Il Laboratorio nelle malattie reumatiche · QT lungo (?) Rash Citopenie Epatite . LES ANA negativo Esiste un piccolo subset di pazienti con LES con ANA negativi su substrati murini

Il Laboratorio nelle malattie reumatiche

Dott. Cristiano Alessandri

Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche

UOC Reumatologia

Corso di laurea magistrale “C” Paologia Integrata IV

Prof F. Conti

• fornire elementi utili alla diagnosi

• contribuire a formulare una prognosi

• contribuire a valutare la risposta alla terapia

• non essere dannosi/pericolosi per il paziente

• essere di costo contenuto

CARATTERISTICHE IDEALI…….

Sensibilità

probabilità di un risultato positivo nel soggetto malato (percentuale di veri positivi nella popolazione di malati)

Specificità

probabilità di un risultato negativo nel soggetto sano (percentuale di veri negativi nella popolazione di

soggetti sani)

Il Laboratorio nelle malattie reumatiche

Tests di laboratorio nelle malattie reumatiche

• Reattanti di fase acuta

• Protidogramma

• Complemento

• Autoanticorpi

Reattanti di fase acuta

• Gruppo di proteine prodotte nella maggior parte dei casi dal fegato la cui sintesi aumenta in corso di infiammazione e necrosi tissutale.

• Comprendono fibrinogeno, transferrina, C3, C4, proteina C reattiva, proteina A dell’amiloide, etc

Velocità di eritrosedimentazione (VES)

Si misura in provetta graduata cilindrica dopo 1 ora ed aumenta in rapporto alla concentrazione delle proteine di fase acuta ed in particolare del fibrinogeno

Aumenta in:

• malattie infiammatorie

• anemia

• gravidanza

• obesità

• necrosi tissutale (infarto miocardico, ictus)

Velocità di eritrosedimentazione (VES)

Correlazione tra VES e malattie

Aumento notevole

(>100 mm/h)

Arterite a cellule giganti

Polimialgia reumatica

Altre vasculiti

Artrite settica

Aumento medio

Artrite reumatoide

Artrite psoriasica

Artrite reattiva

Gotta

Connettiviti

Valori normali Artrosi

Condrocalcinosi

Diminuzione

Afibrinogemia

Agammaglobulinemia

Policitemia

Proteina C reattiva

• Proteina del gruppo delle pentraxine.

• Lega la fosfocolina, costituente della parete di molti batteri e funghi.

• La PCR lega la fosfocolina del foglietto esterno delle membrane di cellule apoptotiche.

• Ha emivita di 19 ore

• Sale 8-10 ore dopo stimoli flogistici ed aumenta fino a

100 volte la sua concentrazione

• IL6 è il principale induttore del gene della PCR

• IL1 agisce sinergisticamente con IL6

Proteina C reattiva

Protidogramma

Cirrosi Epatica Infiammazione acuta

Infiammazione cronica

Sindrome nefrosica

Gammopatia policlonale Ipogammaglobulinemia

Complemento nelle malattie reumatiche

• Il complemento è necessario per l’eliminazione di immunocomplessi e cellule apoptotiche

• Il deficit di C1q, C4 e in minor misura di C2 si associa a LES

• Il complemento è il principale mediatore del danno da immunocomplessi

• Nel LES c’è deficit acquisito del complemento per accelerato consumo (da immunocomplessi circolanti o in situ)

Significato del dosaggio del complemento nelle malattie reumatiche

ipercomplementemia C3 e C4 si comportano come proteine della fase acuta

ipocomplementemia

Deficit congeniti

Perdite proteiche

Epatopatie

Consumo

Risposta immunitaria inefficace

Cellule effettrici

Anticorpi

Complemento

citochine

Persistenza dello

stimolo

antigenico

Malattia INFIAMMATORIA CONICA IMMUNOMEDIATA

La risposta immune anticorpale o cellulo-mediata ad antigeni self è una caratteristica fondamentale

delle malattie autoimmuni

Classificazione delle Reazioni da ipersensibilità

TIPO Meccanismo Patogenetico Meccanismo di danno

tissuatale

TIPO I:

Ipersensibilità immediata IgE

Degranulazione mastociti

Reazioni allergiche

TIPO II:

Mediata da anticorpi

IgG, IgM contro Ag cellulari e/o extracellulari

Opsonizzazione

Fagogitosi

Recruitment leucocitario

(Complemento + Fc)

Alterazione recettoriali

TIPO III:

Mediata da immunocomplessi

Immunocomplessi circolanti

Recruitment leucocitario

(Complemento + Fc)

TIPO IV: ipersensibilità ritardata

CD4+ T cells (ipersensibilità)

CD8+ T cells (citolisi)

Attivazione macrofagica

Lisi cellulare

Infiammazione citochine correlata

AUTOANTICORPI

immunoglobuline contro antigeni self

extracellulari (proteine, glicolipidi, lipidi)

cellulari (nuleo citoplasma, membrane cellulari)

Immunofluorescenza indiretta (IFI)

Immunoenzimatica (ELISA)

Western blot (WB)

Oggi parleremo di anticorpi……………

Antinucleo (ANA) Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP) Antifosfolipidi Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)

• 1948 – Malcolm Hargraves discovers the lupus

erythematosus (LE) cell.

History

LE cell The LE cell is a neutrophil that

has engulfed the antibody-

coated nucleus of another

neutrophil.

ANTICORPI ANTINUCLEARI

(ANA)

Immunofluorescenza indiretta (IFI) su cellule Hep-2

pattern di fluorescenza

ANA negativo Omogeneo Granulare Nucleolare Omogeneo e Nucleolare Centromero (CREST) Finemente punteggiato

ANTICORPI ANTINUCLEARI

(ANA)

Patologia Pazienti con ANA (%)

LES 99

Sclerosi Sistemica 97

Sindrome di Sjögren 96

Connettivite Mista 93

Poli-dermatomiosite 78

ANTICORPI ANTINUCLEO

ANA

ANTICROMATINA

Antinucleosoma

Anti-ssDNA

Anti-dsDNA

Anti-Istoni

ENA

Sm

RNP

SSA/Ro

SSB/La

SCL70

Jo1

….

anticentromero Altri

Fuso mitotico

MND

PCNA

….

CRITERI CLASSIFICATIVI LES ACR 1997

1. Rash malare

2. Rash discoide

3. Fotosensibilità

4. Ulcere orali

5. Artrite non erosiva che interessi almeno due articolazioni

6. Sierositi

7. Nefropatia

a. proteinuria persistente

b. sedimento patologico

8. Manifestazioni neuropsichiatriche

9. Disordini ematologici

a. anemia emolitica

b. leucopenia* ( < 4000/mm³ )

c. linfopenia* ( < 1500/mm³ )

d.trombocitopenia* (< 100.000/mm³ )

(*in almeno due determinazioni )

10. Disordini immunologici

a. presenza di anticorpi anti-ds-DNA

b. presenza di anticorpi anti-Sm

c. presenza antifosfolipidi

11. Presenza di ANA (non collegata all ’ assunzione di farmaci che possono indurre tale fenomeno)

FREQUENZA ANOMALIE SIEROLOGICHE

all’esordio % in totale % ________________________________________________________ ANA 76 99 anti-dsDNA 34 71 anti-Sm 31 49 anti-RNP 21 35 anti-Ro/SSA 33 67 anti-La/SSB 27 49 Ipocomplementemia 44 77 (da Lahita)

•Anticorpi specifici del LES

•Prevalenza circa 70% dei casi

Metodica:

IFI su Crithidia luciliae

emoflagellato che presenta un cinetoplasto (mitocondrio) con DNA a doppia elica

Anti-ds DNA

Negativo Positivo

A direct pathogenic role for a-DNA is suggested by the

correlation of serum antibody levels with nephritis,

the temporal association of the rising titers with

with increased disease activty and the presence of

a-DNA in glomerular immune deposits in human and mice

with active nephritis.

NEFRITE LUPICA: anti-DNA

Autoanticorpi anti-ENA

• Anti-Sm

• Anti-SSA/Ro

• Anti-SSB/La

PRINCIPALI SPECIFICITA’ AUTOANTICORPALI

• Anti-U1RNP

• Anti-topois. I

• Anti-Jo1

SSA/Ro

• proteine: Ro52 e Ro60 kD

• RNA (hY1-hY5)

• funzione ?

• localizzazione nucleare e citoplasmatica

SSB/La

• fosfoproteina La 46/48 kD

• trascritti RNA polimerasi III

• elevata solubilità

• Distribuzione prevalentemente nucleare

LUPUS NEONATALE

LES

Sjogren

Altre connettiviti

Asintomatiche

Anti-Ro/La

IgG Anti-Ro/La

IgG

placenta

Permanenti Transitori

BloccoAV

Cardiomiopatia

QT lungo (?)

Rash

Citopenie

Epatite

LES ANA negativo

Esiste un piccolo subset di pazienti con LES con ANA negativi su substrati murini all’IFI (Gladman, 1978; Fessel, 1977; Maddison, 1981).

su 76 sieri ANA neg su mouse 100% hanno anti-Ro, 46% hanno anti-La. 35% hanno anti-RNP in ELISA

1 solo paz. 3 criteri x LES

SCLE

Multisystemic disease

Lazy gland syndrome

Autoimmune exocrinopathy

Autoimmune epithelitis

SJÖGREN’S SYNDROME

“… a relatively common autoimmune disease characterized by dysfunction and destruction of exocrine glands associated with lymphocytic infiltrates” (Moutsopoulos H.M.)

DRY MOUTH, DRY EYES, AUTOIMMUNE FEATURES

Oggi parleremo di anticorpi……………

Antinucleo (ANA)

Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP)

Antifosfolipidi

Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)

Systemic autoimmune disease with chronic inflammation of the

synovial joints

POOR PROGNOSIS EARLY DIAGNOSIS

AGGRESSIVE TREATMENT

Rheumatoid Arthritis

• Almeno quattro dei seguenti criteri

• Rigidità mattudina > 1 ora • Artrite di 3 o più articolazioni • Artrite delle mani • Artrite simmetrica • Noduli reumatoidi • Fattore reumatoide • Alterazioni radiologiche

American College of Rheumatology (ACR) Classification Criteria

Presenti almeno per sei settimane

…ACR criteria are not very well suited to diagnosing RA at an early stage…

Fattore Reumatoide (FR)

Anticorpi diretti contro regione Fc delle IgG

Isotipo prevalente IgM, ma anche IgA e IgG

Rheumatoid arthritis is an autoimmune

disease characterized by autoantibodies

directed to citrullinated antigens

Definition

Pathogenic role

Diagnostic role

Predictive value

Prognostic role

ACPA

Anti-filaggrin Ab anti-perinuclear factor (APF)

Nienhuis RLF, Mandena EA. Ann Rheum Dis 1964; 23: 302-305.

Profilaggrin

defosforilazione

Clivaggio proteico

Filaggrin

Citrullinazione enzimatica

peptidyl arginine deaminase (PAD)

citrullinated filaggrin Cheratinizzazione

Epidermide

ACPA = anticorpi anti proteine/proteine

citrullinati

Anti-CCP = anticorpi anti peptidi ciclici

citrullinati

ANTI-CCP

ACPA

Definition

Pathogenic role

Diagnostic role

Predictive value

Prognostic role

ACPA

Citrullination of proteins is a process occurring almost exclusively in dying cells

During cell death (apoptosis or necrosis) the

cell membrane becomes leaky allowing an unlimited

influx of extracellular Ca2+ ions.

PAD enzymes become activated

Due to the loss of positive charge the citrullinated protein

looses intramolecular and intermolecular interactions

the dying process is profoundly accelerated by the citrullination of intracellular

proteins

Citrullinated proteins in the arthritic joint

…we have demonstrated that the amounts of

citrullinated proteins and the enzyme PAD4 in the

arthritic joints of experimental animals

correlated with the severity of inflammation,

Infitrating cells cartilage

PAD4 in the arthritic joint

Infiltrating cells mononuclear cells

Reparon-Schuijt CC, et al. Arthritis Rheum 2001; 44: 41-47.

Proteine citrullinate e flogosi articolare

Secretion of anti-citrulline-

peptide antibody by B lymphocytes

in rheumatoid arthritis”.

Genetic & environment background

The HLA-DRB1 1001 SE is strongly associated with the production of anti-CCP antibodies, but not RF

AR 2005;52:3813-8.

The gene-environment interaction between smoking and HLA-DRB1 SE leading to autoantibodies is specific for RA

ARD 2005.

Definition

Pathogenic role

Diagnostic role

Predictive value

Prognostic role

ACPA

A systematic review of the published literature

(68 publications assessed)

1999-2006

1885 normal healthy subjects: anti-CCP2 6/1561 (0,4%)

Comparison with IgM-RF

Box-and-whisker

200

150

100

50

0

AR AP LES MR OA

RISULTATI

CA 2011

Definition

Diagnostic role in RA

Predictive value

Prognostic role in RA

Anti-CCP presenti molto precocemente nell’AR

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

0246810

anni prima dei sintomi%

po

sit

ività a

nti

CC

P-2

L’Anti-CCP può

essere rilevato

anni prima dei

sintomi iniziali di

AR

Adattato da: Rantapää-Dahlqvist et al, Arth Rheum 2003,48:2741-49

“…a diagnostic criteria set for RA was developed, characterized by

an excellent ability to discriminate,

at the first visit, between self-limiting, persistent nonerosive,

and persistent erosive arthritis...”

Definition

Pathogenic role

Diagnostic role

Predictive value

Prognostic role

ACPA

Correlation between anti-CCP at baseline and

progression of the modified Sharp

scores

anti-CCP titer might be an early predictor of

efficacy of anti-TNF therapy in patients with RA

Take Home messages

(1) Antibodies to citrullinated antigens are present early in disease and very specific for rheumatoid arthritis. (2) Data from the literature clearly shows that the CCP2 test is the best tool to measure specific antibodies in RA. (3) Despite the fact that patients in the early phase of the disease show a very similar clinical presentation, the use of the CCP2 test allows the clinician to distinguish two subclasses of patients (CCP(+) and CCP(-)RA), each with their own genetic background and future development of the disease. (4) Anti-citrullinated protein antibodies have recently been added to the ACR/EULAR criteria for the classification of rheumatoid arthritis.

Oggi parleremo di anticorpi……………

Antinucleo (ANA)

Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP)

Antifosfolipidi

Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)

CRITERI CLINICI

(1) TROMBOSI VASCOLARI

arteriose e/o venose

(2) PATOLOGIA GRAVIDICA

a. una o più morti fetali (>10 sett)

b. una o più nascite premature

c. tre o più aborti spontanei

consecutivi (<10 sett)

CRITERI DI LABORATORIO

(1) ANTICORPI ANTICARDIOLIPINA

e ANTI-β2-GPI

IgG e/o IgM a titolo medio alto in due

o più occasioni a distanza di almeno

dodici settimane, testati con ELISA

(b2-GPI dipendente per aCL)

(2) LUPUS ANTICOAGULANT

Metodiche coagulatorie con test di

conferma in due o più occasioni a

distanza di almeno dodici settimane

Systemic APS

• CUTE (e.g. Livedo Reticularis, necrosi cutanea)

• CUORE (e.g. endocardite non verrucosa)

• RENI (e.g. stenosi arteria renale)

• POLMONI (e.g. ipertensione polmonare)

• ENCEFALO (e.g. epilessia)

• SIST. CARDIOVASCOLARE (e.g. aterosclerosi)

• OCCHI (e.g. neurite ottica)

• UDITO (e.g. sordità improvvisa)

• PLACENTA (e.g. morte fetale)

• SIST GASTROENTERICO (e.g. Budd Chiari)

• SANGUE (e.g. trombocitopenia)

• ….

Euro-Phospholipid Project Group: cohort of 1000

patients Arthritis & Rheumatism 2002; 46: 1019-1027 • Trombosi venosa profonda 38.9 % • Stroke 19.8 % • Embolia polmonare 14.1 % • Tromboflebite supeficiale 11.7 % • TIA 11.1 %

Patologia gravidica (1.580 gravidanze)

• Aborti precoci (< 10 sett) 35.4 % • Aborti tardivi (> 10 sett) 16.9 % • Nascita prematura 10.6 % • Preeclampsia 9.5 %

LAC

aProtrombina

Anti

sulfatidi

ab2GPI

aCL

aPL

…..?

Alessandri C & Valesini G. “New facet of antiphospholipid antibodies”. Ann New York Acc Sci 2005.

aPS

Anti-annessina V

aLBPA

Anticorpi Antifosfolipidi

1. Markers diagnostici

2. Autoanticorpi patogenetici

Immunoenzimatica (ELISA): aCL

* CL/b2-

GPI

Determinazione del Lupus Anticoagulant (LAC) Brandt JT et al. Thromb Haemost 1995;74:1185-1190.

Step 1: LAC probabile se almeno un test risulta allungato * tempo di tromboplastina parziale attivato (APTT) * Russel viper venom time (RVVT) * Kaolin clotting time (KCT) Step 2: LAC positivo se il test rimane alterato * Mixing test: aggiunta di plasma normale al plasma del paziente

Step 2: LAC positivo se il test si normalizza * Test di neutralizzazione: aggiunta di fosfolipidi o piastrine scongelate al plasma del paziente

Nel 1990 tre laboratori dimostrarono che il legame tra

aCL e l’antigene richiede la presenza di un cofattore

proteico identificato nella b2–glicoproteina I (b2-GPI)

Mc Neil HD et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990

Galli M et al. Lancet 1990

Matsuura H et al. Lancet 1990

b2-glicoproteina I

b2-GPI, apolipoproteina H, è una

glicoproteina di 50 kDa, 326 aa,

concentrazione plasmatica di

circa 200 g/ml

LIPID RAFTS

TLR4

ANNEXIN A2

CD14

b2-GPI

ENDOTHELIAL/MONOCYTIC CELLS

aPLs

IRAK phosphorylation

NF-kB / IKB complex

NF-kB translocation

?

TNFa TF

CAMs

C.A. 2010

Rischio più elevato:

Sogetti positivi per LAC o con alti titoli di IgG aCL e aB2-GPI.

Rischio trombotico

Il rischio è notevolmente aumentato se:

Anamnesi positiva per pregressi eventi trombotici o aborti

Coesistenza di malattia autoimmunitarie (e.g LES)

Altri fattori di rischio tradizionali

Oggi parleremo di anticorpi……………

Antinucleo (ANA)

Fattore reumatoide (FR) e anti-citrullina (aCCP)

Antifosfolipidi

Anticitoplasma dei neutrofili (ANCA)

Consensus Conference di Chapel Hill, 1994

Vasculiti

vasculiti ANCA-associate

1) Granulomatosi di Wegener

2) Poliangite microscopica

3) Malattia di Churg e Strauss

vasculiti ANCA-associate

Anti-PR3

c-ANCA (Pr3)

P-ANCA (MPO)

negativo

Poliangite Microscopica 40 50 10

Granulomatosi di Wegener 70 25 5

Malattia di Churg e Strauss

10 60 30

vasculiti ANCA-associate

vasculiti ANCA-associate

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Dott. Cristiano Alessandri

Ricercatore MED 16, Reumatologia

Sapienza Università di Roma

0649974634

[email protected]

Grazie per l’attenzione …