UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII Ing. Receanu Cristina Monica Cercetări privind utilizarea anticorpilor monoclonali şi policlonali în evidenŃierea celulelor stem umane neuronale în creierul fetal ovin (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT) CONDUCĂTOR ŞTIINłIFIC Prof. Dr. Ing. Vlaic Augustin Cluj-Napoca 2010
35
Embed
Ing. Receanu Cristina Monica - usamvcluj.ro · Celulele stem specifice Ńesutului sunt de asemenea depozitate în diferite nişe din corp, precum m ăduva osoas ă, creier, ficat
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
Ing. Receanu Cristina Monica
Cercetări privind utilizarea anticorpilor monoclonali şi policlonali în
evidenŃierea celulelor stem umane neuronale în creierul fetal ovin
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCĂTOR ŞTIINłIFIC
Prof. Dr. Ing. Vlaic Augustin
Cluj-Napoca
2010
INTRODUCERE
Pentru prima data celulele stem au fost izolate din masa celulară internă a
blastocistului şi crescute in vitro . Variante ale acestor tehnici de obŃinere şi cultivare sunt
utilizate şi astăzi în laboratoarele din întreaga lume.
Cele mai importante publicaŃii legate de celulele stem au fost centralizate în anii 2001
şi 2002 de către R. Edwards.
Creşterea embrionului preimplantaŃional in vitro a constituit tema de cercetare a
multor echipe, pioneratul realizându-l Heope în 1980, care a obŃinut produşi de la iepuroaică,
după transferul embrionar la receptoare. (Gottlieb, D.I. and Huettner, J.E., 1999).
Primele cercetări privind cultivarea in vitro a celulelor stem (fig. 1) au fost realizate în
1963, de către J. Paul şi E. Edwards, care au pregătit pentru cultivare un grup de celule din
embrion de iepure preimplantaŃional, în picături de NCTC 109, 199, F10. (Theise, N.D.,
2000).
O celulă stem deŃine două proprietăŃi principale: capacitate de autoreînnoire pe termen
lung fără senescenŃă şi pluripotenŃă şi abilitatea de a se diferenŃia în una sau mai multe tipuri
de celule specializate. Aceste celule pot furniza o sursă inepuizabilă de celule pentru
transplant. Celulele stem totipotente care au abilitatea de a genera toate tipurile de Ńesut joacă
un rol critic în dezvoltarea umană, furnizând materialul pentru dezvoltarea tuturor Ńesuturilor
şi organelor în embrion şi în toate Ńesuturile extra embrionare.
Celulele stem specifice Ńesutului sunt de asemenea depozitate în diferite nişe din corp,
precum măduva osoasă, creier, ficat şi piele, ca un mecanism pentru menŃinerea Ńesutului,
creşterea acestuia şi reînnoirea la maturitate. La început s-a crezut că aceste celule stem adulte
regenerau doar un set foarte restrâns de linii celulare, dar s-a demonstrat cu timpul că au o
plasticitate mult mai mare.
CAPITOLUL I
IMPORTAN łA CELULELOR STEM
Bolile neurodegenerative sunt caracterizate de către deteriorările graduale şi
progresive sau pierderea celulelor nervoase şi a Ńesutului neural. Bolile cunoscute sunt
Alzheimer, Parkinson şi Scleroza multiplă. DisfuncŃiile neurodegenerative afectează peste 22
de milioane de persoane din întreaga lume. Unele tratamente simptomatice au devenit posibile
în ultimii 15 ani, dar încă nu s-a descoperit tratamentul complet al acestor boli.
Sclerozele multiple produc distrugerea treptată a creierului şi a foiŃei de mielină
protectoare a neuronilor coloanei vertebrale cu progres înspre boli ireversibile. Se estimează
că peste 2,5 milioane de persoane de pe Glob suferă de această boală. Acest număr include şi
pe cele 10000 de persoane din România. S-a dovedit că din celulele stem embrionare şi din
cele provenite din surse fetale se pot genera celule neuronale ce pot fi folosite pentru a
înlocui neuronii pierduŃi. Celulele stem mezenchimale dau neuronilor capacitatea de a migra
prin creier şi măduva spinării la locurile din Ńesut unde sunt prezente disfuncŃii sclerotice
1.1.CELULELE STEM - CARACTERIZARE GENERALĂ
Celulele stem sunt celule primare nediferenŃiate, care deŃin abilitatea da a se diferenŃia
în alte tipuri de celule. În această categorie intră atât celulele măduvei osoase şi celulele
sângelui periferic, cât şi celulele embrionare, a căror capacitate de diferenŃiere ajunge până la
200 de alte linii celulare diferite, proprietate care denumită plasticitate evolutivă (Erghelegiu,
muschi neted colorează miocitele netede, celule mioepiteliale şi miofibroblastele).
►Controlul negativ intern – anticorpul nu colorează substraturi care potenŃial sunt
negative (e.g. citokeratina 8 nu colorează epiteliile scuamoase; desmina nu colorează celulele
epiteliale sau conjunctive ).
5.3.1. Protocolul de imunohistochimie
I. Pentru Ńesuturi fixate în parafină
1.Se înlătură parafina, folosindu-se xylenă. Se lasă lamele în această soluŃie 10 minute,
la temperatura camerei. Dacă este necesar se repetă pâna la îndepartarea totală a
parafinei.
2.Are loc rehidratarea Ńesutului de pe lamă, prin transfer repetat în soluŃii de etanol de
concentraŃii 100 %, 95 % şi 75 %, timp de câte un minut în fiecare concentraŃie. La
final se lasă în apă un minut.
3.Se incubează în soluŃie de antigen retrival (soluŃie de recuperare a antigenului) la
temperature de 93ºC, timp de 5 minute, apoi se lasă să se răcească la temperature
camerei.
4. Se lasa în soluŃie de PBS.
După efectuarea acestor paşi, lamele cu Ńesutul fixat sunt pregătite pentru colorarea cu
ajutorul anticorpilor primari şi secundari, în scopul de a evidenŃia celulele de interes.
II. Pentru Ńesuturi fixate în parafină şi blocuri de gheaŃă
1. Se clătesc lamele în PBS de 3 x 5 minute
5. Se incubează în soluŃie NGS, care este un buffer – soluŃie tampon (formată din PBS + 10
% ser normal de capră), timp de 1 oră, la 4ºC, sau 15 – 30 minute la temperatura camerei
6. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 2 x 5 minute
7. Se incubează cu anticorpul primar diluat cu PBS + 2 % NGS timp de 3 ore la temperatura
camerei, sau peste noapte la 4ºC într o cameră umidificată. Anticorpul primar se pune pe
toate lamele, mai puŃin pe lama de control negativ, pe care se pune doar anticorpul secundar.
8. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 3 x 5 minute
9. Se incubează cu anticorpul secundar, diluat în PBS + 2 % NGS, timp de 1 oră la
temperatura camerei. Anticorpul secundar se pune pe toate lamele, în cantitate de 2,5 µl/
lamă.
10. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS + 2 % NGS, de 3 x 5 minute.
11. Se clătesc lamele cu soluŃie de PBS
12. Se adaugă pe fiecare lamă câteva picături din colorantul DAPI şi se lasă 5 minute. Dacă
nu există DAPI, se poate folosi soluŃie HOECHST, în diluŃie de 1 µl/ 5 ml PBS
13. Se clăteşte cu soluŃie de PBS
14. Se uscă lamele la temperatura camerei şi se sigilează cu lamela, folosind Cytoseal 60
pentru sigilarea lamelor .
5.4. IMPORTANłA TEHNICII DE COLORARE
Tehnica staining este procedura prin care un specimen histologic este vizualizat cu
rezoluŃie maximă prin fixarea lui pe o lamă plasată pe suportul situat pe fanta luminoasă a
microscopului.
Stainingul este o tehnică auxiliară folosită în microscopie, pentru a amplifica
contrastul în imaginea văzută la microscopul electronic.
În biochimie la această tehnică sunt folosiŃi la substrat şi coloranŃi specifici ADN-ului,
proteinelor, lipidelor şi carbohidraŃilor, pentru a califica şi cuantifica prezenŃa componenŃilor
specifici.
Această tehnică e foarte folosită în biologie şi medicină pentru a evidenŃia structuri în
Ńesutul biologic. Stainingul mai poate fi folosit pentru a defini şi examina fibre musculare sau
Ńesut conjunctiv, populaŃii de celule sau organite celulare.
5.5.TESTAREA SETURILOR DE ANTICORPI 5.5.1. Testarea primului set de anticorpi prin efectuarea unei coloraŃii duble, pe Ńesuturi
fixate in parafina parafină
5.5.1.1. Rezultate şi discuŃii
La testul 1, la care s-au folosit anticorpii primari Synaptophisina murină şi NPT II de
iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure, deşi au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi
succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele aşteptate.
În figura 5 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2246.
Fig.5. Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari Synaptophisină murină şi NPT II de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de capră anti iepure
(original)
În literatură nu au fost găsite date care să facă referire la testarea acestor anticorpi în
evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente în creierul fetusului ovin.
5.5.2. Testarea celui de-al II- lea set de anticorpi prin efectuarea unei coloraŃii simple,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2269.
S-a efectuat o coloraŃie simplă pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele
umane şi ovine, folosindu-se ca şi anticorp primar DsRed murin, iar ca anticorp secundar
Alexa Flor 488 de capră anti murin. S-au folosit 10 lame.
5.5.2.1. Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 2, au fost utilizaŃi anticorpul primar DsRed murin, iar ca anticorp
secundar Alexa Flor 488 de capră anti murin. Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu
stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃia şi succesiunea de reacŃii recomandate de
protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele aşteptate.
În figura 6 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2246.
Fig.6. ColoraŃie, cu anticorpul primar DsRed murin şi anticorpul secundar Alexa Flor 488 de
capră anti murin (oroginal)
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.3. Testarea celui de-al III- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2267. S-a efectuat o dublă coloraŃie
pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, folosindu-se ca şi
anticorpi primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murin, iar ca anticorpi secundari Alexa
Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 capră anti murin. S-au folosit 20 lame.
5.5.3.1. Rezultate şi discuŃii
Nici testul 3 care a fost efectuat cu anticorpii primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20
murin, iar ca anticorpi secundar Alexa Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 de capră
anti murin, nu a condus la obŃinerea rezultatelor aşteptate. MenŃionăm că şi în acest caz, au
fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi succesiunea de reacŃii
recomandate de protocoale.
În figura 7 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2267.
Fig.7. Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari CD 31 murin şi Cytokeratina 20 murin şi cu anticorpii Alexa Flor 488 capră anti-murin şi Alexa Flor 633 de capră anti murin(original)
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.4. Testarea celui de-al IV-lea set de anticorpi, prin efectuarea unei coloraŃii duble,
pe Ńesuturi din parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2248. S-a efectuat o dublă coloraŃie,
având la dispoziŃie 30 lame. Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi
ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed monoclonal
murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa Flor 488 de
capră anti murin.
5.5.4.1. Rezultate şi discuŃii
La testul 4, unde s-au folosit anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed
monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa
Flor 488 de capră anti murin., deşi au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 8 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2248.
Fig.8 . Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari UCHL1 policlonal, de iepure şi DsRed monoclonal murin, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 633 de capră anti iepure şi Alexa
Flor 488 de capră anti murin (original)
În literatură nu au fost găsite date care să facă referire la testarea acestor anticorpi în
evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente în creierul fetusului ovin.
5.5.5. Testarea celui de-al V-lea set de anticorpi, prin efectuarea unei coloraŃii duble, pe
Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2270. S-a efectuat o dublă coloraŃie,
având la dispoziŃie 30 lame. Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi
ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de
iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure.
5.5.5.1.Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 5, au fost utilizaŃi anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi
Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi
Alexa Flor 633 de capră anti iepure.
Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 9 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2270.
Fig.9 .Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure (original).
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.6. Testarea celui de-al VI- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2280. S-a efectuat o dublă coloraŃie,
având la dispoziŃie 30 lame. Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi
ovine, s-au folosit ca şi anticorpi primari Oligodendrocyte murin şi Chromatogranină A de
iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure. .
5.5.6.1.Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 6, au fost utilizaŃi anticorpii primari Oligodendrocyte murin şi
Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin
şi Alexa Flor 633 de capră anti iepure .
Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 10 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2280.
Fig.10 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari Oligodenrdocyte murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 594 de capră anti murin şi Alexa Flor 633 de
capră anti iepure (original).
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.7. Testarea celui de-al VII- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble coloraŃii,
pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-a folosit individul cu numărul 2281. S-a efectuat o dublă coloraŃie
pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, folosindu-se ca şi
anticorpi primari DsRed murin şi Chromatogranina A de iepure, iar ca anticorpi secundari
Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 de capră anti iepure. S-au folosit 20
lame.
5.5.7.1.Rezultate şi discuŃii
În cazul testului 7, au fost utilizaŃi anticorpii primari DsRed murin şi Chromatogranină
A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594
de capră anti iepure .
Şi în acest caz, cu toate că au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie,
concentraŃie şi succesiunea de reacŃii recomandate de protocoale, nu s-au obŃinut rezultatele
aşteptate.
În figura 11 se poate observa că a avut loc colorarea, dar nu s-a putut face identificarea
celulelor stem umane, deci nu s-a putut stabili existenŃa lor în creierul individului cu numărul
2281.
Fig.11 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 de capră anti
iepure (original)
Nici pentru acest set de anticorpi nu au fost găsite în literatură date care să facă
referire la testarea acestor anticorpi în evidenŃierea celulelor stem neuronale umane existente
în creierul fetusului ovin.
5.5.8. Testarea celui de-al VIII- lea set de anticorpi prin efectuarea unei duble
coloraŃii, pe Ńesuturi fixate in parafină
Pentru efectuarea acestui test, în scopul evidenŃierii celulelor stem umane existente în
creierul fetusului ovin, s-au folosit indivizii 2270, 2271, 2272, 2273, 2274. S-a efectuat o
dublă coloraŃie, având la dispoziŃie cate 4 lame de la fiecare individ, adică 20 lame.
Pentru a se putea face mai uşor diferenŃa între celulele umane şi ovine, s-au folosit ca
şi anticorpi primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca
anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594 capră anti iepure.
5.5.8.1.Rezultate şi discuŃii
Testul 8 care a fost efectuat cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi
Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi
Alexa Flor 594 capră anti iepure.
Este singurul test care a condus la obŃinerea rezultatelor aşteptate. MenŃionăm că şi în
acest caz, au fost respectate cu stricteŃe condiŃiile de reacŃie, concentraŃie şi succesiunea de
reacŃii recomandate de protocoale.
În figura 12 se poate observa că a avut loc colorarea şi s-a putut face identificarea
celuleor stem uname, deci s-a putut stabili existenŃa lor în creierul tuturor indivizilor
analizaŃi, care a avut o reacŃie pozitivă la anticorpul primar DsRed murin şi Chromatogranină
A de iepure împreună cu anticorpii secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa
Flor 594 capră anti iepure.
Fig. 12 Dublă coloraŃie, cu anticorpii primari DsRed monoclonal murin şi Chromatogranină A de iepure, iar ca anticorpi secundari Alexa Flor 488 de capră anti murin şi Alexa Flor 594
capră anti iepure (original).
CAPITOLUL VI CARACTERIZAREA ANTICORPILOR CU AJUTORUL TEHNICII DE
CITOMETRIE ÎN FLUX CONTINUU
Citometria în flux este o tehnologie care permite unei singure celule să fie măsurată
pentru o varietate de caracteristici, măsurătorile fiind determinate doar prin observarea
celulelor la trecerea printr-un lichid. Instrumentele folosite pentru acest lucru pot aduna
informaŃii despre celulele, prin măsurarea emisiilor de lumină vizibilă şi fluorescentă, care să
permită o triere a celulelor bazate pe trăsături fizice, biochimice şi antigenice
(http://en.wikipedia.org/wiki/ Flow_cytometry)
6.1. MATERIALE ŞI METODE
6.1.1. Materiale utilizate
A). Materiale biologice:
Ca şi materiale biologice au fost folosite: Creier fetal ovin, Celule stem provenite din
linii celulare existente în banca de celule a laboratorului din Reno, Nevada, sânge fetal ovin
B). Materiale chimice:
-coloranŃi fluorescenŃi- FITC (fluorescein izotiocianat), PE (ficoeritrină), APC