Il Laboratorio nelle malattie reumatiche
Dott. Cristiano Alessandri
Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche
UOC Reumatologia
Corso di laurea magistrale “C” Paologia Integrata IV
Prof F. Conti
• fornire elementi utili alla diagnosi
• contribuire a formulare una prognosi
• contribuire a valutare la risposta alla terapia
• non essere dannosi/pericolosi per il paziente
• essere di costo contenuto
CARATTERISTICHE IDEALI…….
Sensibilità
probabilità di un risultato positivo nel soggetto malato (percentuale di veri positivi nella popolazione di malati)
Specificità
probabilità di un risultato negativo nel soggetto sano (percentuale di veri negativi nella popolazione di
soggetti sani)
Il Laboratorio nelle malattie reumatiche
Tests di laboratorio nelle malattie reumatiche
• Reattanti di fase acuta
• Protidogramma
• Complemento
• Autoanticorpi
Reattanti di fase acuta
• Gruppo di proteine prodotte nella maggior parte dei casi dal fegato la cui sintesi aumenta in corso di infiammazione e necrosi tissutale.
• Comprendono fibrinogeno, transferrina, C3, C4, proteina C reattiva, proteina A dell’amiloide, etc
Velocità di eritrosedimentazione (VES)
Si misura in provetta graduata cilindrica dopo 1 ora ed aumenta in rapporto alla concentrazione delle proteine di fase acuta ed in particolare del fibrinogeno
Aumenta in:
• malattie infiammatorie
• anemia
• gravidanza
• obesità
• necrosi tissutale (infarto miocardico, ictus)
Velocità di eritrosedimentazione (VES)
Correlazione tra VES e malattie
Aumento notevole
(>100 mm/h)
Arterite a cellule giganti
Polimialgia reumatica
Altre vasculiti
Artrite settica
Aumento medio
Artrite reumatoide
Artrite psoriasica
Artrite reattiva
Gotta
Connettiviti
Valori normali Artrosi
Condrocalcinosi
Diminuzione
Afibrinogemia
Agammaglobulinemia
Policitemia
Proteina C reattiva
• Proteina del gruppo delle pentraxine.
• Lega la fosfocolina, costituente della parete di molti batteri e funghi.
• La PCR lega la fosfocolina del foglietto esterno delle membrane di cellule apoptotiche.
• Ha emivita di 19 ore
• Sale 8-10 ore dopo stimoli flogistici ed aumenta fino a
100 volte la sua concentrazione
• IL6 è il principale induttore del gene della PCR
• IL1 agisce sinergisticamente con IL6
Proteina C reattiva
Cirrosi Epatica Infiammazione acuta
Infiammazione cronica
Sindrome nefrosica
Gammopatia policlonale Ipogammaglobulinemia
Complemento nelle malattie reumatiche
• Il complemento è necessario per l’eliminazione di immunocomplessi e cellule apoptotiche
• Il deficit di C1q, C4 e in minor misura di C2 si associa a LES
• Il complemento è il principale mediatore del danno da immunocomplessi
• Nel LES c’è deficit acquisito del complemento per accelerato consumo (da immunocomplessi circolanti o in situ)
Significato del dosaggio del complemento nelle malattie reumatiche
ipercomplementemia C3 e C4 si comportano come proteine della fase acuta
ipocomplementemia
Deficit congeniti
Perdite proteiche
Epatopatie
Consumo
Risposta immunitaria inefficace
Cellule effettrici
Anticorpi
Complemento
citochine
Persistenza dello
stimolo
antigenico
Malattia INFIAMMATORIA CONICA IMMUNOMEDIATA
La risposta immune anticorpale o cellulo-mediata ad antigeni self è una caratteristica fondamentale
delle malattie autoimmuni
Classificazione delle Reazioni da ipersensibilità
TIPO Meccanismo Patogenetico Meccanismo di danno
tissuatale
TIPO I:
Ipersensibilità immediata IgE
Degranulazione mastociti
Reazioni allergiche
TIPO II:
Mediata da anticorpi
IgG, IgM contro Ag cellulari e/o extracellulari
Opsonizzazione
Fagogitosi
Recruitment leucocitario
(Complemento + Fc)
Alterazione recettoriali
TIPO III:
Mediata da immunocomplessi
Immunocomplessi circolanti
Recruitment leucocitario
(Complemento + Fc)
TIPO IV: ipersensibilità ritardata
CD4+ T cells (ipersensibilità)
CD8+ T cells (citolisi)
Attivazione macrofagica
Lisi cellulare
Infiammazione citochine correlata
AUTOANTICORPI
immunoglobuline contro antigeni self
extracellulari (proteine, glicolipidi, lipidi)
cellulari (nuleo citoplasma, membrane cellulari)
Oggi parleremo di anticorpi……………
Antinucleo (ANA) Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP) Antifosfolipidi Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)
• 1948 – Malcolm Hargraves discovers the lupus
erythematosus (LE) cell.
History
LE cell The LE cell is a neutrophil that
has engulfed the antibody-
coated nucleus of another
neutrophil.
ANTICORPI ANTINUCLEARI
(ANA)
Immunofluorescenza indiretta (IFI) su cellule Hep-2
pattern di fluorescenza
ANA negativo Omogeneo Granulare Nucleolare Omogeneo e Nucleolare Centromero (CREST) Finemente punteggiato
ANTICORPI ANTINUCLEARI
(ANA)
Patologia Pazienti con ANA (%)
LES 99
Sclerosi Sistemica 97
Sindrome di Sjögren 96
Connettivite Mista 93
Poli-dermatomiosite 78
ANTICORPI ANTINUCLEO
ANA
ANTICROMATINA
Antinucleosoma
Anti-ssDNA
Anti-dsDNA
Anti-Istoni
ENA
Sm
RNP
SSA/Ro
SSB/La
SCL70
Jo1
….
anticentromero Altri
Fuso mitotico
MND
PCNA
….
CRITERI CLASSIFICATIVI LES ACR 1997
1. Rash malare
2. Rash discoide
3. Fotosensibilità
4. Ulcere orali
5. Artrite non erosiva che interessi almeno due articolazioni
6. Sierositi
7. Nefropatia
a. proteinuria persistente
b. sedimento patologico
8. Manifestazioni neuropsichiatriche
9. Disordini ematologici
a. anemia emolitica
b. leucopenia* ( < 4000/mm³ )
c. linfopenia* ( < 1500/mm³ )
d.trombocitopenia* (< 100.000/mm³ )
(*in almeno due determinazioni )
10. Disordini immunologici
a. presenza di anticorpi anti-ds-DNA
b. presenza di anticorpi anti-Sm
c. presenza antifosfolipidi
11. Presenza di ANA (non collegata all ’ assunzione di farmaci che possono indurre tale fenomeno)
FREQUENZA ANOMALIE SIEROLOGICHE
all’esordio % in totale % ________________________________________________________ ANA 76 99 anti-dsDNA 34 71 anti-Sm 31 49 anti-RNP 21 35 anti-Ro/SSA 33 67 anti-La/SSB 27 49 Ipocomplementemia 44 77 (da Lahita)
•Anticorpi specifici del LES
•Prevalenza circa 70% dei casi
Metodica:
IFI su Crithidia luciliae
emoflagellato che presenta un cinetoplasto (mitocondrio) con DNA a doppia elica
Anti-ds DNA
Negativo Positivo
A direct pathogenic role for a-DNA is suggested by the
correlation of serum antibody levels with nephritis,
the temporal association of the rising titers with
with increased disease activty and the presence of
a-DNA in glomerular immune deposits in human and mice
with active nephritis.
NEFRITE LUPICA: anti-DNA
Autoanticorpi anti-ENA
• Anti-Sm
• Anti-SSA/Ro
• Anti-SSB/La
PRINCIPALI SPECIFICITA’ AUTOANTICORPALI
• Anti-U1RNP
• Anti-topois. I
• Anti-Jo1
SSA/Ro
• proteine: Ro52 e Ro60 kD
• RNA (hY1-hY5)
• funzione ?
• localizzazione nucleare e citoplasmatica
SSB/La
• fosfoproteina La 46/48 kD
• trascritti RNA polimerasi III
• elevata solubilità
• Distribuzione prevalentemente nucleare
LUPUS NEONATALE
LES
Sjogren
Altre connettiviti
Asintomatiche
Anti-Ro/La
IgG Anti-Ro/La
IgG
placenta
Permanenti Transitori
BloccoAV
Cardiomiopatia
QT lungo (?)
Rash
Citopenie
Epatite
LES ANA negativo
Esiste un piccolo subset di pazienti con LES con ANA negativi su substrati murini all’IFI (Gladman, 1978; Fessel, 1977; Maddison, 1981).
su 76 sieri ANA neg su mouse 100% hanno anti-Ro, 46% hanno anti-La. 35% hanno anti-RNP in ELISA
1 solo paz. 3 criteri x LES
SCLE
Multisystemic disease
Lazy gland syndrome
Autoimmune exocrinopathy
Autoimmune epithelitis
SJÖGREN’S SYNDROME
“… a relatively common autoimmune disease characterized by dysfunction and destruction of exocrine glands associated with lymphocytic infiltrates” (Moutsopoulos H.M.)
DRY MOUTH, DRY EYES, AUTOIMMUNE FEATURES
Oggi parleremo di anticorpi……………
Antinucleo (ANA)
Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP)
Antifosfolipidi
Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)
Systemic autoimmune disease with chronic inflammation of the
synovial joints
POOR PROGNOSIS EARLY DIAGNOSIS
AGGRESSIVE TREATMENT
Rheumatoid Arthritis
• Almeno quattro dei seguenti criteri
• Rigidità mattudina > 1 ora • Artrite di 3 o più articolazioni • Artrite delle mani • Artrite simmetrica • Noduli reumatoidi • Fattore reumatoide • Alterazioni radiologiche
American College of Rheumatology (ACR) Classification Criteria
Presenti almeno per sei settimane
…ACR criteria are not very well suited to diagnosing RA at an early stage…
Fattore Reumatoide (FR)
Anticorpi diretti contro regione Fc delle IgG
Isotipo prevalente IgM, ma anche IgA e IgG
Rheumatoid arthritis is an autoimmune
disease characterized by autoantibodies
directed to citrullinated antigens
Anti-filaggrin Ab anti-perinuclear factor (APF)
Nienhuis RLF, Mandena EA. Ann Rheum Dis 1964; 23: 302-305.
Profilaggrin
defosforilazione
Clivaggio proteico
Filaggrin
Citrullinazione enzimatica
peptidyl arginine deaminase (PAD)
citrullinated filaggrin Cheratinizzazione
Epidermide
ACPA = anticorpi anti proteine/proteine
citrullinati
Anti-CCP = anticorpi anti peptidi ciclici
citrullinati
ANTI-CCP
ACPA
Citrullination of proteins is a process occurring almost exclusively in dying cells
During cell death (apoptosis or necrosis) the
cell membrane becomes leaky allowing an unlimited
influx of extracellular Ca2+ ions.
PAD enzymes become activated
Due to the loss of positive charge the citrullinated protein
looses intramolecular and intermolecular interactions
the dying process is profoundly accelerated by the citrullination of intracellular
proteins
Citrullinated proteins in the arthritic joint
…we have demonstrated that the amounts of
citrullinated proteins and the enzyme PAD4 in the
arthritic joints of experimental animals
correlated with the severity of inflammation,
Infitrating cells cartilage
PAD4 in the arthritic joint
Infiltrating cells mononuclear cells
Reparon-Schuijt CC, et al. Arthritis Rheum 2001; 44: 41-47.
Proteine citrullinate e flogosi articolare
Secretion of anti-citrulline-
peptide antibody by B lymphocytes
in rheumatoid arthritis”.
Genetic & environment background
The HLA-DRB1 1001 SE is strongly associated with the production of anti-CCP antibodies, but not RF
AR 2005;52:3813-8.
The gene-environment interaction between smoking and HLA-DRB1 SE leading to autoantibodies is specific for RA
ARD 2005.
A systematic review of the published literature
(68 publications assessed)
1999-2006
1885 normal healthy subjects: anti-CCP2 6/1561 (0,4%)
Anti-CCP presenti molto precocemente nell’AR
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
0246810
anni prima dei sintomi%
po
sit
ività a
nti
CC
P-2
L’Anti-CCP può
essere rilevato
anni prima dei
sintomi iniziali di
AR
Adattato da: Rantapää-Dahlqvist et al, Arth Rheum 2003,48:2741-49
“…a diagnostic criteria set for RA was developed, characterized by
an excellent ability to discriminate,
at the first visit, between self-limiting, persistent nonerosive,
and persistent erosive arthritis...”
Take Home messages
(1) Antibodies to citrullinated antigens are present early in disease and very specific for rheumatoid arthritis. (2) Data from the literature clearly shows that the CCP2 test is the best tool to measure specific antibodies in RA. (3) Despite the fact that patients in the early phase of the disease show a very similar clinical presentation, the use of the CCP2 test allows the clinician to distinguish two subclasses of patients (CCP(+) and CCP(-)RA), each with their own genetic background and future development of the disease. (4) Anti-citrullinated protein antibodies have recently been added to the ACR/EULAR criteria for the classification of rheumatoid arthritis.
Oggi parleremo di anticorpi……………
Antinucleo (ANA)
Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP)
Antifosfolipidi
Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)
CRITERI CLINICI
(1) TROMBOSI VASCOLARI
arteriose e/o venose
(2) PATOLOGIA GRAVIDICA
a. una o più morti fetali (>10 sett)
b. una o più nascite premature
c. tre o più aborti spontanei
consecutivi (<10 sett)
CRITERI DI LABORATORIO
(1) ANTICORPI ANTICARDIOLIPINA
e ANTI-β2-GPI
IgG e/o IgM a titolo medio alto in due
o più occasioni a distanza di almeno
dodici settimane, testati con ELISA
(b2-GPI dipendente per aCL)
(2) LUPUS ANTICOAGULANT
Metodiche coagulatorie con test di
conferma in due o più occasioni a
distanza di almeno dodici settimane
Systemic APS
• CUTE (e.g. Livedo Reticularis, necrosi cutanea)
• CUORE (e.g. endocardite non verrucosa)
• RENI (e.g. stenosi arteria renale)
• POLMONI (e.g. ipertensione polmonare)
• ENCEFALO (e.g. epilessia)
• SIST. CARDIOVASCOLARE (e.g. aterosclerosi)
• OCCHI (e.g. neurite ottica)
• UDITO (e.g. sordità improvvisa)
• PLACENTA (e.g. morte fetale)
• SIST GASTROENTERICO (e.g. Budd Chiari)
• SANGUE (e.g. trombocitopenia)
• ….
Euro-Phospholipid Project Group: cohort of 1000
patients Arthritis & Rheumatism 2002; 46: 1019-1027 • Trombosi venosa profonda 38.9 % • Stroke 19.8 % • Embolia polmonare 14.1 % • Tromboflebite supeficiale 11.7 % • TIA 11.1 %
Patologia gravidica (1.580 gravidanze)
• Aborti precoci (< 10 sett) 35.4 % • Aborti tardivi (> 10 sett) 16.9 % • Nascita prematura 10.6 % • Preeclampsia 9.5 %
LAC
aProtrombina
Anti
sulfatidi
ab2GPI
aCL
aPL
…..?
Alessandri C & Valesini G. “New facet of antiphospholipid antibodies”. Ann New York Acc Sci 2005.
aPS
Anti-annessina V
aLBPA
Determinazione del Lupus Anticoagulant (LAC) Brandt JT et al. Thromb Haemost 1995;74:1185-1190.
Step 1: LAC probabile se almeno un test risulta allungato * tempo di tromboplastina parziale attivato (APTT) * Russel viper venom time (RVVT) * Kaolin clotting time (KCT) Step 2: LAC positivo se il test rimane alterato * Mixing test: aggiunta di plasma normale al plasma del paziente
Step 2: LAC positivo se il test si normalizza * Test di neutralizzazione: aggiunta di fosfolipidi o piastrine scongelate al plasma del paziente
Nel 1990 tre laboratori dimostrarono che il legame tra
aCL e l’antigene richiede la presenza di un cofattore
proteico identificato nella b2–glicoproteina I (b2-GPI)
Mc Neil HD et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990
Galli M et al. Lancet 1990
Matsuura H et al. Lancet 1990
b2-glicoproteina I
b2-GPI, apolipoproteina H, è una
glicoproteina di 50 kDa, 326 aa,
concentrazione plasmatica di
circa 200 g/ml
LIPID RAFTS
TLR4
ANNEXIN A2
CD14
b2-GPI
ENDOTHELIAL/MONOCYTIC CELLS
aPLs
IRAK phosphorylation
NF-kB / IKB complex
NF-kB translocation
?
TNFa TF
CAMs
C.A. 2010
Rischio più elevato:
Sogetti positivi per LAC o con alti titoli di IgG aCL e aB2-GPI.
Rischio trombotico
Il rischio è notevolmente aumentato se:
Anamnesi positiva per pregressi eventi trombotici o aborti
Coesistenza di malattia autoimmunitarie (e.g LES)
Altri fattori di rischio tradizionali
Oggi parleremo di anticorpi……………
Antinucleo (ANA)
Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP)
Antifosfolipidi
Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)
vasculiti ANCA-associate
1) Granulomatosi di Wegener
2) Poliangite microscopica
3) Malattia di Churg e Strauss
c-ANCA (Pr3)
P-ANCA (MPO)
negativo
Poliangite Microscopica 40 50 10
Granulomatosi di Wegener 70 25 5
Malattia di Churg e Strauss
10 60 30
vasculiti ANCA-associate
Dott. Cristiano Alessandri
Ricercatore MED 16, Reumatologia
Sapienza Università di Roma
0649974634
Grazie per l’attenzione …