UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
Ing. Receanu Cristina Monica
Cercetări privind utilizarea anticorpilor monoclonali şi policlonali în
evidenŃierea celulelor stem umane neuronale în creierul fetal ovin
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCĂTOR ŞTIINłIFIC
Prof. Dr. Ing. Vlaic Augustin
Cluj-Napoca
2010
INTRODUCERE
Pentru prima data celulele stem au fost izolate din masa celulară internă a
blastocistului şi crescute in vitro . Variante ale acestor tehnici de obŃinere şi cultivare sunt
utilizate şi astăzi în laboratoarele din întreaga lume.
Cele mai importante publicaŃii legate de celulele stem au fost centralizate în anii 2001
şi 2002 de către R. Edwards.
Creşterea embrionului preimplantaŃional in vitro a constituit tema de cercetare a
multor echipe, pioneratul realizându-l Heope în 1980, care a obŃinut produşi de la iepuroaică,
după transferul embrionar la receptoare. (Gottlieb, D.I. and Huettner, J.E., 1999).
Primele cercetări privind cultivarea in vitro a celulelor stem (fig. 1) au fost realizate în
1963, de către J. Paul şi E. Edwards, care au pregătit pentru cultivare un grup de celule din
embrion de iepure preimplantaŃional, în picături de NCTC 109, 199, F10. (Theise, N.D.,
2000).
O celulă stem deŃine două proprietăŃi principale: capacitate de autoreînnoire pe termen
lung fără senescenŃă şi pluripotenŃă şi abilitatea de a se diferenŃia în una sau mai multe tipuri
de celule specializate. Aceste celule pot furniza o sursă inepuizabilă de celule pentru
transplant. Celulele stem totipotente care au abilitatea de a genera toate tipurile de Ńesut joacă
un rol critic în dezvoltarea umană, furnizând materialul pentru dezvoltarea tuturor Ńesuturilor
şi organelor în embrion şi în toate Ńesuturile extra embrionare.
Celulele stem specifice Ńesutului sunt de asemenea depozitate în diferite nişe din corp,
precum măduva osoasă, creier, ficat şi piele, ca un mecanism pentru menŃinerea Ńesutului,
creşterea acestuia şi reînnoirea la maturitate. La început s-a crezut că aceste celule stem adulte
regenerau doar un set foarte restrâns de linii celulare, dar s-a demonstrat cu timpul că au o
plasticitate mult mai mare.
CAPITOLUL I
IMPORTAN łA CELULELOR STEM
Bolile neurodegenerative sunt caracterizate de către deteriorările graduale şi
progresive sau pierderea celulelor nervoase şi a Ńesutului neural. Bolile cunoscute sunt
Alzheimer, Parkinson şi Scleroza multiplă. DisfuncŃiile neurodegenerative afectează peste 22
de milioane de persoane din întreaga lume. Unele tratamente simptomatice au devenit posibile
în ultimii 15 ani, dar încă nu s-a descoperit tratamentul complet al acestor boli.
Sclerozele multiple produc distrugerea treptată a creierului şi a foiŃei de mielină
protectoare a neuronilor coloanei vertebrale cu progres înspre boli ireversibile. Se estimează
că peste 2,5 milioane de persoane de pe Glob suferă de această boală. Acest număr include şi
pe cele 10000 de persoane din România. S-a dovedit că din celulele stem embrionare şi din
cele provenite din surse fetale se pot genera celule neuronale ce pot fi folosite pentru a
înlocui neuronii pierduŃi. Celulele stem mezenchimale dau neuronilor capacitatea de a migra
prin creier şi măduva spinării la locurile din Ńesut unde sunt prezente disfuncŃii sclerotice
1.1.CELULELE STEM - CARACTERIZARE GENERALĂ
Celulele stem sunt celule primare nediferenŃiate, care deŃin abilitatea da a se diferenŃia
în alte tipuri de celule. În această categorie intră atât celulele măduvei osoase şi celulele
sângelui periferic, cât şi celulele embrionare, a căror capacitate de diferenŃiere ajunge până la
200 de alte linii celulare diferite, proprietate care denumită plasticitate evolutivă (Erghelegiu,
Marina, 2005).
Fig.1. DiferenŃierea celulelor stem embrionare (http://www.srsp.net/kassel/images/Pluripotent_Stem_Cells.jpg)
Cercetătorii sunt de părere că terapia cu celulele stem, numită şi medicină
regenerativă, are potenŃialul de a schimba faŃa bolilor întâlnite la om şi animale prin utilizarea
lor la înlocuirea unor Ńesuturi specifice sau dezvoltarea de organe. Terapia cu celule stem se
experimentează, în prezent, în diverse centre medicale din întreaga lume. Există cel puŃin 10-
15 astfel de studii clinice în derulare.
Cea mai importantă aplicaŃie a celulelor stem umane este generarea de celule şi Ńesuturi care
pot fi folosite în aşa numitele ,,cell-based therapies’’ (tratamente pe bază de celule stem).
1.2. CLASIFICAREA CELULELOR STEM
1.2.1. Celule stem embrionare
Celulele stem embrionare provin din blastocişti. Blastocistul reprezintă stadiul de
dezvoltare embrionară preimplantaŃional, când embrionul murin este compus din 150 de
blastomere compactate, dispuse sub formă sferică (Gottlieb, D.I.., 1999).
În stadiul de blastocist, celulele embrionare se împart în celule care formează
embrioblastul (la interior) şi celule care formează trofoblastul (la exterior). Celulele
embrioblastului sunt celule stem pluripotente, deci dau naştere la toate tipurile de Ńesuturi ale
organismului, cu excepŃia celor care alcătuiesc placenta şi învelitorile fetale. Celulele
trofoblastului pot da naştere doar la placentă şi la învelitorile fetale (I. Vintilă, 2005 ).
Celulele stem embrionare [ES], asemănătoare celulelor embrionare germinale [EG],
pot să provină şi din celule germinale primordiale din care se formează ovulele şi
spermatozoizii, putând fi izolate şi cultivate in vitro unde îşi continuă multiplicarea şi îşi
menŃin capacitatea de diferenŃiere (Soria, B.,2000).
.
1.2.2. Celule stem adulte
Celula stem adultă este nediferenŃiată, dar se află într-un Ńesut diferenŃiat. Este
capabilă să se reînnoiască pe toată durata de viaŃă a organismului, dar în acelaşi timp
generează precursori ai Ńesutului diferenŃiat. Sunt celule pluripotente ce pot da naştere la toate
tipurile de Ńesuturi, exceptând placenta şi învelitoarele fetale.
Celulele stem adulte, deşi sunt greu de izolat din diferitele organe şi Ńesuturi şi au o
durată mică de viaŃă, nu dezvoltă tumori, iar probabilitatea rejecŃiei de organism este redusă,
mai ales în cazul pacienŃilor ce primesc celule recoltate din organe şi Ńesuturi proprii.
1.3 SURSELE ŞI CAPACITATEA DE DIFERENłIERE A CELULELOR STEM
SOMATICE PLURIPOTENTE ALE ADULTULUI
În ceea ce priveşte celulele stem embrionare (fig. 2), sursa principală o reprezintă
embrionul aflat în stadiul de blastocist. Pot fi obŃinute din blastocişti (ne)clonaŃi, o sursă
importantă fiind embrionii rezultaŃi prin fecundare ,,in vitro” (Fraichard, A., 1995).
A 2-a sursă sunt celulele rezultate din fecundarea ,,in vitro’’a ovulelor cu
spermatozoizi aflaŃi în ,,bănci de fertilitate’’. Cercetătorii nu sunt nevoiŃi să creeze embrioni
din spermatozoizi şi ovule, pentru că îi pot obŃine de la clinicile de fertilizare.
Uneori cuplurile care încearcă să aibă un copil crează mai mulŃi embrioni, dar nu sunt
toŃi folosiŃi. Aceştia îi pot dona pentru cercetare, altfel vor fi distruşi.
A 3-a sursă sunt celulele stem embrionare create prin SCNT (Somatic Cell Nuclear
Transfer = transfer nuclear de la celule somatice).
Acesta este procesul prin care materialul genetic al unei celule oarecare din corp este
transferat la un ovul enucleat, rezultând deci un ,,embrion’’ obŃinut fără fertilizarea cu ajutorul
unui spermatozoid. Se presupune că de fapt aceasta este o tehnică de clonare, lucru care ridică
multe întrebări în jurul acestui subiect.Clonarea terapeutică reprezintă dezvoltarea embrionilor
pentru a fi utilizaŃi în tratamentul bolilor. Metoda presupune ca informaŃia genetică a unei
celule somatice (de exemplu, o celulă din piele) să fie transferată într-un ovul din care ADN-
ul a fost eliminat.Când ovulul manipulat e pus într-un mediu de cultură, începe să se
multiplice, iar când atinge stadiul de blastocist, cercetătorii izolează şi cultivă celulele stem
din masa interioară.
Ultima sursă sunt fetuşii proveniŃi din avorturi în primul trimestru de sarcină.
Recoltarea celulelor stem adulte este practicată în lumea medicală de mai bine de 30
de ani, cel puŃin în ceea ce priveşte recoltarea lor de la nivelul măduvei osoase (fig. 11). 200 x
109 de hematii sunt create în fiecare zi în corpul uman din celulele stem hematopoetice
(Eglitis, M.A. and Mezey, E., 1997).
De exemplu, doar 1 din 10.000-15.000 de celule din măduva osoasă este celula stem
hematopoietică (formează sângele).
Fig. 2 DiferenŃierea celulelor stem din maduva osoasă http://stemcells.nih.gov/info/basics/basics4.asp
Recoltarea de la nivel sanguin pare să aibă unele avantaje faŃă de recoltarea de la nivel
medular (Ferrari, G., 1998), în sensul că se poate recolta un număr suficient de mare de celule
stem, care să poată susŃine mai multe şedinŃe intense de chimioterapie.
De asemenea, s-a demonstrat că, în caz de daune localizate, celulele stem
mezenchimale primesc semnale, provenite de la Ńesuturile distruse, care pun în mişcare
mecanismele reparatorii (Tavasolli et al., 1991).
Celulele stem mezenhimale şi hematopoietice au fost găsite în sângele din cordonul
ombilical. În studiile experimentale a fost demonstrat, că în timpul de cultivare pe termen
lung a mononuclearelor din sângele ombilical, celulele endoteliale-predecesori sub acŃiunea
anumitor citochine formează în cultură colonii de fibroblaste. (Nieda M., 1997).
CAPITOLUL II
EVIDENłIEREA CELULELOR STEM UMANE CU AJUTORUL ANTICORPILOR, ANTIGENILOR, MARKERILOR ŞI A TEHNICII DE
CITOMETRIE ÎN FLUX CONTINUU -
2.1. ANTICORPII
2.1.1. Caracterizarea generală a anticorpilor
Anticorpii sunt un tip de molecule proteice, fiind cunoscuŃi şi sub denumirea de
imunoglobuline. Există 5 tipuri de imunoglobuline: IgG, IgA, IgD, IgE şi IgM. Anticorpii
sunt produşi de limfocitele B pe calea naturală a exocitozei în ambele forme: plasma
membranară integrală şi secretorie. Ei formează receptorul specific antigenului celulelor B.
Anticorpii se găsesc în plasmă şi lipi Ńi de receptorii specifici ai regiunii invariabile ai
imunoglobulinei. Se mai găsesc şi în fluide secretori cum sunt mucusurile şi laptele.
Anticorpii sunt molecule având forma literei Y (fig. 3) fiind formaŃi din câte 2 lanŃuri grele şi
2 lanŃuri uşoare de polipeptide Aceste lanŃuri sunt unite prin legături covalente şi necovalente
(www.sinauer.com).
Fig. 3. Structura unui anticorp (http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.capemaster.net)
2.1.2. Anticorpii primari
Anticorpi primari sunt anticorpi formaŃi împotriva antigenilor de interes (o proteină,
peptidă, glucide, sau de alte molecule mici) şi sunt, de obicei neconjugaŃi. Anticorpii primari
care recunosc şi se leagă cu mare afinitate şi specificitate de epitopii unici.
(http://en.wikipedia.org/wiki/Primary _antibodies).
Anticorpii primari specifici utilizaŃi de mine în experimentele mele au fost:
Synaptophisin, NPT II, DsRed murin, CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murină.
2.1.3. Anticorpii secundari
Un anticorp secundar este un anticorp care se leagă de anticorpul primar sau de
fragmente de anticorpi. De obicei ei sunt etichetaŃi cu sonde care îi fac uşor de folosit pentru
detectarea, purificarea sau sortarea celulelor.
Anticorpii secundari specifici sunt de obicei folosiŃi în diferite aplicaŃii de laborator.
Sunt selectaŃi în funcŃie de anticorpii primari folosiŃi, clasa de anticorpi primari (de exemplu,
IgG sau IgM), precum şi de tipul de sondă care este de preferat. Identificarea anticorpilor
secundari optimi se realizează în mod normal prin mai multe încercări
(http://en.wikipedia.org/wiki/Secondary_antibody).
Fig. 4 Ataşarea anticorpului secundar de anticorpul primar http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/fc/Primary-Secondaryantibody.svg/300px-Primary-Secondaryantibody.svg.png
Anticorpii secundari specifici utilizaŃi de mine în experimentele mele sunt: Alexa Flor
488 atât capră anti murin cât şi capră anti iepure, Alexa Flor 633 atât capră anti murin cât şi
capră anti iepure şi Alexa Flor 594 capră anti murin.
.
2.2. ANTIGENII
Antigenul (greacă: anti=contra şi geano=a naşte, a genera) este termenul care
defineşte orice substanŃă de origine endogenă sau exogenă, care, odată ajunsă în
organism, nu este recunoscută ca proprie şi determină apariŃia unui răspuns imun, ce
vizează neutralizarea şi eliminarea ei ( http://ro.wikipedia.org/wiki/Antigen).
2.3. CITOMETRIA ÎN FLUX CONTINUU
Citometria în flux continuu este o tehnică de numărare şi de examinare a
particulelor microscopice, cum ar fi celule şi cromozomi, prin suspendarea lor într-un
curent de fluid şi trecerea lui printr-un aparat electronic de detectare. Aceasta permite
analiza simultană a caracteristicilor fizice şi chimice a mii de particule pe secundă.
Citometria în flux este utilizată în mod curent în diagnosticul unor tulburări de
sănătate, în special în cazurile de cancer de sânge, dar are multe alte aplicaŃii, atât în
cercetare cât şi în practică clinică (Recktenwald DJ. 1993).
►Principiul citometriei în flux continuu
Un fascicul de lumină (lumina laser, de obicei) dintr-o singură lungime de undă
este direcŃionat pe un flux de lichid concentrat hidrodinamic. O serie de detectori sunt
îndreptaŃi înspre punctul în care fluxul trece prin fascicul de lumină: unul, în
conformitate cu fascicul de lumină cu dispersia pe direcŃia înainte (Forward Scatter) şi
fasciculul de lumină cu dispersia perpendiculară (Side Scatter). Fiecare particulă de
dimensiuni de la 0.2 - 150 micrometri ce trece prin fasciculul de lumină şi substanŃele
chimice fluorescente găsite în particule sau ataşate de particule pot fi excitate să emită
lumină la o lungime de undă mai mare decât sursa de lumină. Această combinaŃie de
lumină fluorescentă şi lumină dispersată este preluată de către detectoare şi prin
analizarea fluctuaŃiilor de luminozitate, la fiecare detector, după care este posibilă
obŃinerea diferitelor tipuri de informaŃii despre structura fizică şi chimică a fiecărei
particule individuale. FSC este corelat cu volumul celulelor şi SSC depinde de
complexitatea interioară a particulei. (Givan A. 2001).
CAPITOLUL III REZULTATE PRIVIND CERCET ĂRILE EFECTUATE PE PLAN NA łIONAL ŞI INTERNA łIONAL ÎN CEEA CE PRIVE ŞTE CULTURA DE CELULE
STEM
3.1. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PE PLAN NAłIONAL
► Prima bancă publică de sânge placentar din Ńara noastră, la care au acces gratuit toŃi
cetăŃenii români, funcŃionează la Cluj-Napoca, cu ajutorul FundaŃiei Eurocord România. O
altă bancă privată de sânge placentar a fost deschisă în Bucureşti, de către Centrul Medical
Unirea, în colaborare cu Stem-Health Grecia (http://www.contraboli.ro/ banca-de-celule-
stem-la-cluj).
► Cercetări s-au efectuat si de către Groza Daria Maria în teza sa de doctorat cu
titlul ,,Cercetări experimentale privind comportamentul in vitro şi in vivo al celulelor
stem în reproducerea umană’’, 2009. Scopul acestei teze de doctorat este reprezentat
de aplicarea în practică a cunoştinŃelor actuale privind celulele stem din anexele fetale
şi sângele cordonului ombilical precum şi de cercetarea experimentală a izolării,
diferenŃierii şi transplantării in utero a celulelor stem umane obŃinute pe model animal,
utilizând biotehnologii de ultimă oră.
3.2. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PE PLAN INTERNAłIONAL
► O etapă nouă în folosirea celulelor stem adulte o constituie, din 1989, descoperirea şi
folosirea ca sursă a celulelor stem adulte, sângele extras din cordonul ombilical. Chiar în acel
an, s-a efectuat cu succes transfuzia sângelui din cordonul ombilical. Aceasta a fost prima
dovadă clinică privind faptul că sângele cordonului ombilical este într-adevar o sursă de
celule stem adulte. (http://www.produsenaturiste.net/pages/Stimularea-pe-cale-naturala-a-
celulelor-stem-adulte.html).
► În America a avut loc un experiment de acest fel. În condiŃii de laborator din celulele
stem ale unei vaci au obŃinut un rinichi funcŃional pe care l-au transplantat în animal. Noul
rinichi a funcŃionat asemănător cu cel original, producând urină. Dar cercetările şi
experienŃele privind celulele stem adulte ridică, numeroase întrebări morale şi etice.
(http://dictionar.romedic.ro/transplant-de-celule-stem).
CAPITOLUL IV
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCET ĂRII
4.1. SCOPUL CERCETĂRII
Studiile internaŃionale efectuate până în prezent în domeniul celulelor stem au
demonstrat caracteristicile acestora, devenite în zilele noastre un instrument foarte important
al medicinii regenerative. În România, există doar câteva studii care urmăresc această direcŃie
de cercetare, acestea fiind axate preponderent pe elucidarea particularităŃilor celulelor stem
adulte. Studiul de faŃă a fost întreprins în vederea testării capacităŃii următorilor anticorpi
monoclonali primari Synaptophisin, NPT II, DsRed murin, CD 31 murin şi Cytokeratina 20
murină, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 atât capră anti murin cât şi capră anti iepure,
Alexa Flor 633 atât capră anti murin cât şi capră anti iepure şi Alexa Flor 594 capră anti
murin. Aceştia sunt citaŃi de literatura de specialitate (J. W. Goding, 1984; A. M. Campbell,
1984) şi sunt utilizaŃi cu scopul de a evidenŃia celulele stem umane existente în creierul
fetusului ovin.
IncidenŃa tot mai frecventă a unor boli de gravitate foarte mare, cu conseciŃe severe
asupra vieŃii sociale umane, cum sunt boala Parkinson, Alzheimer şi sclerozele multiple
(Aponso P.M. et al., 2007), constituie pentru cercetători o continuă provocare în găsirea de
soluŃii curative eficiente. Trebuie subliniat faptul că deşi există cercetări în acest domeniu care
implică utilizarea celulelor stem, rezultatele obŃinute sunt încă departe de a fi satisfăcătoare.
Acesta este motivul pentru care am ales efectuare a studiului de faŃă.
4.2.OBIECTIVUL CERCERĂRII
Obiectivul cercetării a constat în identificarea celei mai adecvate metode de
evidenŃiere a celulelor stem umane migrate în creierul fetal ovin. Obiectivele metodologice au
vizat testarea mai multor seturi de anticorpi monoclonali şi policlonali în vederea identificării
posibilităŃii acestora de a fi utilizaŃi în evidenŃierea celulelor stem umane în creierul fetal ovin.
În acest scop, a fost întocmit planul experimental al cercetării, luându-se în studiu 8 seturi de
anticorpi monoclonali şi policlonali, a căror eficienŃă a fost testată pe creier provenit de la
fetus ovin. S-a practicat aceeeaşi metodologie de testare, bazată pe principiul emisiei de
fluorescenŃă specifică, respectiv coloraŃie roşie în cazul celulelor nervoase ovine şi dublă roşu
– verde, în cazul neuronilor umani. Prin tehnica citometriei în flux continuu, am determinat
care dintre anticorpi se pretează la identificarea celulelor stem umane.
CAPITOLUL V
CERCETĂRI PRIVIND UTILIZAREA UNOR ANTICORPI MONOCLONALI ÎN EVIDEN łIEREA CELULELOR STEM UMANE
5.1. MATERIALE ŞI METODE
5.1.1. Materiale utilizate
A). Materiale biologice:
În vederea testării anticorpilor monoclonali a fost studiat un lot de ovine si fetuşii
acestora, aparŃinând rasei Merinos, din efectivul de animale al fermei din Reno, Nevada.
Ca şi materiale biologice au fost folosite:
-Creier fetal ovin, celule stem provenite din linii celulare existente în banca de celule a
laboratorului din Reno, Nevada, anticorpi, antigeni, markeri.
B). Materiale chimice:
-SoluŃii de PBS (Phosphate Buffered Saline), NGS, soluŃie de blocare (bloking buffer),
Etanol, Metanol, Alcool de diferite concentraŃii (100, 95 şi 75 %), SoluŃie de recuperare a
antigenului (antigen retrival),DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) –colorant fluorescent ce
se leagă de ADN, Hoecst, Medii Dako, Dulbeco, DMEM (Dulbeco Modified Eagle medium),
Apă sterilă, Spirt medicinal şi soluŃii pentru dezinfecŃii.
C). Aparatura de laborator:
Aparatura utilizată în vederea realizării experimentelor a fost: Microtomul, Microscopul
electronic, Microscopul confocal, Microscopul Olympus Bx 60 (Epifluorescence Microscop),
Aparate PCR, Lămpi UV, Centrifugi, Agitator ultraturax (Helidolph), Aparat pentru produs
gheaŃă (Brema), Autoclav (Raypa), Baie marină (Fisher Bioblock Scientific polystat),
BalanŃa analitica (Schimadzu AW 320M), Containere Biohazard pentru deşeuri (Brema),
deionizator de apă (Smeg WP 3000), Etuvă (Memmet), Frigidere, congelatoare, Hotă pentru
chimicale (Kottermann),Hotă PCR (Steril), Microcentrifuge (Sigma 1-15), pH - metru
(InoLab), Spectrofotometru UV-VISNano Drop ND-1000, Vortex (Schimadzu).
D).Matriale consumabile de laborator:
Sticlăria de laborator, Lamele, Lame, Eprubete, Bisturie, mănuşi, Pipete (Eppendorf) cu
volume reglabile de la 0,2-5 µl, 5-10 µl, 50-100 µl şi 100-1000 µl, Tuburi (Eppendorf) de
1,5 ml, Vârfuri de pipete de dimensiuni diferite (dimensiuni mari, medii şi mici), cu volume
de 0,2-5 µl, 5-10 µl, 50-100 µl şi 100-1000 µl.
5.1.2. Metode de colorare
Se utilizează metodica specifică testării anticorpilor şi pentru a ajunge la etapa de
colorare trebuiesc parcurse mai întâi alte etape, după cum urmează:
1). Prelevarea materialului biologic (a Ńesutului din creier fetal ovin)
→Recoltarea
Recoltarea este operaŃiunea de prelevare a unor mici fragmente de Ńesut sau organ, fie
din organismul viu, fie de la cadavre. Deşi este considerată de multe ori o operaŃiune banală,
ea reprezintă de fapt una din cele mai importante etape ale efectuării preparatului permanent.
→ Modul de prelevare a creierului
Animalele adulte gestante în 58-60 de zile au fost supuse unei operaŃii chirurgicale, în
care li s-au scos prin incizia făcută coarnele uterine, injectându-se intraperitoneal fetuşilor o
anumită cantitate de celule stem umane. După o săptămână de la operaŃie animalele adulte
sunt sacrificate, iar fetuşilor le sunt prelevate organele de interes. Acestea sunt tratate şi apoi
păstrate.
PărŃi din Ńesuturile acestor organe se păstrează în blocuri de parafină sau gheaŃă. În
acest fel pot fi păstrate pe perioade îndelungate de timp.
2). Includerea materialului biologic în blocuri de parafină
→Preparatul permanent
Efectuarea unui preparat permanent necesită o procedură mult mai complicată în
comparaŃie cu preparatul proaspăt. Pentru executarea lui trebuie parcurse un număr mare de
etape sau timpi de lucru, fiecare având o influenŃă hotărâtoare asupra calităŃilor preparatului.
În cele mai multe cazuri aceste etape sunt următoarele: recoltarea, fixarea, spălarea (şi
decalcificarea când este cazul), includerea, secŃionarea, colorarea şi montarea. Modul de
realizare a acestor etape este de cele mai multe ori adaptat la necesităŃile pieselor prelucrate.
Astfel, aceşti timpi de lucru pot fi scurtaŃi sau prelungiŃi, simplificaŃi sau complicaŃi în funcŃie
de situaŃie. Cert este faptul că numai cel care ştie să adapateze aceşti timpi de lucru la
necesităŃile probei va obŃine în final un preparat histologic de calitate.
→Fixarea
Pentru studiul histologic nu este suficient ca proba de examinat să fie transparentă şi
să posede un contrast optic adecvat.
Celulele şi Ńesuturile (mai ales cele prelevate de la animale) sunt instabile din punct de
vedere fizic şi chimic. Celulele şi materialele extracelulare trebuie “conservate” astfel încât
modificările structurale şi de compoziŃie chimică ale pieselor prelucrate histologic să fie
minime. Această “conservare” este subiectul fixării. Mai simplu spus, fixarea are ca scop
întreruperea fenomenelor vitale din celule şi Ńesuturi, cu păstrarea cât mai fidelă a structurii
acestora.
Formaldehida este un gaz, însă în histologie este folosită sub formă de soluŃie 37 –
40 % formaldehidă în apă, soluŃie ce poartă numele de formalină. Dacă formalina este
utilizată ca un fixator în soluŃii apoase simple, ea trebuie diluată cu câteva zile înainte, iar
când se foloseşte ca formalină neutralizată poate fi utilizată imediat.
→Spălarea
După încheierea fixării acŃiunea fixatorului trebuie stopată prin îndepărtarea acestuia
din piese. În caz contrar, acŃionând în continuare, fixatorul va denatura treptat unele
componente ale pieselor biologice. Singurul fixator în care piesele pot fi păstrate un timp mai
îndelungat fără să determine modificări majore, este formalina. Pentru spălarea fixatorului din
piese la încheierea fixării se foloseşte apă sau alcool, în funcŃie de compoziŃia fixatorului
utilizat.
Spălarea trebuie făcută obligatoriu în apă după fixare cu bicromat, acid cromic sau
tetraoxid de osmiu. Se pot folosi în acest scop recipiente speciale cu pereŃii perforaŃi şi
astupate cu un dop mare de plută.
→Includerea în parafină
După spălare, apa din piese este extrasă (deshidratare) şi înlocuită cu solvenŃi ai
parafinei (clarificare), iar în final piesa este infiltrată cu parafină topită (parafinare). Procedura
standard este valabilă pentru piesele cu o grosime de 3–5 mm. Timpii de deshidratare,
clarificare, infiltrare cu parafină pot fi scurtaŃi sau prelungiŃi, după cum piesele sunt mai mari
sau mai mici.
Dacă se folosesc fixatorii alcoolici stadiile iniŃiale ale deshidratării sunt omise. Pentru
întreaga procedură volumul de lichid trebuie să fie de 10 – 20 ori mai mare decât volumul
piesei.
3). SecŃionarea
După solidificarea blocurilor de parafină care conŃin piesele biologice, se poate trece
la secŃionarea acestora. OperaŃiunea se execută cel mai frecvent cu un microtom rotativ, deşi
se pot folosi şi microtoame basculante sau culisante. SecŃiunile se obŃin sub formă de felii
subŃiri, cu o grosime medie de 6 – 7 µm. Cu o îndemânare deosebită este posibilă obŃinerea
unor panglici constituite dintr-o succesiune de secŃiuni ce pot avea o grosime de numai 4 µm.
SecŃiunile obŃinute vor fi lipite pe lame de sticlă cu ajutorul unui strat subŃire de albumină
Mayer.
4). Deparafinizarea
Se înlătură parafina, folosindu-se xylenă. Se lasă lamele în această soluŃie 10 minute,
la temperatura camerei. Dacă este necesar se repetă pâna la îndepartarea totală a parafinei.
5). Colorarea
Histologii utilizează numeroase soluŃii colorante, folosite de obicei la temperatura
camerei.
Acest procedeu de extragere a colorantului este numit diferenŃiere sau decolorare.
Succesul ambelor metode de colorare depinde de faptul că în general coloranŃii au o mai mare
afinitate faŃă de anumite structuri decât faŃă de altele.
ColoraŃia se numeşte simplă când se utilizează un singur colorant (ex. coloraŃia simplă
cu albastru de metilen), dublă când se folosesc două soluŃii colorante (ex. coloraŃia dublă cu
hematoxilină-eozină) şi tricromică când se folosesc trei soluŃii colorante (ex. tricrom Masson).
Cea mai utilizată metodă de colorare a secŃiunilor histologice este coloraŃia dublă cu
hematoxilină (hemalaun) şi eozină.
6). Montarea
După colorare, secŃiunile sunt montate într-o substanŃă care protejează secŃiunea şi nu
influenŃează contrastele. Cel mai utilizat mediu de montare este balsamul de Canada. Acesta
este un mediu de montare natural, fiind o răşină a speciei Abies balsamea. Balsamul de
Canada natural este un lichid vâscos galben, care se înmoaie prin încălzire. Prin uscare el
devine solid şi pentru a fi făcut corespunzător pentru montare trebuie amestecat cu xilen.
5.2. TEHNICI DE COLORARE
5.2.1. Colorarea in vivo
Această tehnică este tehnica colorării Ńesuturilor vii. Determinând anumite celule sau
structuri să capete o culoare contrastantă, acestora li se poate studia mai uşor morfologia sau
poziŃia în interiorul unui Ńesut. Scopul principal al colorării este de a descoperii anumite
amănunte citologice ce ar putea fi omise.
Prin această tehnică se poate arăta unde există anumite chimicale sau unde au loc
reacŃii chimice specifice în interiorul celulelor sau Ńesuturilor.
5.2.2. Colorarea in vitro
Colorarea in vitro înseamnă colorarea celulelor sau Ńesuturilor ce nu mai sunt în viaŃă.
AnumiŃi coloranŃi sunt deseori combinaŃi pentru a avea o putere de colorare mai mare decât
un singur colorant şi pentru a dezvălui mai multe detalii si calităŃi decât un singur colorant.
Folosită alături de protocoale de fixare şi preparare a probelor, această tehnică poate fi folosită
în punerea de diagnostice sigure.
5.2.3. Tehnica ,,Counterstain’’
Aceasta este tehnica ce se foloseşte atunci când cu ajutorul tehnicii simple de coloraŃie
nu se găsesc rezultate, facând celulele sau structurile celulare mult mai vizibile. De exemplu,
,,cristal violetul” colorează doar bacteriile gram-positive. Tehnica counterstainingului cu
safrarin este folosit pentru toate celulele, peermiŃând şi identificarea bacteriilor gram-
negative.
De multe ori aceste tehnici se numesc ,,tehnici vitale’’, deoarece coloranŃii sunt
introduşi în organisme vii. Totuşi, unii coloranŃi sunt toxici pentru organisme.
Pentru a atinge rezultatele dorite, coloranŃii sunt folosiŃi în diluŃii de la 1:5000 la
1:500000. (Howey, 2000).
5.3. INTERPRETAREA PREPARATULUI COLORAT IMUNOHISTOCHIMIC
Deşi imunoreacŃiile pozitive elimină mult din subiectivismul examinatorului, este
necesară în primul rând o evaluare strictă a calităŃii preparatului. În acest sens trebuie să se
Ńină cont de o serie de parametri:
►Controlul pozitiv extern – se va include împreună cu lama de studiat în tehnica de
lucru (e.g. investigarea cu anti-CD3, control pozitiv extern pe secŃiune de timus; investigarea
cu enolază neuronal specifică, control pozitiv extern secŃiune cortex cerebral).
►Control negativ extern – este o secŃiune din biopsia de studiat pe care în loc de
anticorp se aplică soluŃia „control negativ”; rezultatul se va compara cu cel obŃinut pe
secŃiunea tratată cu anticorp. Majoritatea anticorpilor sunt livraŃi împreună cu soluŃia control
negativ.
►Controlul pozitiv intern – anticorpul colorează pe secŃiune substraturi potenŃial
pozitive (e.g. anti-von Willebrand colorează citoplasma celulelor endoteliale; anti-actina
muschi neted colorează miocitele netede, celule mioepiteliale şi miofibroblastele).
►Controlul negativ intern – anticorpul nu colorează substraturi care potenŃial sunt
negative (e.g. citokeratina 8 nu colorează epiteliile scuamoase; desmina nu colorează celulele
epiteliale sau conjunctive ).
5.3.1. Protocolul de imunohistochimie
I. Pentru Ńesuturi fixate în parafină
1.Se înlătură parafina, folosindu-se xylenă. Se lasă lamele în această soluŃie 10 minute,
la temperatura camerei. Dacă este necesar se repetă pâna la îndepartarea totală a
parafinei.
2.Are loc rehidratarea Ńesutului de pe lamă, prin transfer repetat în soluŃii de etanol de
concentraŃii 100 %, 95 % şi 75 %, timp de câte un minut în fiecare concentraŃie. La
final se lasă în apă un minut.
3.Se incubează în soluŃie de antigen retrival (soluŃie de recuperare a antigenului) la
temperature de 93ºC, timp de 5 minute, apoi se lasă să se răcească la temperature
camerei.
4. Se lasa în soluŃie de PBS.
După efectuarea acestor paşi, lamele cu Ńesutul fixat sunt pregătite pentru colorarea cu
ajutorul anticorpilor primari şi secundari, în scopul de a evidenŃia celulele de interes.
II. Pentru Ńesuturi fixate în parafină şi blocuri de gheaŃă
1. Se clătesc lamele în PBS de 3 x 5 minute
5. Se incubează în soluŃie NGS, care este un buffer – soluŃie tampon (formată din PBS + 10
% ser normal de capră), timp de 1 oră, la 4ºC, sau 15 – 30 minute la temperatura camerei
6. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 2 x 5 minute
7. Se incubează cu anticorpul primar diluat cu PBS + 2 % NGS timp de 3 ore la temperatura
camerei, sau peste noapte la 4ºC într o cameră umidificată. Anticorpul primar se pune pe
toate lamele, mai puŃin pe lama de control negativ, pe care se pune doar anticorpul secundar.
8. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 3 x 5 minute
9. Se incubează cu anticorpul secundar, diluat în PBS + 2 % NGS, timp de 1 oră la
temperatura camerei. Anticorpul secundar se pune pe toate lamele, în cantitate de 2,5 µl/
lamă.
10. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 3 x 5 minute.
11. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS
12. Se adaugă pe fiecare lamă câteva picături din colorantul DAPI şi se lasă 5 minute. Dacă
nu există DAPI, se poate folosi soluŃie HOECHST, în diluŃie de 1 µl/ 5 ml PBS
13. Se clăteşte cu soluŃie de PBS
14. Se uscă lamele la temperatura camerei şi se sigilează cu lamela, folosind Cytoseal 60
pentru sigilarea lamelor .
5.4. IMPORTANłA TEHNICII DE COLORARE
Tehnica staining este procedura prin care un specimen histologic este vizualizat cu
rezoluŃie maximă prin fixarea lui pe o lamă plasată pe suportul situat pe fanta luminoasă a
microscopului.
Stainingul este o tehnică auxiliară folosită în microscopie, pentru a amplifica
contrastul în imaginea văzută la microscopul electronic.
În biochimie la această tehnică sunt folosiŃi la substrat şi coloranŃi specifici ADN-ului,
proteinelor, lipidelor şi carbohidraŃilor, pentru a califica şi cuantifica prezenŃa componenŃilor
specifici.
Această tehnică e foarte folosită în biologie şi medicină pentru a evidenŃia structuri în
Ńesutul biologic. Stainingul mai poate fi folosit pentru a defini şi examina fibre musculare sau
Ńesut conjunctiv, populaŃii de celule sau organite celulare.
5.5.TESTAREA SETURILOR DE ANTICORPI 5.5.1. Testarea primului set de anticorpi prin efectuarea unei coloraŃii duble, pe Ńesuturi
fixate in parafina parafină
5.5.1.1. Rezultate şi discuŃii
La testul 1, la care s-au folosit anticorpii primari Synaptophisina murină şi NPT II de
iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure, deşi au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi
succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele aşteptate.
În figura 5 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2246.
Fig.5. Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari Synaptophisină murină şi NPT II de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de capră anti iepure
(original)
În literatură nu au fost găsite date care să facă referire la testarea acestor anticorpi în
evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente în creierul fetusului ovin.
5.5.2. Testarea celui de-al II- lea set de anticorpi prin efectuarea unei coloraŃii simple,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2269.
S-a efectuat o coloraŃie simplă pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele
umane şi ovine, folosindu-se ca şi anticorp primar DsRed murin, iar ca anticorp secundar
Alexa Flor 488 de capră anti murin. S-au folosit 10 lame.
5.5.2.1. Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 2, au fost utilizaŃi anticorpul primar DsRed murin, iar ca anticorp
secundar Alexa Flor 488 de capră anti murin. Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu
stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃia şi succesiunea de reacŃii recomandate de
protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele aşteptate.
În figura 6 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2246.
Fig.6. ColoraŃie, cu anticorpul primar DsRed murin şi anticorpul secundar Alexa Flor 488 de
capră anti murin (oroginal)
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.3. Testarea celui de-al III- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2267. S-a efectuat o dublă coloraŃie
pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, folosindu-se ca şi
anticorpi primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murin, iar ca anticorpi secundari Alexa
Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 capră anti murin. S-au folosit 20 lame.
5.5.3.1. Rezultate şi discuŃii
Nici testul 3 care a fost efectuat cu anticorpii primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20
murin, iar ca anticorpi secundar Alexa Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 de capră
anti murin, nu a condus la obŃinerea rezultatelor aşteptate. MenŃionăm că şi în acest caz, au
fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi succesiunea de reacŃii
recomandate de protocoale.
În figura 7 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2267.
Fig.7. Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murin şi cu anticorpii Alexa Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 de capră anti murin(original)
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.4. Testarea celui de-al IV-lea set de anticorpi, prin efectuarea unei coloraŃii duble,
pe Ńesuturi din parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2248. S-a efectuat o dublă coloraŃie,
având la dispoziŃie 30 lame. Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi
ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed monoclonal
murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa Flor 488 de
capră anti murin.
5.5.4.1. Rezultate şi discuŃii
La testul 4, unde s-au folosit anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed
monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa
Flor 488 de capră anti murin., deşi au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 8 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2248.
Fig.8 . Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa
Flor 488 de capră anti murin (original)
În literatură nu au fost găsite date care să facă referire la testarea acestor anticorpi în
evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente în creierul fetusului ovin.
5.5.5. Testarea celui de-al V-lea set de anticorpi, prin efectuarea unei coloraŃii duble, pe
Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2270. S-a efectuat o dublă coloraŃie,
având la dispoziŃie 30 lame. Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi
ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de
iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure.
5.5.5.1.Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 5, au fost utilizaŃi anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi
Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi
Alexa Flor 633 de capră anti iepure.
Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 9 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2270.
Fig.9 .Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure (original).
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.6. Testarea celui de-al VI- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2280. S-a efectuat o dublă coloraŃie,
având la dispoziŃie 30 lame. Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi
ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari Oligodendrocyte murin şi Chromatogranină A de
iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure. .
5.5.6.1.Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 6, au fost utilizaŃi anticorpii primari Oligodendrocyte murin şi
Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin
şi Alexa Flor 633 de capră anti iepure .
Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 10 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2280.
Fig.10 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari Oligodenrdocyte murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure (original).
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.7. Testarea celui de-al VII- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2281. S-a efectuat o dublă coloraŃie
pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, folosindu-se ca şi
anticorpi primari DsRed murin şi Chromatogranina A de iepure, iar ca anticorpi secundari
Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 de capră anti iepure. S-au folosit 20
lame.
5.5.7.1.Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 7, au fost utilizaŃi anticorpii primari DsRed murin şi Chromatogranină
A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594
de capră anti iepure .
Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 11 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2281.
Fig.11 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 de capră anti
iepure (original)
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.8. Testarea celui de-al VIII- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble
coloraŃii, pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-au folosit indivizii 2270, 2271, 2272, 2273, 2274. S-a efectuat o
dublă coloraŃie, având la dispoziŃie cate 4 lame de la fiecare individ, adică 20 lame.
Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, s-au folosit ca
şi anticorpi primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca
anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 capră anti iepure.
5.5.8.1.Rezultate şi discuŃii
Testul 8 care a fost efectuat cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi
Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi
Alexa Flor 594 capră anti iepure.
Este singurul test care a condus la obŃinerea rezultatelor aşteptate. MenŃionăm că şi în
acest caz, au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi succesiunea de
reacŃii recomandate de protocoale.
În figura 12 se poate observa că a avut loc colorarea şi s-a putut face identificarea
celuleor stem uname, deci s-a putut stabili existenŃa lor în creierul tuturor indivizilor
analizaŃi, care a avut o reacŃie pozitivă la anticorpul primar DsRed murin şi Chromatogranină
A de iepure împreună cu anticorpii secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa
Flor 594 capră anti iepure.
Fig. 12 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594
capră anti iepure (original).
CAPITOLUL VI CARACTERIZAREA ANTICORPILOR CU AJUTORUL TEHNICII DE
CITOMETRIE ÎN FLUX CONTINUU
Citometria în flux este o tehnologie care permite unei singure celule să fie măsurată
pentru o varietate de caracteristici, măsurătorile fiind determinate doar prin observarea
celulelor la trecerea printr-un lichid. Instrumentele folosite pentru acest lucru pot aduna
informaŃii despre celulele, prin măsurarea emisiilor de lumină vizibilă şi fluorescentă, care să
permită o triere a celulelor bazate pe trăsături fizice, biochimice şi antigenice
(http://en.wikipedia.org/wiki/ Flow_cytometry)
6.1. MATERIALE ŞI METODE
6.1.1. Materiale utilizate
A). Materiale biologice:
Ca şi materiale biologice au fost folosite: Creier fetal ovin, Celule stem provenite din
linii celulare existente în banca de celule a laboratorului din Reno, Nevada, sânge fetal ovin
B). Materiale chimice:
-coloranŃi fluorescenŃi- FITC (fluorescein izotiocianat), PE (ficoeritrină), APC
(aloficocianină) , anticorpi: CD4, CD8, CD25, Mouse IgG 1
C). Aparatura de laborator:
-aparatul de citometrie în flux continu
D).Matriale consumabile de laborator:
-Sticlăria de laborator, Eprubete, Mănuşi, Pipete (Eppendorf) cu volume reglabile de la 0,2-5
µl, 5-10 µl, 50-100 µl şi 100-1000 µl, Tuburi (Eppendorf) de 1,5 ml,Vârfuri de pipete de
dimensiuni diferite (dimensiuni mari, medii şi mici), cu volume de 0,2-5 µl, 5-10 µl, 50-100
µl şi 100-1000 µl.
6.2. REZULTATE ŞI DISCUłII
În urma aplicării tehnicii de citometrie în flux în vederea identificării celulelor stem
umane din creierul fetal ovin, s-au constatat următoarele:
1. Se observă populaŃia pozitivă la ov CD4 PE marcată cu P1 reprezentând 9 de
evenimente, respectiv 0,41% din total şi populaŃia pozitivă ov CD 25 FITC marcată cu P2,
reprezentând 77 evenimente, respectiv 3,50 % din totalul celulelor (fig. 13 ). Pornind de la
premisa că anticorpii folosiŃi au fost creaŃi pentru a recunoaşte celule stem umane, putem
afirma faptul că 3,91% din celulele analizate sunt celule stem umane la individul 2164
(ANEXA nr. 1).
Fig. 13. Rezultatele analizării anticorpilor ov CD4 şi ov CD25 (original)
2. Se observă populaŃia pozitivă la ovCD8 PE marcată cu P1 reprezentând 40 de
evenimente, respectiv 1,07 % din total şi populaŃia pozitivă la ov CD4 FITC marcată cu P2,
reprezentând 767 evenimente, respectiv 20,49% din totalul celulelor (fig. 14). Pornind de la
premisa că anticorpii folosiŃi au fost creaŃi pentru a recunoaşte celule stem umane, putem
afirma faptul că 21,56% din celulele analizate sunt celule stem umane la individul 2165
(ANEXA nr 1).
Fig. 14. Rezultatele analizării anticorpilor ov CD8 şi ov CD4 (original)
P1
P2
P1
P2
3. Se observă populaŃia pozitivă la ovCD8 PE marcată cu P1 reprezentând 84 de
evenimente, respectiv 1,31 % din total şi populaŃia pozitivă la ov CD4 FITC marcată cu P2,
reprezentând 2083 evenimente, respectiv 32,38% din totalul celulelor (fig. 15). Pornind de la
premisa că anticorpii folosiŃi au fost creaŃi pentru a recunoaşte celule stem umane, putem
afirma faptul că 33,69% din celulele analizate sunt celule stem umane la individul 2166
(ANEXA nr 2)
Fig. 15 . Rezultatele analizării anticorpilor ov CD8 şi ov CD4 (original)
4. Se observă populaŃia pozitivă la ovCD4 PE marcată cu P1 reprezentând 45 de
evenimente, respectiv 0,68 % din total şi populaŃia pozitivă la ov CD 25 FITC marcată cu P2,
reprezentând 202 evenimente, respectiv 3,06% din totalul celulelor (fig. 16). Pornind de la
premisa că anticorpii folosiŃi au fost creaŃi pentru a recunoaşte celule stem umane, putem
afirma faptul că 3,74% din celulele analizate sunt celule stem umane la individul 2169
(ANEXA nr 2).
Fig. 16. Rezultatele analizării anticorpilor ov CD4 şi ov CD25 (original)
P2
P1
P1
P2
CAPITOLUL VII
PRELUCRAREA STATISTIC Ă A DATELOR REFERITOARE LA NUM ĂRUL
TOTAL DE CELULE, NEURONI OVINI ŞI CELULE STEM UMANE,
EVIDENłIATE CU AJUTORUL ANTICORPILOR UTILIZA łI
Numărul mediu de celule evidenŃiate în creierul fetal ovin a înregistrat valori cuprinse
între 764,05 când evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi VIII şi 614,33 când
evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi V. S-a înregistrat o variabilitate cuprinsă între
1,67% pentru setul VI de anticorpi şi 0,47% pentru setul III de anticorpi (tabelul 1 ).
Tabelul 1 Mediile şi parametrii dispersiei pentru totalul celulelor evidenŃiate cu cele 8 seturi de
anticorpi utilizate Table 1
The averages and dispersion parameters for the total emphasized cells with 8 sets of antibodies
Specificare (Issue) n X ± X
s V%
Setul I de anticorpi Set I of antibodies
20 674,95
± 1,79 1,19
Setul II de anticorpi Set II of antibodies
10 691,50
± 1,72 0,79
Setul III de anticorpi Set III of antibodies
20 757,10
± 0,79 0,47
Setul IV de anticorpi Set IV of antibodies
30 675,03
± 1,67 1,36
Setul Vde anticorpi Set V of antibodies
30 614,33
± 1,28 1,14
Setul VI de anticorpi Set VI of antibodies
30 680,60
± 2,08 1,67
Setul VII de anticorpi Set VII of antibodies
20 744,05
± 1,67 1,01
Setul VIII de anticorpi Set VIII of antibodies
20 764,05
± 1,21 0,71
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
I II III IV V VI VII VIII
Tot
alul
cel
ulel
or e
vide
nŃia
te c
u ce
le 8
setu
ri de
ant
icor
pi u
tiliz
ate
Setul de anticorpi
Media Coeficientul de variabilitate, V%
Fig. 17. Mediile totalului celulelor evidenŃiate cu cele 8 seturi de anticorpi şi coeficienŃii de variabilitate
The averages of the total emphasized cells with all 8 sets of antibodies and coefficients of
variability (original)
Numărul mediu de neuroni ovini evidenŃiaŃi în creierul fetal ovin a înregistrat valori
cuprinse între 123,90 când evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi III şi 225,90 când
evidenŃierea s-a efectuat cu setul de anticorpi I.
S-a înregistrat o variabilitate cuprinsă între 22,87% pentru setul VIII de anticorpi şi
56,97% pentru setul II de anticorpi (tabelul 2). Aceasta a fost mult mai mare decât cea
obŃinută pentru totalul celulelor evidenŃiate, indicânt o mai mare neomogenitate a probelor.
Tabelul 2 Mediile şi parametrii dispersiei pentru neuronii ovini evidenŃiaŃi cu cele 8 seturi
de anticorpi utilizate Table 2
The averages and dispersion parameters for the sheep nerones emphasized with 8 sets of antibodies
Specificare (Issue) n X ± X
s V%
Setul I de anticorpi Set I of antibodies
20 225,90
± 1,74 39,43
Setul II de anticorpi Set II of antibodies
10 192,40
± 1,59 56,97
Setul III de anticorpi Set III of antibodies
20 123,90
± 1,65 35,39
Setul IV de anticorpi Set IV of antibodies
30 160,60
± 0,93 27,30
Setul Vde anticorpi Set V of antibodies
30 167,23
± 1,48 32,72
Setul VI de anticorpi Set VI of antibodies
30 213,47
± 0,98 34,99
Setul VII de anticorpi Set VII of antibodies
20 175,50
± 1,31 39,66
Setul VIII de anticorpi Set VIII of antibodies
20 158,90
± 1,19 22,87
0
50
100
150
200
250
I II III IV V VI VII VIII
Număru
l de
neu
roni o
vini
evid
enŃiaŃ
i cu c
ele
8 se
turi d
e
antico
rpi u
tiliz
ate
Setul de anticorpi
Media Coeficientul de variabilitate, V%
Fig. 18. Mediile numărului de neuroni ovini evidenŃiaŃi cu cele 8 seturi de anticorpi şi coeficienŃii de variabilitate
The averages of the number of sheep neurons emphasized with all 8 sets of antibodies and coefficients of variability (original)
Celule stem umane au fost identificate doar când testarea s-a efectuat cu setul VIII de
anticorpi. S-a obŃinut o valoare medie de 4,80 celule şi un coeficient de variabilitate foarte
ridicat, respectiv 36,04%.
Dacă ne raportăm la numărul total de celule din creier evidenŃiate cu ajutorul Setului
de anticorpi VIII (tabelul 3), constatăm că numărul de celule stem umane identificate
reprezintă doar 0,63% din acestea şi 3,02% din numarul de neuroni ovoni evidentiati.
Tabelul 3
Mediile şi parametrii dispersiei pentru celulele stem umane evidenŃiate cu setul de anticorpi VIII
Table 3 The averages and dispersion parameters for the human stem cells emphasized
with VIII th set of antibodies
Specificare (Issue) n X ± X
s V%
Setul VIII de anticorpi Set 8 of antibodies
20 4,80
± 0,39 36,04
CAPITOLUL VIII
CONCLUZII
1. În urma efectuării experimentului de testare a posibilităŃii utiliz ării tehnicilor de
colorare (staining) a celulelor stem neuronale din Ńesut ovin cu o serie de anticorpi
monoclonali, a rezultat următoarea concluzie:
Setul de anticorpi 1, constituit din anticorpii primari Synaptophisin şi NPT II, iar ca
anticorpi secundari Alexa 488 şi Alexa 633, nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii
celulelor stem neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi perfecŃionată în
Laboratorul Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada, SUA.
2. Nici setul de anticorpi 2, constituit din anticorpul primar DsRed murin şi anticorpul
secundar Alexa 488 de capră antimurin, nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii
celulelor stem neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi perfecŃionată în
Laboratorul Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada, SUA.
Şi în acest caz presupunem că structura acestora nu se pretează la formarea cu celulele
stem a unui compex ce produce fluorescenŃă, vizibil la microscopul confocal.
3. Rezultatele au fost, de asemenea, negative şi în cazul setului de anticorpi 3,
constituit din anticorpii primari CD 31 murini şi Cytokeratina 20 murin şi cu anticorpul
secundar Alexa 488 capră anti-murin, care nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii
celulelor stem neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi perfecŃionată în
Laboratorul Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada, SUA.
Rezultatele noastre arată că nici structura anticorpilor primari CD 31 murini şi
Cytokeratina 20 murin şi cu anticorpul secundar Alexa 488 capră anti-murin nu este
compatibilă cu celulele stem în vederea constituirii unui compex ce produce fluorescenŃă,
vizibil la microscopul confocal.
4. Setul 4 de anticorpi, constituit din anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi
DsRed monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa 633 de capră anti iepure şi Alexa
488 de capră anti murin nu se pretează la utilizare în vederea evidenŃierii celulelor stem
neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi perfecŃionată în Laboratorul
Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada, SUA.
Presupunem că structura acestora nu se pretează la formarea cu celulele stem a unui
compex ce produce fluorescenŃă, vizibil la microscopul confocal.
5. Nici setul de anticorpi 5, 6 şi 7 nu s-au obŃinut rezultatele dorite.
6. Rezultatele au fost pozitive în cazul setului de anticorpi 8, constituit din anticorpii
primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A, iar ca anticorpi secundari Alexa 488
de capră anti iepure şi Alexa 594 capră anti murin, care nu se pretează la utilizare în vederea
evidenŃierii celulelor stem neuronale din Ńesut ovin prin tehnica de colorare dezvoltată şi
perfecŃionată în Laboratorul Departamentului de Biotehnologii a UniversităŃii Reno, Nevada,
SUA.
Rezultatele arată că structura anticorpului primar DsRed de iepure împreună cu
anticorpul secundar Alexa 488 de capră anti iepure este compatibilă cu celulele stem în
vederea constituirii unui compex ce produce fluorescenŃă vizibil la microscopul confocal.
7. MenŃionăm că este pentru prima dată când acest tip de testări a fost efectuatpe celule
stem neuronale.
8. Este necesară continuarea şi extinderea cercetărilor în vederea identificării altor
anticorpi a căror structură prezintă disponibilitate pentru evidenŃierea celulelor stem umane
neuronale.
9. Prin tehnica citometriei în flux continuu s-au determinat anticorpii care pot identifica
celulele stem umane existente în creierul fetal ovin, cât şi cantitatea în care acestea se găsesc
în fiecare individ analizat.
10 Prin analiza globală a datelor obŃinute după fluorocitometrie în flux se pot constata
următoarele: cel mai mare procent de grefare a celulelor stem umane în creierul fetal ovin în
valoare de 37,26 % s-a obŃinut la individul cu numărul 2183, iar cel mai mic procent de
grefare al celulelor stem umane în creierul fetal ovin , în valoare de 0,91 % a fost obŃinut la
individul cu numarul 2179.