Giovana Giacomini
Introdução
Trypanosoma cruzi
Doença de Chagas
10 milhões
Fase aguda
Fase indeterminada
Fase crônica
Introdução
Trypanosoma cruzi
• Grande diversidade genética classificação
• RAPD (random amplified polymorphic DNA)
• MLEE (multilocus enzyme eletrophoresis)
• DTU (discrete typing unit) conjuntos de unidades populacionais geneticamente mais relacionadas entre si do que qualquer com outra população
6 DTUs
Emergência de DTUs: recombinação IIa e IIc = I + IIbIId e IIe = IIb + IIc
TCITCII IIa, IIb, IIc, IId e IIe
Introdução
Identificação dos DTUs é de alta relevância para estudos clínicos e epidemiológicos
Exploração de possíveis ligações entre diversidade genética
X pleomorfismo na severidade e
sintomas
Rastreamento molecular de populações silvestres
Método discriminatório molecular simples e sensível
Objetivo
Aplicar a análise MLP à 12 loci gênicos
- Genes envolvidos na relação hospedeiro-parasita devido a possível propensão à polimorfismos como uma resposta adaptativa à pressão seletiva imune
- Comparação com resultados obtidos por RAPD (validação taxonômica) e MLEE (aplicações práticas)
- Prova de evidência para aplicabilidade
Materiais e Métodos
20 cepas de T. cruziAmostras de sangue: 10 humanas e 21 outros mamíferosAmostras do conteúdo intestinal: 19 Mepraia spinolai
Materiais e Métodos
12 genesGenBank: sequências correspondentesPrimer Premier
PCR
Avaliar a diferença nas sequências de DNA
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment-Length Polymorfism)
Materiais e Métodos
Microchip (eletroforese
capilar)
Produto da PCRClivagem por enzimas
de restrição(Webcutter)
Separação dos fragmentos
Eletroforese em gel de agarose
Materiais e Métodos
1ª etapa: 6 cepas T. cruzi e T. cruzi marinkellei (“7-strain analysis”)Análise final: 1 enzima por marcador
Resultados
gp72(TaqI)
1f8(Alw21I)
genótipos heterozigotos
Sobreposição dos padrões dos supostos ancestrais
1ª etapa: 7-strain analysis2ª etapa: 20 cepas
Resultados
Fragmentos únicos DTUs específicos
Combinações de características únicas
Polimorfismos entre DTUs
Resultados
gp63(TaiI)
Polimorfismos intra-DTUs
Resultados
Aplicação do PCR-RFLP em amostras de hospedeiros
1f8/Alw21I
IIb IIb IIaIIc
IIdIIe+ IIb
IIdIIe+ I
IIdIIe+ I
IIaIIc+ I
Conclusões
- Concordância dos resultados encontrados com PCR-RFLP com a classificação baseada na MLEE e RAPD.
- Algoritmo para identificação de DTUs T. cruzi.
- Análise MLP representou uma nova alternativa aos métodos moleculares existente.
- Simples, discriminação em vários níveis, aplicado diretamente para amostras dos hospedeiros.
- Ferramenta importante para estudos epidemiológicos e ações de controle.
Fonte: Zingales et al., 2009
Segunda Reunião Satélite – XXXVI Reunião Anual em Pesquisa Básica sobre a Doença de Chagas (Búzio, RJ – 2009)
OBRIGADA!!!