutinare.
RBC acop cu IgG RBC acop cu Complement
PRINCIPIUL TESTULUI ANTIGLOBULINIC(II)
Avem nevoie de:
Reactiv anti-globulinic (Reactiv Coombs ) care se va lega deFc (IgG )atasata la RBCC3b/C3d atasata la RBC.
Pt a obtine reactivul anti-globulinic (Coombs): Iepuri > immunizati cu gamma globulina umane produc Ac (reactiv AHG ) fata de IgG / C3d.
TIPURI DE TESTE ANTIGLOBULINICE
Prima data Coombs si Mourant au detectat acesti Ac in vitro (prin Testul Antiglobulinic Indirect) in special cei legati de sistemul Rh, care pot produce boala hemolitica a nou-nascutului.Exista doua tipuri de teste antiglobulinice:
1. Direct Antiglobulin Test (DAT) – detecteaza in vivo Ac /C3 de pe RBC
2. Indirect Antiglobulin Test (IAT) – utilizeaza o etapa suplimentara de incubatie la 37oC > detecteaza Ac serici care pot reactiona cu Ag de pe celule in vitro.
Dupa spalarea RBC, reactivul Coombs este utilizat pt detectarea Ac de pe RBC
TIPURI SPECIFICEDE REACTIVI AHG (COOMBS)
Ser , polispecific (policlonal) anti-human:
amestec de Anti-IgG & Anti-C3b, -C3dReactivi monospecifici (monoclonali)
Anti-IgG / Anti-C3b,-C3d
*Nota:
*Reactivii nu contin Ac IgM. Prezenta Ac IgM pe RBC este evidentiata de C3 (IgM = puternic activator al C').
REACTIVIReactivul Anti-Human globulin (AHG or Coombs)
Pot fi obtinuti prin:
injectarea iepurilor cu IgG / C3 uman purificat > recoltarea Ac produsi de iepuri >
ser poli/monospecific
tehnologia Ac monoclonali > ser monospecific
TEHNOLOGIA AC MONOCLONALI
SUMARUL REACTIEI
RBC acoperite cu Ac* IgG si/sau C' (in vivo/in vitro-prin incubare cu seruri lab)
RBC > spalate 3-4X pt indepartarea Ac/C' liberi/nelegati
Ramane doar Ac/C' atasat la RBCAd R. AHG (Coombs)Ac din R. Coombs reactioneaza cu IgG/ C3b/C3d din
C' de pe RBC, > aglutinareaDaca NU aglutinare > verificam prin add Coombs
control reagent cells* (CCC).*joaca rol de Ag
TESTAREA ANTIGLOBULINICA INDIRECTA
Este utilizata in mod frecvent pt detectarea:
1) Du slab la donatorii de sange si la femeile insarcinate cu D(-) la R.T. la tipizarea ABO si Rh.
2) Prezenta sau absenta Ag din sistemele minore de grupe sangvine ( Kell, Kidd, si Duffy).
3) Ac neasteptati, semnificativi clinic descoperiti in teste screening.
TESTAREA ANTIGLOBULINICA INDIRECTA
SCOP:
detectarea in vitro a sensibilizarii RBC .
Se face at c sensibilizarea nu duce direct la aglutinare <
-sunt prea putine Ag pe RBC,
-sunt prea putini Ac in ser si/sau sunt IgG .
TESTAREA ANTIGLOBULINICA INDIRECTA
PRINCIPIU
Incubarea RBC cu serul bv la 37oC x 15 -30 min.
Spalari RBC 3-4x .
Add R. AHG (Coombs) > centrifugare > citirea aglutinarii
Daca test - >
add Coombs Control Check Cells pt verificarea rezultatelor fals-negative
INTERPRETATION OF ANTIGLOBULIN TESTS
At ca RBC sunt acoperite (sensibilizate) in vivo/in vitro >interpretarea finala se bazeaza pe prezenta/nu a hemaglutinarii
1) Positive Antiglobulin Test
Wash cells three tim es to rem ove
unbound antibody
Only antibody attached to the cells
rem ain
A d d A n ti-H u m a n G lo b u lin
Visible Agglutination in the test tube:
Grade the reaction strength
NEGATIVE ANTIGLOBULIN TESTAntibodies are not
attached to the antigens during
incubation.
Wash the cells 3 times to remove any
unattached antibodies.
Ad d An ti-h u m an g lo b u lin
No visible agglutination and therefore a negative
test
Add Coombs Control Check Cells
DAT POZITIV
Dg: anemia hemolitica autoimuna (dem prezenta AAc anti RBC)
Boala hemolitica a nou-nascutului (dem prezenta Ac anti Rh/anti ABO)
Transfuzii recente (RBC/plasma/masa tr)
MedicatieCautam alte date de lab care indica o distructie
RBC: Ht, bilirubina, LDH)
CAUZE CLINICE DE DAT POSITIV
Sensibilizarea hematiilor datorata medicamentelor:
– penicilina si cephalosporinele pot induce acoperirea nespecifica a RBC
– tetraciclinele, antihistaminele si sulfonamidele pot determina aparitia unor CI capabile sa activeze C'3
– ibuprofen, levodopa si methyldopa pot produce reactii autoimune.
*Daca pacientul are un DAT+ > trebuie luate in considerare reactii induse de medicamente
THE END
IMPORTANTA T WIDAL
A scazut datorita:
Incidenta febrei tifoide a scazut A crescut utilizarea vaccinarii in masa
TESTAREA PURTATORILOR DE TIFOS
Cei mai multi purtatori de bacili tifoizi au Ac anti-Vi Ag (Salmonella T)
Titrurile de Ac anti-Vi par sa se coreleze mai bine cu starea de purtator decat cele de Ac anti-O/ H>
> utilizarea aglutinarii anti-Vi (R Felix)
REACTIA WEIL-FELIX
In 1915, Weil si Felix au aratat ca in serul pacientilor infectati cu oricare membru al grupului de Salmonella typhi contine aglutinine pentru 1/mai multe linii de Proteus OX.
In cazul febrei tifoide reactia apare in <6zile si se obtine max< 2 sapt.
T. Weil-Felix se bazeaza pe cross-reactivitatea cu Ag OX-19 and OX-2 ale P. vulgaris si OXk de P mirabilis, in care,
in serul pacientilor este cautat Ac anti-OAg
INTERPRETAREA T. WEIL-FELIX
Serul < bv tifos endemic aglutineaza Ag OX19, OX2. Ag< scoamele de tifos aglutineaza liniile Oxk. Testul este negativ in eruptia rickettsiala si in febra Q.R fals- pozitive pot aparea si in infectii urinare cu Proteus
TESTUL FELIX-WEIL
este indicat atunci cand avem un pacient cu o eruptie dg tifos, anumite boli ricketsiale Bv suspectat de ricketsia> testat anti- (OX-2, OX-19, OX-K).
SERO CONVERSIA
Reprezinta dezvoltarea in ser, ca rezultat al unei infectii sau a unei imunizari, a unui titru detectabil de Ac specifici fata de microorganisme
SERO REVERSIA
Sero reversia este opusul seroconversiei Apare atunci cand testele serologice nu mai pot detecta prezenta unor Ac/Ag in serul unui pacient
TESTAREA IN PERECHE
Testarea pentru bolile infectioase > in pereche:
in faza acuta,in faza convalescenta
(~ la 2 sapt)
Clinic semnificativ: Crestere de 4x a titrului Reactie + in 2 tuburi aglutinare
Ag SOMATIC (O) localizare: perete celular > prezinta variatii
de ordin chimic.
Toate liniile de Salmonella cu
> Ag O comun = un grup serologic.
Genul Salmonella > 47 de grupe serologice
(noteaza cu majuscule de la A.....Z iar
ultimile 15 grupe cu numere 51-56)
AgO> Corespunde endotoxinei,
Ag O - clasificare
Ag majore:
> specificitatea de
grup
Ag minore:
=modif chim minore
ale Ag majore
Ag SOMATIC (O)
SomaticStabil termic Produce o aglutinare granulara > in varianta smooth (S) sau rough (R) Unele dintre acestea pot fi supuse la conversie lysogenica de catre bacteriophagi
Ag FLAGELAR (H)
Stabile termicApar in flageli Compuse din flageline (proteine) Aglutinarea este rapida, slaba si flocularaPot aparea variatii de faza reversibila
se gaseste numai la formele mobile
imprima specificitatea de de tip antigenic (aprox 2000
de variante Ag H = serotipuri)
Ag DE INVELIS(Vi=K)
= de suprafata,
situat > perete (K=Kapsel= capsula) actioneaza ca factor de virulenta structura G-L-P tulpinile bact care au Ag Vi vor fi aglutinate
numai de Ac anti-V Ag Vi se gaseste la putine serotipuri de
Salmonella, > rezistenta la fagocitoza
* chiar daca se afla in cantitate prea mica pt a
forma o structura capsulara vizibila, este suficient
pt a masca Ag O > inhiba aglutinarea celulelor
respective in prezenta serului specific anti-O.
TESTUL STANDARD AGLUTINARE PT Ac SERICI ANTI- S. Tpyhi, S.
Paratyphi
Pentru suspensiile de Ag O & Vi :
Incubare la 37ºC x 2 h Frigider o.n. la 4ºC Incubare la R.T. x2 h
inainte de citire
Pentru suspensiile de H
Incubare la 56ºC x 2 h
REACTIA DE AGLUTINAREUTILIZARI
se utilizeaza in urmatoarele scopuri:
a) dg serologic al bolilor infectioase
b) detectarea Ac specifici tisulari in
bolile autoimune
c) detectarea prezentei epitopilor
antigenici de pe celule
d) tipizarea sangelui in vederea
transfuziei
Variante :
pe lama
in tub
pe microplaci speciale