UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ – UFC
CENTRO DE BIOMEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES
COM CÂNCER DE MAMA DO SERVIÇO DE MASTOLOGIA DE UM
HOSPITAL DO ESTADO DO CEARÁ.
EMANUELE SILVA DE OLIVEIRA
FORTALEZA-CE
2015
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
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EMANUELE SILVA DE OLIVEIRA
FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES COM CÂNCER
DE MAMA DO SERVIÇO DE MASTOLOGIA DE UM HOSPITAL DO ESTADO DO
CEARÁ.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia Médica da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em
Microbiologia Médica.
Orientadora: Profa Dra Sílvia Helena Barem
Rabenhorst.
FORTALEZA - CE,
2015
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
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EMANUELE SILVA DE OLIVEIRA
FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES COM CÂNCER
DE MAMA DO SERVIÇO DE MASTOLOGIA DE UM HOSPITAL DO ESTADO DO
CEARÁ.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia Médica da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em
Microbiologia Médica.
Aprovada em 26 / 01 / 2015
Banca examinadora
____________________________________________________________
Profa Dra Sílvia Helena Barem Rabenhorst (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará - UFC
____________________________________________________________
Dra Márcia Valéria Pitombeira Ferreira
Universidade Federal do Ceará - UFC
____________________________________________________________
Dr Renato Luiz Maia Nogueira
Universidade Federal do Ceará - UFC
____________________________________________________________
Dr Sérgio Ferreira Juaçaba
Instituto do Câncer do Ceará - ICC
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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À minha família, em especial, às
mulheres da minha vida: minha
avó Julina e minha mãe...
Dedico.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pela sua presença, pelo seu amor que me conforta em todos os momentos, por
me fazer forte quando eu não tive outra alternativa e por me capacitar permitindo que eu
alcance etapas cada vez mais desafiadoras no caminho do crescimento profissional.
A minha família pelos exemplos de trabalho, bom humor e força representados por
aqueles que foram diretamente responsáveis pela minha formação: meus tios e tias (Ananias,
Paulinho, Eliane, Mary e Marlene). A meu pai pela serenidade e ouvidos dispostos a saber
como foi o meu dia. A minha mãe pelo exemplo de dedicação, esforço e competência e por
me oferecer um porto seguro diante de qualquer situação. A minha avó Julina pelo amor
“roxo”, pelas eternas demonstrações de carinho e pelos melhores cheiros e abraços.
A professora Dra. Sílvia Helena Barem Rabenhorst, pela orientação, pela fé na nossa
capacidade, pelo carinho e cuidado de mãe (“carões” e puxões de orelha também!) e pela
incansável busca de extrair o que nós temos de melhor.
Aos amigos do Laboratório, pelo apoio, ensinamentos, parcerias, “cafés da tarde” e
convivência sempre agradável. Àqueles presentes no início que me guiaram pelos primeiros
passos: Markênia, Denise e Patrícia. A Virllane, com quem convivi por pouco tempo, mas o
suficiente para cativar-me. A Débora, Isabelle, Eliane, Isaac e Ana Paula pela cumplicidade,
palavras incentivadoras, risos garantidos e abraços apertados.
Aos amigos mais ou menos próximos que fizeram e fazem parte da minha vida e
contribuíram para o que eu sou hoje, ainda que distantes, a minha sincera gratidão.
A minha amiga de qualquer hora e qualquer lugar, Sâmia que me inspira e me incentiva a
cada nova meta e que nunca deixou de me fazer sentir amada em cada dia de aniversário
(sendo tentativa de festa surpresa ou estando apenas nós duas diante de um bolo sobre a mesa
ao som da cantoria de “parabéns pra você”), em cada réveillon (que não me foi permitido
passar em casa dormindo), a cada surpresa diante de um postal enviado de algum lugar do
mundo dizendo que lembrou de mim ou em tantas outras demonstrações de carinho.
Aos participantes da banca, pela presteza em aceitar o convite, pela cuidadosa leitura e
pelas valiosas contribuições.
Ao programa de Pós Graduação em Microbiologia Médica representado pelos professores
e demais funcionários pelo empenho na formação científica dos pós graduandos.
A FUNCAP pelo suporte financeiro.
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"Se as coisas são inatingíveis... ora!
Não é motivo para não querê-las...
Que tristes os caminhos, se não fora
A presença distante das estrelas!"
Mario Quintana
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RESUMO
O câncer de mama representa a maior causa de mortalidade por câncer entre as mulheres em
todo o mundo. Apesar de possuir bom prognóstico quando diagnosticado e tratado
adequadamente, as taxas de mortalidade continuam elevadas no Brasil. A etiologia do câncer
de mama é multifatorial e alguns fatores de risco são descritos, como: idade, história familiar
e pessoal de câncer, fatores ligados a aspectos endócrinos, entre outros. Entretanto, em 50 a
80% dos casos, nenhum desses fatores é identificado, sugerindo a existência de outros.
Estudos apontam a associação do câncer de mama com o Vírus Epstein-Barr (EBV),
entretanto, os estudos são controversos. Assim, o presente estudo teve como objetivo verificar
a presença de EBV, utilizando a técnica de Hibridação in situ, em 75 pacientes diagnosticadas
com carcinoma mamário invasivo, provenientes do Ambulatório de Mastologia da
Maternidade Escola Assis Chateaubriand. Para a classificação molecular, os marcadores RE,
RP, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 e CK8/18 foram detectados pela técnica de
imunohistoquímica. Neste estudo, a mediana da idade das pacientes foi de 55 anos, das quais
28% tinham até 45 anos. Apenas 8,7% dos tumores foram diagnosticados precocemente.
Graus de estadiamento mais avançados e comprometimento de linfonodos caracterizaram essa
amostra. A maioria dos tumores expressaram marcadores de citoqueratinas luminais,
receptores hormonais e marcador de proliferação celular (Ki67). Por outro lado, TP53 e
HER2 estiveram presentes em uma fração menor dos tumores. EBV foi positivo em apenas
6,67% dos casos nos quais a presença do vírus foi restrita a poucos núcleos de células
tumorais. O subtipo luminal B foi o mais frequente, seguido do luminal A. TP53 foi mais
frequente nos tumores do subtipo basal símile (75%), diferindo significativamente dos
tumores luminais A (16,7%) (p= 0,03) independente da idade. Entre as pacientes com até 45
anos, todos os tumores do subtipo triplo negativo (basal símile e normal símile) foram TP53
positivos, enquanto uma baixa frequência foi encontrada nos subtipos luminal A e luminal B
com uma diferença estatística entre triplo negativo (100%) e luminal A (14,3%) (p = 0,02),
triplo negativo e luminal B (16,7%) (p = 0,02), entre basal símile (100%) e luminal A (p =
0,04) e basal símile e luminal B (p = 0,04). As frequências de TP53 não diferiram
significativamente entre os subtipos moleculares nas pacientes acima de 45 anos.
Comparando-se os grupos de idade, é interessante notar que os tumores do subtipo triplo
negativo nas pacientes de até 45 anos de idade tiveram TP53 estatisticamente mais frequente
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do que em pacientes acima de 45 anos quando comparados com luminal B, enquanto nos
tumores do subtipo luminal B, TP53 foi mais frequente em pacientes acima de 45 anos de
idade. Em conclusão, apesar da presença de EBV observada, o pequeno número de casos e a
fraca positividade não permitem afirmar ser este um fator etiológico para o desenvolvimento
do câncer de mama e nem a associação da sua presença com algum subtipo molecular.
Entretanto, é importante ressaltar que o vírus foi pesquisado com base no seu perfil de
latência considerando a expressão de EBER e esses dados suscitam a adição de outros alvos
para a pesquisa da real participação do vírus. Por outro lado é interessante ressaltar a
importância do TP53 como marcador diferencial dos tumores triplo negativos em mulheres
abaixo de 45 anos.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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ABSTRACT
Breast cancer is the leading cause of cancer death among women worldwide. Despite having
good prognosis when diagnosed and treated properly, breast cancer mortality rates remain
high in Brazil. The etiology of breast cancer is multifactorial and some risk factors are
described, such as age, family and personal history of cancer, factors linked to endocrine
aspects, among others. However, by 50 to 80% of cases none of these factors is identified,
suggesting the existence of another one. Studies point to an association of breast cancer with
the Epstein-Barr Virus (EBV), but the studies are controversial. Thus, this study aimed to
verify the presence of EBV, using in situ hybridization in 75 patients diagnosed with invasive
breast carcinoma, from the Mastology Clinic of the Maternity School Assis Chateaubriand.
For molecular classification, ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 markers were
detected by immunohistochemistry. In this study, the median age of patients was 55 years, of
which 28% were aged up to 45 years. Only 8,7% of the tumors were diagnosed early. More
advanced stage of degrees and lymph node involvement characterized this sample. Most
tumors express luminal cytokeratins markers, hormone receptors and marker of cell
proliferation (Ki67). Moreover, TP53 and HER2 were present in a minor fraction of tumors.
EBV was positive in only 6.67% of the cases in which the presence of the virus was restricted
to a few nuclei of tumor cells. The luminal B subtype was the most common, followed by
luminal A. TP53 was more frequent in tumors of the basal-like subtype (75%), significantly
differing from the luminal A tumors (16,7%) (p = 0.03) regardless of age. Among the patients
up to 45 years, all triple negative (basal-like and normal-like) subtype tumors were TP53
positive, while a low frequency was found in luminal A and B subtypes with a statistical
difference between triple negative (100%) and luminal A (14,3%) (p = 0.02), triple negative
and luminal B (16.7%) (p = 0.02), between basal-like (100%) and luminal A (p = 0.04) and
basal-like and luminal B (p = 0.04). The TP53 frequency did not differ significantly between
the molecular subtypes in patients over 45 years. Comparing the age groups, it is interesting
to note that in triple negative subtype tumors in patients under 45 years old TP53 was
statistically more frequent than in patients over 45 years old compared with luminal B, while
in luminal B tumors, TP53 was more frequent in patients over 45 years old. In conclusion,
despite the presence of EBV observed, the small number of cases and the weak positivity does
not allow to say that this is an etiological factor for the development of breast cancer neither
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the association of their presence with some molecular subtype. However, it is important to
note that the virus was investigated based on your profile latency considering the EBER
expression and these data raise the addition of other targets for studying the real participation
of the virus. Furthermore, it is interesting to note the importance of TP53 as a marker of
differential triple negative tumors in women below 45 years.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Estimativas para o ano de 2014 do número de casos novos de câncer de
mama e distribuição proporcional entre os dez tipos de câncer mais incidentes
estimados para 2014........................................................................................................... 15
Figura 02 – Genoma do Vírus Epstein-Barr.................................................................... 32
Figura complementar A - Percentual de casos de câncer de mama estudados
distribuídos segundo a faixa etária das pacientes (n=75)................................................... 76
Figura complementar B - Frequência da expressão das proteínas celulares RE, RP,
HER2, Ki67, TTP53, CK5/6 e CK8/18 e percentual de células tumorais marcadas
(n=75)................................................................................................................................. 77
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LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Classificação histológica do carcinoma mamário invasivo........................... 16
Tabela 02 – Definição do TNM patológico...................................................................... 22
Tabela 03 - Estadiamento TNM para câncer de mama.................................................... 26
Tabela 04 – Técnicas de detecção do EBV em amostras de tumores mamários.............. 28
Tabela 05 - Expressão de genes latentes do EBV quanto aos tipos de latência e tecido
associado............................................................................................................................ 33
Tabela 06 - Regiões celulares de expressão dos alvos das técnicas empregadas e os
respectivos clones dos anticorpos...................................................................................... 41
Tabela 07 - Critérios de positividade definidos para as proteínas detectadas por
imunohistoquímica............................................................................................................. 42
Tabela complementar A - Percentual de casos de carcinoma mamário estudados,
distribuídos quanto à gestação e presença de fatores de risco (história prévia de câncer,
história familiar, tabagismo e etilismo............................................................................... 76
Tabela complementar B - Características imunohistoquímicas de carcinomas de
mama em pacientes ≤ 45 anos e > 45 anos........................................................................ 77
Tabela complementar C - Características imunohistoquímicas de carcinomas de
mama em pacientes tabagistas/não tabagistas e com/sem história prévia/familiar de
câncer................................................................................................................................. 78
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SUMÁRIO
1. Introdução...................................................................................................................
1.1. Câncer de mama....................................................................................................
1.1.1. Epidemiologia do câncer de mama.............................................................
1.1.2. Características histopatológicas do câncer de mama..................................
1.1.2.1. Classificação histológica................................................................
1.1.2.2. Fatores prognósticos.......................................................................
1.1.3. Etiologia do câncer de mama.....................................................................
1.1.4. Os vírus e o câncer de mama......................................................................
1.2. Vírus Epstein-Barr (EBV)....................................................................................
1.2.1. Histórico.....................................................................................................
1.2.2. Características do vírus Epstein-Barr.........................................................
1.2.3. Técnicas de detecção do EBV....................................................................
1.2.4. EBV em tumores sólidos............................................................................
1.3. Justificativa do estudo...........................................................................................
1.4. Hipótese................................................................................................................
14
14
14
15
15
22
27
27
29
29
31
34
35
36
36
2. Objetivos.....................................................................................................................
2.1. Objetivo geral.......................................................................................................
2.2. Objetivos específicos............................................................................................
37
37
37
3. Material e métodos......................................................................................................
3.1. Casuística..............................................................................................................
3.2. Aspectos éticos.....................................................................................................
3.3. Instrumentos e procedimentos de coleta de dados................................................
3.4. Hibridação in situ..................................................................................................
3.5. Imunohistoquímica...............................................................................................
3.6. Critérios para análise das lâminas.........................................................................
3.7. Análise estatística.................................................................................................
38
38
38
39
39
40
41
43
4. Referências bibliográficas........................................................................................... 44
Apêndices...........................................................................................................................
Apêndice I - Low frequency of virus Epstein-Barr (EBV) in Breast Cancer in
patients from Ceara – Brazil…………………………………………………………
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Apêndice II - Molecular characterization of Breast Cancer in Brazilian Northeast
women..........................................................................................................................
Apêndice III – Tabelas e figuras complementares.......................................................
Apêndice IV - Parecer do Comitê de Ética em pesquisa da Maternidade Escola
Assis Chateaubriand (MEAC).....................................................................................
Apêndice V - Ficha de coleta de dados socioepidemiológicos.................................
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Câncer de mama
1.1.1 Epidemiologia do câncer de mama
O câncer de mama (CM) representa a maior causa de mortalidade por câncer entre as
mulheres em todo o mundo. Foram estimadas cerca de 520 mil mortes para o ano de 2012. É a
segunda causa de morte por câncer nos países desenvolvidos (depois do câncer de pulmão) e a
maior causa nos países em desenvolvimento. Nos últimos 40 anos, a sobrevida vem
aumentando nos países desenvolvidos (85% em cinco anos), mas permanece com valores
entre 50 a 60% nos países em desenvolvimento. Apesar de ser considerado de bom
prognóstico quando diagnosticado e tratado adequadamente, as taxas de mortalidade por
câncer de mama continuam elevadas no Brasil, provavelmente devido ao fato de a doença
ainda ser diagnosticada em estágios avançados (INCA, 2014).
No Brasil, o exame clínico das mamas anualmente a partir dos 40 anos e a mamografia
bienal para mulheres entre 50 a 69 anos é a estratégia recomendada para a detecção precoce
da doença em mulheres com risco padrão. Para aquelas que pertencem a grupos de risco
elevado (com história familiar de câncer de mama em parentes de primeiro grau), recomenda-
se o exame clínico da mama e a mamografia, anualmente, a partir de 35 anos (INCA, 2014).
Cerca de 1,67 milhões de casos novos desta neoplasia foram esperados para o ano de
2012 em todo o mundo, representando 25% de todos os tipos de câncer diagnosticados nas
mulheres. Suas taxas de incidência variam entre as diferentes regiões do mundo, com as
maiores taxas em 2012 na Europa Ocidental (96/100 mil) e as menores taxas na África
Central e na Ásia Oriental (27/100 mil) (INCA, 2014).
Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA) 2014, no Brasil, o câncer de mama foi
responsável por 20% dos casos novos para o ano de 2014, sendo esperados 57.120 novos
casos, com um risco estimado de 56,09 casos por 100.000 mulheres. Desconsiderando-se o
câncer de pele, é o tipo de câncer mais frequente nas mulheres nas regiões Sudeste (71,18/100
mil), Sul (70,98/100 mil), Centro-Oeste (51,30/100 mil) e Nordeste (36,74/100 mil). Na
região Norte, é o segundo tumor mais incidente (21,29/100 mil) (figura 01).
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Figura 01 - Estimativas para o ano de 2014 do número de casos novos de câncer de mama e
distribuição proporcional entre os dez tipos de câncer mais incidentes estimados em 2014.
Fonte: Instituto Nacional de Câncer – INCA, 2014.
1.1.2 Características histopatológicas do câncer de mama
O curso clínico do câncer de mama e a sobrevida são elementos variáveis de paciente
para paciente. Esta variação é determinada por uma série complexa de fatores, tais como a
diferença na velocidade de duplicação do tumor, o seu potencial de metastatização e outros
mecanismos ainda não completamente compreendidos, relacionados com a condição
imunológica, hormonal e nutricional da paciente (Clark, 1996; Abreu e Koifman, 2002).
1.1.2.1 Classificação histológica
Com relação ao tipo histológico, recentemente foi publicada a quarta edição da
classificação de tumores de mama da Organização Mundial de Saúde (OMS). Os tumores
mamários invasivos, em sua maioria, são carcinomas ductais, que não apresentam padrão
citológico ou arquitetural especial. São reconhecidos o carcinoma mamário invasivo de tipo
não especial e mais de 20 tipos histológicos especiais definidos predominantemente por
critérios morfológicos (tabela 01) (Bacchi et al. 2013, Geyer e de Nigro, 2013).
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Tabela 01 - Classificação histológica do carcinoma mamário invasivo.
Classificação histológica do carcinoma mamário invasivo
Carcinoma invasivo de tipo não especial
Carcinoma lobular invasivo
Carcinoma tubular
Carcinoma cribiforme
Carcinoma com características medulares
Carcinoma metaplásico
Carcinoma com diferenciação apócrina
Carcinoma adenóide cístico
Carcinoma mucoepidermóide
Carcinoma polimorfo
Carcinoma mucinoso e carcinoma com células em anel de sinete
Carcinoma com características neuroendócrinas
Carcinoma papilífero invasivo
Carcinoma micropapilífero invasor
Carcinoma secretor
Carcinoma oncolítico
Carcinoma sebáceo
Carcinoma rico em lipídeos
Carcinoma de células claras rico em glicogênio
Carcinoma de células acinares
(Geyer e de Nigro, 2013).
Usualmente identificado como carcinoma ductal invasivo (CDI), o carcinoma
mamário invasivo de tipo não especial corresponde a cerca de 70% dos casos, sendo definido
como uma neoplasia epitelial mamária invasiva que não preenche critério para nenhum tipo
especial (Geyer e de Nigro, 2013). Alguns tumores exibem características peculiares que
determinam um padrão morfológico especial e também um prognóstico diferenciado (Bacchi
et al. 2013). Esses tumores são chamados tipos especiais puros quando essas características
estão presentes em mais de 90% da neoplasia. Dentre estes, o carcinoma lobular invasivo
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(CLI) é o mais prevalente (aproximadamente 15%). Não é incomum uma mesma neoplasia
apresentar áreas com diferentes morfologias, sendo consideradas neoplasias de padrão misto.
Além da subjetividade dos critérios diagnósticos, ao aplicá-la, cerca de 85% dos casos
acabam por pertencer às duas categorias principais de CDI ou CLI. Dentro da mesma
categoria histológica, a avaliação imunohistoquímica para receptor de estrógeno (RE),
receptor de progesterona (RP) e receptor de fator de crescimento epidérmico 2 (HER2)
passam a ter um papel fundamental para aumentar o valor discriminatório entre os casos
(Geyer e de Nigro, 2013).
O carcinoma invasivo do tipo não especial e o carcinoma lobular invasivo são as
formas mais comuns de carcinomas de mama. Pacientes portadoras de carcinoma invasivo do
tipo não especial apresentam normalmente um maior comprometimento de linfonodos e um
pior prognóstico que aquele verificado nos pacientes com tipos menos frequentes de
carcinoma invasivo de mama (Reinfuss et al. 1995; Diab et al., 1999). Embora nos primeiros
cinco anos, pacientes com carcinoma invasivo do tipo não especial apresentem maior taxa de
recorrência em relação a pacientes com carcinoma lobular invasivo, as curvas de sobrevida
tendem a se igualar aos dez anos de seguimento (Geyer e de Nigro, 2013).
Os tumores malignos de mama do tipo carcinoma tubular estão entre aqueles que
apresentam o melhor prognóstico. O carcinoma tubular apresenta excelente prognóstico,
mesmo nas pacientes com comprometimento de linfonodos, estando a sobrevida muito
próxima daquela verificada na população geral (Abreu e Koifman, 2002).
É na correta identificação dos tipos histológicos especiais, os quais refletem
características biológicas e clínicas bastante homogêneas, que reside a maior importância da
tipagem histológica (Ellis et al., 2003; Viale, 2012).
Alguns marcadores têm sido considerado clássicos para o estabelecimento do
prognóstico dos tumores mamários por imunohistoquímica, como os receptores de estrógeno
e progesterona (RE e RP) e o receptor de fator de crescimento epidérmico 2 (HER2).
A expressão do receptor de estrógeno (RE) é, sem dúvida, o mais importante
biomarcador em câncer de mama, pois fornece o índice de sensibilidade ao tratamento
endócrino. Tumores RE positivos usam o esteróide hormonal estradiol como seu principal
estímulo para crescimento, sendo, portanto, o alvo direto das terapias endócrinas. O
tratamento com tamoxifeno reduz a taxa anual de morte por câncer de mama em 31% na
doença RE positiva. Evidências a partir de 1970 sugerem uma correlação direta entre os níveis
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de expressão de RE e resposta à terapia endócrina (Viale et al., 2007). O Early Breast Câncer
Trialists’ Collaborative Group relatou que os níveis mais elevados de RE foram associados a
um menor risco de recorrência quando receberam tamoxifeno adjuvante (Buitrago et al.,
2011).
A expressão do Receptor de Progesterona (RP) é dependente da presença de RE.
Tumores que expressam RP, mas não o RE, são incomuns e representam 1% dos casos de
câncer de mama. Por isso, tumores com expressão de RP e falta de expressão de RE devem
passar por um novo teste para confirmar os resultados para o RE e eliminar a possibilidade de
falso negativo. Nesses casos de expressão apenas de RP, foram descritos benefícios limitados
com uso de tamoxifeno, por isto a terapia endócrina é ainda amplamente recomendada. Há
evidências de que no câncer de mama metastático a resposta ao tratamento antiestrogênio é
melhor entre pacientes com tumores que expressam tanto RE como RP versus aqueles que
apenas mostram positividade para RE, mas falta a expressão de RP (Buitrago et al., 2011).
O receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) pertence à família
dos receptores de crescimento. A sua expressão tem sido associada a maior agressividade
biológica do tumor e à resistência a alguns tipos de tratamento (Ferrero et al., 2000). O HER2
codifica uma proteína de membrana das células tumorais que faz com que estas se
desenvolvam mais rápido e aumentem a sua duplicação, tornando os tumores mais agressivos
(Slamon et al., 1987; Di Fiore et al., 1987). Diversos estudos têm sugerido que existe uma
relação entre o estado HER2 e a resistência hormonal (Benz et al., 1992; Fernandez et al.,
1997). A presença do HER2 está associado a maior risco de recidiva tumoral (Press et al.,
1997) e desempenha um papel fundamental na carcinogênese (Slamon et al., 1987; Di Fiore et
al., 1987). O HER2 é amplificado em 15% a 25% dos casos de câncer de mama humano
(Konecny et al., 2003). Amplificação do HER2 ou superexpressão são reconhecidas como
importantes marcadores de doença agressiva e são os alvos moleculares para terapias
específicas, como trastuzumab e lapatinib (Piccart-Gebhart et al., 2005).
Outros marcadores têm sido vistos como emergentes para contribuir com o
conhecimento sobre o prognóstico dos tumores mamários, como o Ki67.
Devido à grande heterogeneidade dos tumores, outros marcadores vêm sendo propostos
como emergentes no estudo do câncer mamário para contribuir com o conhecimento sobre o
prognóstico desses tumores. Dentre estes, a mutação do TP53 (Schneider et al., 2007), receptores
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andrógenos (Rakha et al., 2007), receptor de crescimento epitelial EGFR (HER-1) (Hoadley et al,
2007; Cheang et al, 2008) e Ciclina D1 (Reis-Filho et al, 2006).
O gene TP53 é um gene regulador chave do ciclo celular, que quando sofre mutações
leva ao desenvolvimento de neoplasias, atuando como gene supressor tumoral em condições
normais (Hollstein et al., 1991). É um dos genes responsáveis pela integridade do genoma,
ativado pelo surgimento de DNA alterado. Sua ativação produz uma proteína que estimula a
síntese de outras proteínas que inibem a replicação celular e estimulam as enzimas de reparo
do DNA. Caso o reparo no DNA seja completo, o TP53 é inativado e a célula retorna ao
estado normal. Caso o reparo não ocorra, a célula permanece impedida de se replicar e é
induzida a apoptose (Lopes et al., 2002).
Ki67 é uma proteína nuclear que não é expressa nas células em repouso (G0), mas
pode ser detectada nas outras fases G1 a M do ciclo celular. Sua utilização como um marcador
de proliferação celular mostrou que o percentual de células positivas para Ki67 pode ser
usado para estratificar pacientes de bom prognóstico ou grupos de mal prognóstico (Buitrago
et al., 2011). O Ki67 pode ser considerado como um fator de proliferação facilmente avaliado
e reprodutível e pode ser uma alternativa ou complemento ao grau histológico como uma
ferramenta de prognóstico e para a seleção de tratamento adjuvante. Foi demonstrado o valor
prognóstico de Ki67 em pacientes com câncer de mama e linfonodos negativos, mas também
revela que o impacto prognóstico é restrito a tumores RE positivos e grau histológico 2.
Embora existam outros marcadores de proliferação celular, o Ki67 tem preço mais acessível, é
facilmente avaliado e reprodutível (Marie et al., 2010).
As citoqueratinas humanas (CKs) são uma família de proteínas codificadas por diferentes
genes que são expressos em vários tipos de células e estão relacionadas à regulação do
desenvolvimento e diferenciação celular. Existe uma relação entre o peso molecular da
citoqueratina e o tipo de epitélio onde está expressa. Assim, as de baixo peso molecular estão em
epitélios simples e as de alto peso molecular em epitélios estratificados (Ribeiro-Silva et al.,
2005).
Apesar de os grupos que estudam o câncer de mama reconhecerem há muito tempo a
diversidade dos tumores mamários, o conceito da heterogeneidade foi de fato incorporado à
pesquisa e à prática clínica. A heterogeneidade dos carcinomas de mama é decorrente do
envolvimento de diferentes genes relacionados à atividade proliferativa, diferenciação e supressão
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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de tumores, muitos destes vêm sendo estudados isoladamente ou em pequenos grupos quanto ao
seu papel na carcinogênese, assim como a sua implicação como fatores prognósticos.
Com os avanços na área de biologia molecular foi possível identificar perfis genômicos
importantes para a classificação clínica e biológica dos tumores de mama (Pollack et al., 2002;
Sorlie et al., 2003; Buitrago et al., 2011). As associações da caracterização fenotípica com o perfil
obtido pelas análises de microarray revelaram distintos subtipos que foram associados com
sobrevida. Dentro deste contexto, cinco grandes grupos de carcinomas de mama invasivos foram
identificados: luminal A, luminal B, HER2+, basal símile, e normal símile (Yersal e Barutca,
2014).
Aproximadamente 75% dos carcinomas mamários são positivos para RE e/ou RP. Os
tumores RE positivos expressam RE, RP e outros genes que codificam proteínas de células
epiteliais luminais, então, eles são caracterizados como subtipo luminal. Foram identificadas duas
subclasses dentro desse grupo: luminal A e luminal B (Yersal e Barutca, 2014).
O subtipo luminal A é o subtipo mais comum e representa 50 a 60% de todos os
carcinomas mamários. Esses tumores normalmente têm baixo grau histológico, pouco
pleomorfismo nuclear e baixa atividade mitótica, representando tumores de bom prognóstico. O
grupo é caracterizado pelos elevados níveis de expressão de RE e baixos níveis de expressão de
genes relacionados à proliferação celular. É caracterizado pela expressão de citoqueratinas
epiteliais luminais (CK8/18) e outros marcadores luminais associados. O subtipo luminal A é
definido então, como tumores RE e/ou RP positivos, HER2 negativos e com baixos níveis de
expressão de Ki67 (≤ 14%) (Carey et al., 2006; Guarneri et al., 2009; Carey et al., 2010;
Kennecke et al., 2010; Yersal e Barutca, 2014).
Tumores luminais B representam 15 a 20% dos cânceres mamários e têm fenótipo mais
agressivo, altos grau histológico e índice proliferativo e um pior prognóstico. Esse subtipo tem
alta taxa de recorrência e baixo índice de sobrevivência quando comparado ao subtipo luminal A.
O subtipo luminal B é constituído por tumores RE e/ou RP positivos, HER2 negativos e com altos
níveis de expressão de Ki67 (> 14%). Tumores luminais B têm menos resultados com
hormonioterapia com relação aos luminais A. No entanto, o câncer de mama luminal B responde
melhor à quimioterapia neoadjuvante que o luminal A. A maior taxa de reincidência da doença
em tumores luminais B estão limitados aos primeiros cinco anos depois do diagnóstico (Cheang et
al., 2009; Guarneri et al., 2009; Creighton et al., 2012; Geyer et al., 2012; Yersal e Barutca,
2014).
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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21
O receptor de fator de crescimento epidérmico 2 é um membro da família de quatro
tirosinas quinases de membrana. Os tumores HER2 positivos representam 15 a 20% dos tumores
mamários. A positividade para o HER2 representa comportamento clínico e biológico mais
agressivo. Esses tumores são caracterizados pela alta expressão do gene HER2.
Morfologicamente, esses tumores são altamente proliferativos, 75% tem altos graus histológico e
nuclear e mais de 40% tem mutação no gene TP53. Aproximadamente metade dos tumores HER2
positivos é também positivo para o RE, mas eles geralmente expressam esse marcador em baixos
níveis (Tsutsui et al., 2003; Gutierrez et al., 2011; Yersal e Barutca, 2014).
O subtipo basal símile representa de 8 a 37% de todos os carcinomas mamários. São
associados com altos graus histológico e nuclear, pouca formação de túbulos e presença de zonas
centrais necróticas ou fibróticas, bem como elevados níveis mitóticos e índices proliferativos. Boa
parte desses tumores são invasivos, com comportamento clínico agressivo e com elevadas taxas
de metástase para o cérebro e para os pulmões. Os tumores que fazem parte desse grupo
expressam elevados níveis de marcadores epiteliais basais, como CK5, CK14, CK17 e laminina e
não expressam RE, RP e HER2, sendo referidos portanto, como triplo negativos. Esses tumores
frequentemente apresentam mutações no gene TP53, evidências de instabilidade genômica e
inativação de retinoblastoma (Rb) (Yersal e Barutca, 2014).
É importante ressaltar que os termos “triplo negativo” e ”basal símile” não são
completamente sinônimos. O termo triplo negativo refere-se a tumores mamários que não
expressam RE, RP e HER2 utilizando-se da imunohistoquímica para detecção. Esse fenótipo
triplo negativo, atualmente, é um subtipo confiável na prática clínica (Kreike et al., 2007).
Microarray e análises imunohistoquímicas demonstram que o subtipo basal símile
constitui aproximadamente 75% dos cânceres de mama relacionados ao BRCA1. Esses cânceres
frequentemente expressam fenótipo triplo negativo e são frequentemente positivos para Ki67,
citoqueratinas basais, TP53, EGFR e E-caderina (Kreike et al., 2007; Rakha et al., 2009;
Ignatiadis et al., 2009; Yersal e Barutca, 2014).
Por fim, os tumores do tipo normal símile representam cerca de 5 a 10% de todos os
carcinomas mamários, expressam características genéticas de tecido adiposo, apresentam
prognóstico intermediário entre os cânceres luminais e basais e normalmente não respondem à
quimioterapia adjuvante. Como eles não expressam RE, RP e HER2, também são classificados
como triplo negativos, mas não são considerados basais símiles por serem negativos para CK5 e
EGFR (Kreike et al., 2007; Rakha et al., 2009; Ignatiadis et al., 2009; Yersal e Barutca, 2014).
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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22
As implicações da classificação molecular na terapêutica do câncer de mama têm sido
aceitas por vários painéis internacionais. Em 2011 e, mais recentemente, em 2013, especialistas
concordaram que as decisões terapêuticas devem ser feitas com base no reconhecimento dos
subtipos moleculares (Goldhirsch et al., 2013).
1.1.2.2. Fatores prognósticos
Fatores prognósticos são parâmetros possíveis de serem mensurados no momento do
diagnóstico e que servem como preditores da sobrevida do paciente (tabela 02) (INCA, 2014).
Certos aspectos anatômicos, como o tamanho do tumor primário e as condições dos
linfonodos, são fatores importantes na avaliação prognóstica (Andreopoulou et al., 2008;
Jemal et al., 2009; Buitrago et al., 2011), assim como características histológicas e biológicas,
como grau nuclear, grau histológico, dosagem de receptores hormonais e outros fatores
avaliados por imunohistoquíca são também determinantes para o prognóstico da evolução da
doença (Buitrago et al., 2011).
Tabela 02 – Definição do TNM patológico.
pT - Tumor primário
Ptx Não avaliável
pT0 Nenhuma evidência do tumor primário
pTis Carcinoma in situ
Tis CDIS (Carcinoma ductal in situ)
Tis CLIS (Carcinoma lobular in situ)
Tis Paget (Doença de Paget do mamilo sem carcinoma invasivo ou in situ na mama)
pT1 Tumor ≤ 2 cm
pT1mi Microinvasão (foco ou focos ≤ 0,1 cm)
pT1a > 0,1 cm e ≤ 0,5 cm
pT1b > 0,5 cm e ≤ 1 cm
pT1c >1 cm e ≤ 2 cm
pT2 Tumor > 2cm e ≤ 5 cm
pT3 Tumor > 5 cm
Continua
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23
Continuação
Continua
pT4 Tumor de qualquer tamanho com invasão da parede torácica e/ou pele (com
ulceração ou nódulos)
pT4a
Extensão da parede torácica (invasão de costelas, músculos intercostais e músculo
serrátil anterior); a invasão de músculo peitoral isoladamente não está incluída
pT4b Edema (incluindo peau d’orange), ulceração ou nódulos-satélite ipsilaterais na pele da
mama
pT4c Presença de ambos pT4a e pT4b
pT4d Carcinoma inflamatório
pN – Linfonodos regionais (requer excisão com avaliação histológica de pelo menos o
nível I axilar (6 ou mais linfonodos)
pNX Linfonodos regionais não avaliados
pN0 Ausência de metástases ao exame histológico de rotina
pN0 (i+)
Presença de células tumorais isoladas (CTI), detectadas por HE ou por exame
imunohistoquímico (menor ou igual a 0,2 mm ou até 200 células em uma
única secção histológica completa do linfonodo)
pN0 (i-) Pesquisa imunohistoquímica negativa para células neoplásicas isoladas
pN0 (mol+) Pesquisa molecular (geralmente RT-PCR) para células tumorais positivas, mas
sem nenhuma célula detectada nos cortes corados pelo HE ou
imunohistoquímica
pN0 (mol-) Pesquisa molecular para células neoplásicas isoladas negativa
pN1 Metástase em 1 a 3 linfonodos axilares ipsilaterais e/ou linfonodos da cadeia
mamária interna pela biópsia do linfonodo-sentinela, mas não detectável
clinicamente
pN1mi Micrometástase (> 0,2 mm e/ou mais de 200 células, porém ≤ 2 mm)
pN1a Metástases em 1 a 3 linfonodos axilares, incluindo pelo menos um foco > 0,2 mm
pN1b Linfonodo da cadeia mamária interna com micrometástase ou macrometástase
detectada pelo linfonodo-sentinela, mas não detectável clinicamente
pN1c Metástases de 1 a 3 linfonodos axilares e em linfonodo da cadeia mamária interna
com micrometástase ou macrometástase detectada pela biópsia do linfonodo-
sentinela, mas não detectável clinicamente (se associada com mais de 3 linfonodos
axilares positivos, classificar como pN3b
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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24
Continuação
pN2 Metástases em 4 a 9 linfonodos ou em linfonodo da cadeia mamária interna
clinicamente aparente, na ausência de metástase axilar
pN2a Metástases em 4 a 9 linfonodos axilares, pelo menos uma metástase > 2 mm
pN2b Metástases em linfonodos da cadeia mamária interna detectadas clinicamente, na
ausência de comprometimento axilar
pN3 Metástases em 10 ou mais linfonodos axilares ou em linfonodos
infraclaviculares (nível III) ou em linfonodos da cadeia mamária interna
ipsilateral clinicamente aparentes, na presença de 1 ou mais linfonodos axilares
positivos; ou em mais de 3 linfonodos axilares com metástase microscópica
(macrometástase ou micrometástase) nos linfonodos da cadeia mamária interna
ipsilateral, clinicamente inaparente; ou em linfonodo supraclavicular ipsilateral
pN3a Metástases em 10 ou mais linfonodos axilares, pelo menos uma metástase > 2 mm ou
metástase em linfonodo infraclavicular (nível III)
pN3b Metástases em linfonodos da cadeia mamária interna ipsilateral detectadas
clinicamente na presença de um ou mais linfonodos axilares positivos; ou metástases
em mais de 3 linfonodos axilares associados com doença microscópica
(macrometástase ou micrometástase) em linfonodo sentinela da cadeia mamária
interna, mas não clinicamente aparente
pN3c Metástases em linfonodo(s) supraclavicular(es) ipsilateral (is)
pM – Metástases à distância
pMX Não avaliadas
pM0 Ausência de metástases à distância
pM1 Metástase à distância
Retirado de Manual de padronização de laudos histopatológicos (Bacchi, et. al., 2013).
Um mesmo marcador poderá ser considerado como preditivo, quando fornecer
informações úteis na seleção de pacientes susceptíveis à determinada terapêutica específica. O
protótipo do marcador preditivo são os receptores hormonais que mediam a resposta à
terapêutica hormonal adjuvante (Zuccari et al., 2008). Esses fatores prognósticos e preditivos
podem ser importantes na escolha do tratamento adequado e para determinar o risco de
recorrência e para a classificação de pacientes para ensaios clínicos (Buitrago et al., 2011). O
receptor de estrógeno e a superexpressão do HER2, por exemplo, se consolidaram como alvos
terapêuticos (Toikkanen et al., 1992).
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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25
O tamanho do tumor e o estado de linfonodos são os fatores mais importantes, tanto
que constituem a base do estadiamento TNM estabelecido e promulgado pela União
Internacional Contra o Câncer (Carter et al., 1989; Abreu e Koifman, 2002). O tamanho do
tumor está diretamente relacionado ao risco de recidiva, sendo que, nos casos de pacientes
com ausência de comprometimento metastático dos linfonodos, o tamanho do tumor torna-se
o melhor preditor desta recidiva (Abreu e Koifman, 2002). Sabe-se que pacientes com
tumores menores de 1,0 cm têm entre 10% a 20% de possibilidade de comprometimento
linfonodal e que pacientes com tumores menores de 1,0 cm com linfonodos negativos têm
uma sobrevida livre de doença em 10 anos de cerca de 90% (Rosen et al., 1993; Leitner et al.,
1995; Buitrago et al., 2011). O estado dos linfonodos é importante no câncer de mama como
indicador de sobrevida livre da doença (Cady et al., 1997; Leitner et al., 1995; Buitrago et al.,
2011). Cerca de 20% a 30% dos pacientes com linfonodos negativos irá desenvolver recidiva
no prazo de 10 anos, em comparação com cerca de 70% dos pacientes com comprometimento
de linfonodos axilares (Fisher et al., 1993; Veronesi et al., 1993; Buitrago et al., 2011).
O estadiamento tumoral pode ser clínico e patológico. O primeiro é realizado com
base na extensão do tumor, que é estabelecida através de exame físico auxiliado por exames
radiológicos, macroscópicos e histológicos. O patológico deve ser efetuado pela avaliação
macro e microscópica do espécime clínico proveniente de ressecção cirúrgica, visando
analisar a extensão da invasão do tumor no tecido, possível acometimento de estruturas
adjacentes, presença de linfonodos comprometidos e a presença de metástase a distância,
sendo definido pela classificação “pTNM”. Por conseguinte, o estadiamento tumoral é
estabelecido com base no resultado do pTNM (tabela 03) (Edge, 2010) e é diretamente
relacionado ao prognóstico.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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Tabela 03 – Estadiamento TNM para câncer de mama.
Estadiamento Combinações TNM
0 Tis N0 M0
IA T1 N0 M0
IB T0, T1 N1 mi M0
IIA T0, T1 N1 M0
T2 N0 M0
IIB T2 N1 M0
T3 N0 M0
IIIA T0, T1, T2 N2 M0
T3 N1, N2 M0
IIIB T4 N0, N1, N2 M0
IIIC Qualquer T N3 M0
IV Qualquer T Qualquer N M1
Retirado de Manual de padronização de laudos histopatológicos (Bacchi et. al., 2013).
A graduação histológica Scarff-Bloom-Richardson modificado por Elston-Ellis
conhecida como o Sistema de Classificação de Nottingham (SCN) (Elston e Ellis, 1991) é o
sistema de gradação recomendado por vários organismos profissionais a nível internacional
como a Organização Mundial de saúde (OMS), American Joint Committee on Cancer
(AJCC), da União Europeia (UE), e do Royal Colégio de Patologistas (RCPath UK) (Buitrago
et al., 2011). Diversos estudos demonstraram que pacientes com grau histológico 1 tem
melhor prognóstico. Foi descrito que pacientes com tumores de grau 1 e menores de 2 cm de
tamanho tinham um excelente prognóstico, com 99% de sobrevida em 5 anos, mesmo quando
apresentavam comprometimento de linfonodos (Henson et al., 1991). O grau histológico é
fator prognóstico de relevância, independente ou combinado com o estado dos linfonodos e
tamanho o tumor.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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27
1.1.3 Etiologia do câncer de mama
A exemplo de outros tipos, a etiologia do câncer de mama é multifatorial e alguns
fatores de risco são descritos, como: idade, história familiar, história pessoal de câncer, entre
outros (Leon et al.; 2009). De acordo com o INCA, 2014, ainda acrescentam-se fatores
ligados a aspectos endócrinos e genéticos, relacionados à vida reprodutiva da mulher,
etilismo, exposição a radiações ionizantes em idade inferior a 40 anos, obesidade,
sedentarismo e alta densidade do tecido mamário.
Segundo o INCA (2014), a idade é um dos mais importantes fatores de risco. As taxas
de incidência aumentam rapidamente até os 50 anos e após essa idade, esse aumento ocorre
mais lentamente, reforçando a participação dos hormônios femininos na etiologia da doença
(80% dos casos ocorrem após os 50 anos). A história familiar de câncer de mama está
associada a um aumento no risco relativo de cerca de duas a três vezes para o
desenvolvimento da neoplasia. Alterações genéticas (em BRCA1 e BRCA2) aumentam o
risco de desenvolver a doença, embora essas mutações sejam raras e contribuam para uma
pequena parcela de casos de câncer de mama (90% dos casos ocorrem em mulheres sem
história familiar). Amamentação, prática de atividade física e alimentação saudável estão
associadas a um menor risco de desenvolver o câncer de mama (cerca de 30% dos casos
podem ser evitados por medidas deste tipo).
Entretanto, em 50 a 80% dos casos, não se identifica nenhum desses fatores de risco, o
que sugere a existência de outros fatores envolvidos (Leon et al.; 2009). Dentro deste
contexto, alguns estudos sugerem a associação de infecções virais no desenvolvimento do
câncer de mama. Para ser considerado um vírus oncogênico no tecido mamário, o vírus deve
estar presente em amostras de câncer de mama e em alguns tecidos normais e pré-cancerosos
(Leon et al.; 2009).
1.1.4 Os vírus e o câncer de mama
Dentre os vírus que têm sido encontrados em amostras de tecido mamário neoplásico,
encontram-se o Papilomavírus humano (HPV), bem como o Vírus Epstein-Barr (EBV) e o
Vírus do tumor mamário de rato (MMTV) (Heng et al.,2009). Alguns estudos apontam uma
associação do câncer de mama com o EBV e mais recentemente com o vírus HPV, entretanto
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
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28
esta relação ainda não está bem esclarecida (Huo et al., 2012 e Leon et al.,2009). Os estudos
relativos à presença de EBV e HPV em amostras de câncer de mama apresentam resultados
controversos.
O EBV foi o primeiro vírus humano a ser diretamente implicado na carcinogênese.
Apesar de infectar mais de 90% da população do mundo, a maioria dos seres humanos
coexiste com o vírus sem sequelas graves e apenas uma pequena proporção irá desenvolver
tumores tais como Linfoma de Burkitt, câncer de nasofaringe, Linfoma de Hodgkin e
cânceres associados com imunodeficiência (Thompson et al., 2004; Lima et al., 2006).
Estudos de associação deste herpesvírus com o câncer de mama são inconsistentes, pois as
frequências encontradas para este vírus são divergentes (de 0% a 100% dos tumores) (Gristein
et al.,2002; Glaser et al.,2004; Thompson et al., 2004; Kalkan et al., 2005; Preciado et
al.,2005; Murray et al., 2006; De Paoli et al.,2007; Fawzy et al., 2008; He et al., 2009;
Lorenzetti et al., 2010; Hachana et al., 2011; Kadivar et al.,2011; Khan et al.,2011; Mazouni
et al., 2011; Baltzell et al.,2012; Huo et al., 2012).
Uma justificativa para as diferentes frequências observadas para o EBV nos tumores
mamários são as diferentes técnicas utilizadas para a detecção do vírus, como demonstrado na
tabela 04.
Tabela 04 – Técnicas de detecção do EBV em amostras de tumores mamários.
Frequência Local Técnica Autore(s)
0% Califórnia Hibridação Glaser et al., 1998
0% Itália Hibridação e Imunohistoquímica Dadmanesh et al., 2001
0% Estados Unidos Hibridação e Imunohistoquímica Deshpande et al., 2002
0% Tunísia Hibridação e Imunohistoquímica Trabelsi et al., 2008
0% Estados Unidos PCR Perrigoue et al., 2005
31% Argentina Hibridação Lorenzetti et al., 2010
31,8% PCR e Hibridação Fina et al., 2001
47,5% Emirados Hibridação e Imunohistoquímica Khan et al. 2011
51% França PCR e Imunohistoquímica Bonnet et al., 1999
68% Austrália PCR e Imunohistoquímica Glenn et al., 2012
100% Estados Unidos PCR Grinstein et al., 2002
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
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Outra das explicações para as diferentes frequências encontradas seria que diferentes
populações podem ter diferentes susceptibilidades aos EBVs, predispondo o desenvolvimento
de tumores, como demonstrado por variações geográficas e imunológicas na prevalência
destes cânceres (Thompson et al.; 2004). Kadivar e colaboradores (2011) não detectaram o
vírus EBV em nenhum dos casos estudados em pacientes iranianas com CM. Em
contrapartida, Fawzy e colaboradores (2008) encontraram frequência de 25% para o EBV nas
amostras de tecido de tumor mamário em pacientes egípcias. Hachana e colaboradores (2011)
documentaram a prevalência de 27% do vírus em amostras de pacientes tunisianas, já
Lorenzetti e colaboradores (2010) e Preciado e colaboradores (2005) documentaram
frequências de 31% e 35% do EBV, respectivamente, em pacientes argentinas.
É possível que as variações de prevalência do EBV nas amostras de câncer de mama
sejam consequência de uma dificuldade de detecção dos vírus nesse tipo de tecido, diferente
da facilidade de detecção dos mesmos em outros tipos de cânceres (Heng et al.,2009).
1.2 Vírus Epstein-Barr (EBV)
1.2.1 Histórico
Apenas a partir do início do século XX, a participação dos vírus no desenvolvimento
de neoplasias começou a ser aceita, pois alguns pesquisadores começaram a sugerir a
possibilidade de agentes virais estarem envolvidos no surgimento de tumores. Gerou-se certa
polêmica, pois isto implicava na possibilidade de transmissão do agente causador da doença
(Epstein, 2001). Em um dos primeiros e mais significativos estudos, Ellermann e Bang (1908)
estudando leucemia de galinhas, perceberam que podiam induzir o desenvolvimento da
doença em animais sadios através da inoculação de um filtrado cell-free obtido de células
tumorais. Seus achados não foram vistos com muito interesse na época, mas nos anos
seguintes, diversos autores realizaram pesquisas sob a participação de vírus em neoplasias de
vários animais. Por volta da década de 1950, novos estudos confirmaram os achados prévios,
derrubando um dogma ao confirmar que os vírus exerciam papel no desenvolvimento de
neoplasias (Epstein, 2001).
Em meio a este contexto, Epstein et al. (1964) cultivaram linhagens de linfoma de
Burkitt in vitro, em seguida, utilizaram microscopia eletrônica, através da qual foi possível
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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30
observar a presença de partículas virais, semelhantes aos membros da família Herpesvirus,
sendo posteriormente chamado de Vírus Epstein-Barr (EBV) em homenagem aos seus
descobridores. Pouco tempo após a demonstração da associação do EBV com o linfoma de
Burkitt, vários laboratórios conduziram estudos com o referido vírus. Em 1967, no laboratório
de Werner e Brigitte Henle na Filadélfia – EUA, durante análises de soros de pacientes para
rastreamento de anticorpos contra o EBV, constatou que após o desenvolvimento de
mononucleose infecciosa (MI), seu soro antes usado como controle negativo, havia se tornado
positivo para anticorpos contra o EBV (Epstein, 2001). Com base nesse evento, Henle et al.
(1968) desenvolveram um estudo utilizando o banco de soros da Universidade de Yale e logo
verificaram que todos os pacientes com história de mononucleose infecciosa apresentavam
elevados títulos de anticorpos contra o vírus, sugerindo assim, uma relação causal entre o
EBV com a referida afecção. Essa relação foi confirmada pelo estudo de Evans et al. (1968).
Adicionalmente, todos os pacientes com linfoma de Burkitt estudados por Henle et al. (1968),
também apresentaram elevados títulos de anticorpos.
Em 1966, MacMahon já sugeria que a Doença de Hodgkin (DH) deveria ser causada
por algum agente infeccioso. Contudo, foram Levine e colaboradores (1971) que relataram as
primeiras evidências do envolvimento do EBV no desenvolvimento da DH ao constatar
elevados títulos de anticorpos contra antígenos do EBV em pacientes com esse tipo de
linfoma.
Em 1973, Reedman e Klein demonstraram em células infectadas pelo EBV, o antígeno
nuclear do EBV (EBNA), sendo esta, a primeira proteína do EBV associada com o
desenvolvimento de neoplasias. Logo, alguns estudos relataram a presença do EBNA em
desordens linfoproliferativas em pacientes imunossuprimidos. Durante a década de 1980, com
o surgimento de novas terapias imunossupressoras destinadas a pacientes transplantados e o
aumento dos casos da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), os casos de doenças
linfoproliferativas associadas ao EBV também aumentaram (Okano, 2000).
Os avanços das técnicas imunológicas e moleculares de detecção viral têm
possibilitado compreender melhor o papel do EBV em diversas doenças associadas, assim
como verificar novas associações.
Atualmente, sabe-se que o EBV também é verificado em linfomas de células T,
linfomas/leucemias de células NK (do inglês, Natural killers), leucoplasia pilosa,
adenocarcinoma gástrico e adenocarcinoma oral.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
31
1.2.2 Características do vírus Epstein-Barr
O Vírus Epstein-Barr é um membro da subfamília gama-Herpervírus (Kieff, 2001).
Mede aproximadamente 150 nm de diâmetro, apresenta um cerne constituído de DNA linear
de fita dupla com cerca de 172 Kpb, envolto por um capsídeo icosadeltaédrico formado por
162 capsômeros e revestido por um envoltório glicoprotéico (Hsieh et al., 1999). Existem dois
subtipos virais chamados: tipo 1 e tipo 2, que diferem um do outro em apenas poucos genes
(Kieff, 2001).
O Genoma do EBV foi delimitado em regiões estabelecidas com base na posição dos
fragmentos no mapa de restrição da endonuclease BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H),
nomeados em ordem alfabética de acordo com o tamanho, sendo o fragmento BamHI A o
maior entre eles (Arrand et al., 1981). Foi verificado que o genoma viral apresenta regiões de
repetição cuja função não é bem esclarecida. Ambas as extremidades da forma linear do
genoma apresentam uma sequência de repetição de 500 pb cada, denominada repetição
terminal. O EBV apresenta também, quatro sequências de repetição interna (IR 1-4), de 3 Kpb
cada. Demonstrou-se que na região BamHI C do genoma viral está localizada uma sequência
denominada OriP (Origem da Replicação Plasmidial) (Kieff, 2001). Essa região contém dois
elementos chamados de FR (Family of Repeats), que inclui 20 repetições em 30 pb em
sequência; e DS (Dyad Symmetry), constituído de quatro repetições (Ambinder et al., 1991).
O EBV é amplamente distribuído no mundo, sendo estimado que mais de 90% da
população adulta esteja infectada e que a maioria destes indivíduos transmita o vírus
intermitentemente. A transmissão é mediada através da saliva, principalmente através de
beijos e perdigotos. Inicialmente, o EBV infecta células epiteliais da orofaringe, nasofaringe e
glândulas salivares, penetrando nestas células e sendo replicado. Posteriormente, os vírus
disseminam-se para tecidos linfóides subjacentes infectando linfócitos B, que representam o
principal reservatório viral (Thorley-Lawson, 2001). Nos linfócitos, a penetração é viabilizada
pela fusão do envoltório com a membrana celular (Dolcetti e Masucci, 2003). No citoplasma,
o capsídeo é desnudado e o genoma viral, antes linear, torna-se imediatamente circular, sendo
transportado para o núcleo, onde permanece sob a forma de DNA epissomal
extracromossômico (Kieff, 2001; Hsieh et al., 1999).
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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32
Figura 02 – Genoma do Vírus Epstein-Barr.
Fonte: Young e Murray, 2003.
No estado epissomal o vírus é descrito como latente, sendo replicado apenas durante a
mitose da célula hospedeira. Apesar de seu genoma poder codificar cerca de 100 genes, pode-
se verificar a expressão de até 12 genes durante a latência, dependendo do tipo celular ou
estado imunológico do hospedeiro. Os produtos desses genes latentes incluem seis proteínas
conhecidas como antígenos nucleares do EBV (Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen), EBNA-
1, EBNA-2, EBNA-3A, -3B (EBNA4), -3C (EBNA6) e LP (Leader Protein, também
conhecida como EBNA5); três proteínas latentes de membrana (Latent Membrane Protein):
LMP-1, LMP-2A e LMP-2B; duas pequenas moléculas de RNA: EBER-1 e EBER-2
(Epstein-Barr Virus Encoded small RNA) e transcritos com múltiplos splices da região
BamHI A do genoma viral, BARF0 (BamHI A Right-ward Open Reading Frame) e BARF1
(Ambinder e Mann, 1994). Sabe-se que linfócitos B primários infectados pelo EBV in vitro
tornam-se imortalizados, assumindo um fenótipo denominado de linhagem celular
linfoblastóide com potencial proliferativo ilimitado (Le Roux et al., 1994).
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33
Da observação de que os genes latentes virais não são expressos concomitantemente
nas diversas células de tecidos ou linhagens tumorais EBV positivas, foi proposta a existência
de quatro tipos de latência com padrões distintos de expressão, descritos na tabela 05.
Tabela 05: Expressão de genes latentes do EBV quanto aos tipos de latência e tecido
associado.
TIPO DE
LATÊNCIA TECIDO ASSOCIADO
GENES EXPRESSOS PELO EBV
EBNA-1 -2 -3A -3B -3C LP LMP1 LMP2A LMP2B EBERs BARF0 BARF1
I Linfoma de Burkitt + - - - - - - - - + + -
Carcinoma gástrico + - - - - - - +/- - + + +
II Carcinoma de
nasofaringe + - - - - - + + + + + +
DH; Linfoma de células
T + - - - - - + + + + + -
III DLPT; Linfoma-AIDS* + + + + + + + + + + + -
IV Linf. B circulantes** +/- - - - - - - + - +
Outros Hepatocarcinoma + - - - - - - - - - +
Câncer de mama + - +/-
Leiomiossarcoma*** + - +
CCEO - + + +
*Linfoma não-Hodgkin associado a AIDS
**Linfócitos B circulantes de indivíduos sadios portadores
***Leiomiossarcoma em indivíduos imunocomprometidos
DH, Doença de Hodgkin
DLPT, Doença linfoproliferativa pós-transplante
CCEO, Carcinoma de célula escamosa oral
(Lima, 2006)
Nas células epiteliais, durante a infecção primária, onde o EBV é replicado
intensamente (ciclo lítico), é possível observar a expressão de proteínas líticas virais (Callan,
2004). Enquanto que nos linfócitos B inicialmente infectados, o EBV desenvolve uma
infecção latente com padrão completo de expressão, característico da latência tipo III.
Algumas destas células são capazes de migrar a partir do local primário de infecção, podendo
ser detectadas no sangue periférico. No entanto, após o controle da infecção inicial, o número
de linfócitos B infectados reduz significativamente, da razão de cerca de 10.000 células para
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uma célula infectada por 1.000.000 de linfócitos B circulantes (Ohga et al., 2002). Também é
possível verificar uma mudança no padrão de expressão de proteínas latentes, assumindo o
padrão de latência tipo IV, caracterizado por uma mínima expressão de genes latentes, o que
possivelmente contribui para o escape do sistema imune (Hsieh et al., 1999).
Durante o ciclo lítico, as primeiras proteínas a serem observadas, denominadas
proteínas precoces imediatas, são codificadas pelos genes BZLF1 (ZEBRA) e BRLF1
(Gulley, 2001). A proteína codificada pelo BZLF1 pode regular negativamente o promotor Cp
e, consequentemente, a expressão de EBNAs, favorecendo a transição do estado latente para o
lítico. Os produtos dos dois referidos genes regulam a expressão dos genes precoces BHLF1 e
BSMLF1, que estão associados à transativação de outros genes precoces. A maioria dos
outros genes precoces está relacionada com a replicação do DNA, incluindo a DNA
polimerase viral (BALF5), uma proteína de ligação ao DNA (BALF2), timidina quinase
(BXLF1), uma exonuclease alcalina (BGLF5) e ribonucleotídeo redutase (BORF2 e BaRF1)
(Ambinder e Mann, 1994; Kieff, 2001). Posteriormente, verifica-se a expressão de genes
tardios, que consistem principalmente de proteínas estruturais do vírus ou proteínas
envolvidas na penetração celular e formação do envelope (Kieff, 2001).
O EBV usa suas proteínas virais, ações que imitam diversos fatores de crescimento,
fatores de transcrição e fatores antiapoptóticos para usurpar o controle das vias celulares que
regulam diversas funções celulares homeostáticas (Thompson et al., 2004).
Atualmente, de acordo com a International Agency from Research on Cancer, o EBV
é classificado como um agente carcinógeno do grupo I (IARC, 1997). Contudo, os
mecanismos oncogênicos empregados pelo EBV ainda não estão totalmente elucidados. Tem
sido sugerido que os efeitos tumorigênicos estejam relacionados com a expressão de seus
genes latentes que, por sua vez, podem atuar sobre mecanismos de proliferação e morte
celular.
1.2.3 Técnicas de detecção do EBV
As técnicas utilizadas para demonstrar o EBV em espécimes tumorais e que
permitiram analisar a participação do vírus no desenvolvimento das várias neoplasias
associadas incluem: amplificação de sequências conservadas do genoma viral através da
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), RT-PCR (Transcriptase reversa – PCR), hibridação
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in situ (HIS), utilizando sondas complementares tanto à sequencia do genoma viral, quanto a
segmentos de RNAm viral, imunohistoquímica, imunofluorescência, Western blotting e
Southern blot (Tsuchiya, 2002; Ambinder e Mann, 1994; Sugawara et al., 1999).
É importante ressaltar que a hibridação in situ utilizando sondas específicas para os
EBERs é considerada “padrão ouro” na detecção do vírus, pois o alvo da técnica é expresso
em elevada quantidade e em diversos tecidos. Além disso, permite ao investigador identificar
quais células abrigam o EBV no contexto histopatológico ou citopatológico. O que não é
possível utilizando outras técnicas tais como PCR ou RT-PCR, que segundo Gulley (2001),
podem amplificar sequências nucleotídicas oriundas de outras células, tais como linfócitos
infectados infiltrados no tecido.
1.2.4 EBV em tumores sólidos
Os relatos da presença do vírus em neoplasias sólidas tem se tornado cada vez mais
frequentes. O carcinoma de nasofaringe foi a primeira neoplasia de origem epitelial a ser
associada ao EBV (Wolf et al., 1973) e, desde então, tem sido vastamente estudado no
mundo. O vírus também tem sido descrito em carcinoma linfoepitelial pulmonar,
leiomiossarcomas em pacientes imunossuprimidos, câncer testicular, câncer prostático,
carcinomas de glândula salivar, de glândula lacrimal, intracervical, gástrico, hepatocelular e
de mama, embora este último permaneça controverso (Thompson et al., 2004; Lima e
Rabenhorst, 2006).
Além da elevada frequência de associação, o caráter monoclonal do genoma viral e a
presença do vírus em quase todas as células tumorais são três indícios importantes
concernentes à sua relação causal do referido vírus.
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36
1.3 Justificativa do estudo
Relatórios de serviço mostram que a grande maioria das pacientes do ambulatório de
Mastologia da Maternidade Escola Assis Chateaubriand (Fortaleza, Ceará) possui câncer de
mama avançado. Observa-se também a presença da doença em um número significante de
mulheres jovens.
Dados sobre a prevalência do EBV e sobre o perfil molecular das mulheres com
câncer de mama invasivo, levando em consideração os fatores prognósticos estabelecidos,
idade, outros marcadores moleculares, sobrevida e resposta terapêutica são de grande valia
para a caracterização das pacientes com câncer de mama do estado do Ceará. Esta
contribuição é importante para uma melhor compreensão da doença no meio cearense e soma
dados aos estudos nacionais e mundiais sobre a frequência do EBV e sobre os subtipos
moleculares desta neoplasia.
A importância dessa classificação molecular dos tumores mamários deve-se ao seu
potencial na identificação de um prognóstico mais preciso e no estabelecimento de
intervenções terapêuticas adequadas. Outro aspecto relevante é o fato de que quatro dos
marcadores propostos (RE, RP, HER2 e Ki67) já são requeridos para a rotina diagnóstica
financiada pelo SUS para a indicação de terapia específica. Desta forma, acredita-se que a
adição de marcadores complementares de alto valor prognóstico não terá grandes dificuldades
de implantação.
1.4 Hipótese
O EBV pode estar ligado à etiologia do câncer de mama.
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Verificar a presença do Vírus Epstein-Barr (EBV) em cânceres de mama de pacientes do
serviço de Mastologia da Maternidade Escola Assis Chateaubriand no estado do Ceará, no
período de 2009 a 2010, através da técnica de Hibridação in situ correlacionando com a
presença das proteínas celulares RE, RP, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 e CK8/18.
2.2 Objetivos específicos
Detectar a presença do vírus EBV em pacientes com câncer de mama utilizando a técnica
de Hibridação in situ;
Caracterizar os padrões histopatológicos dos tumores;
Verificar a expressão das proteínas celulares RE, RP, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 e
CK8/18 demonstradas através da técnica de imunohistoquímica, correlacionando com os
dados clínicos e histológicos;
Correlacionar a presença do vírus EBV com a expressão das proteínas RE, RP, HER2,
Ki67, TP53, CK5/6 e CK8/18.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Casuística
Foram obtidos tumores mamários provenientes de 75 pacientes submetidas à
mastectomia radical, quadrantectomia, biópsia ou excérese de nódulos mamários provenientes
do Ambulatório de Mastologia da Maternidade Escola Assis Chateaubriand (MEAC)
localizada em Fortaleza, Ceará registrados no arquivo do Laboratório de Patologia do
Departamento de Patologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).
De todos os casos, foram obtidos espécimes clínicos previamente fixados em
formalina e subsequentemente incluídos em blocos de parafina oriundos do serviço de
Patologia da UFC.
Foram admitidos como critérios de inclusão: (1) diagnóstico de carcinoma mamário
invasivo, (2) existência de mais de um bloco contendo amostra tumoral, (3) representatividade
de células tumorais no bloco de escolha, (4) bom estado de conservação do material (5)
disponibilidade de prontuários contendo informações relevantes ao estudo. O Ambulatório de
Mastologia da MEAC atende a cerca de 150 pacientes com câncer de mama anualmente, mas
durante a coleta das amostras para este estudo, nos deparamos com certos desafios como a
dificuldade de acesso à informação nos prontuários e aos blocos de parafina.
Foram realizados cortes histológicos de 4 µm de espessura, corados com
Hematoxilina-Eosina (HE), estes foram reavaliados pela patologista da equipe para
confirmação dos laudos e da graduação histológica e para a verificação da presença do tumor,
bem como o seu estado de conservação. Somente após este processo, os espécimes foram
submetidos às técnicas de Hibridação in situ e Imunohistoquímica.
3.2 Aspectos éticos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da MEAC sob o
parecer nº 409.985 em 30 de setembro de 2013 (Apêndice A), respeitando as recomendações
das Resoluções 196/96 e 251/97 do Conselho Nacional de Saúde do Ministério da Saúde, que
regulamentam as pesquisas envolvendo seres humanos.
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3.3 Instrumentos e procedimentos para a coleta de dados
Os dados sócio-epidemiológicos e clínicos foram registrados em fichas contendo as
informações obtidas através de consulta de prontuários (Apêndice B). Os dados
histopatológicos, tais como subtipo tumoral, grau de diferenciação, extensão da lesão e
acometimento de linfonodos foram extraídos dos laudos patológicos presentes nos respectivos
prontuários. Dados relacionados à presença de metástases à distância não puderam ser
avaliados em nenhum dos casos.
3.4 Hibridação in situ
O método utilizado neste estudo foi adaptado do descrito por Bacchi et al. (1996). A
sonda utilizada, descrita por Shibata et al. (1991), apresenta uma sequência oligonucleotídica
de 30 pb biotinilada na extremidade 3’ (5’–
AGACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA–3’) complementar ao RNA viral EBER1.
Sucintamente, o método consiste nos seguintes passos:
1. Cortes histológicos de 4 µm foram fixados em lâminas de vidro limpas e tratadas
com silano a 4%;
2. Passagem das lâminas em estufa pré-aquecida a 60º C durante 180 minutos;
3. Desparafinização e hidratação em gradiente xileno-álcool-água;
4. Bloqueio da peroxidase endógena em peróxido de hidrogênio a 3% por 20
minutos;
5. Digestão enzimática com Proteinase K (concentração final de 0,02 µg/µL) por 9
minutos;
6. Lavagem em água com DEPC 0,1%;
7. Desidratação em gradiente de água-álcool;
8. Incubação com solução de pré-hibridação (Solução de Denhardt [3,5X]; SSC
[4,5X]; EDTA [0,0075 M]; SDS [0,35%]; DNA desnaturado de esperma de
salmão; [75 µg/mL]; NaH2PO4 [0,75 M]; Sulfato de Dextrano [10%]) por 60
minutos em estufa a 37ºC;
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9. Incubação com solução de hibridação (Solução de Denhardt [2X]; Formamida
[50%]; Sulfato de Dextrano [2%]; NaH2PO4 [0,002 M]); sonda na concentração
0,3 ng/µL) por 16 horas em estufa a 37ºC;
10. Incubação com Streptoavidina primária (GenPoint - DakoCytomation®) (diluição
1:400) por 15 minutos a 37ºC;
11. Biotinil-Tiramida (GenPoint - DakoCytomation®) por 15 minutos a 37ºC e
12. Strepto-Peroxidase – secundária (GenPoint - DakoCytomation®) por 15 minutos a
37º C;
13. Revelação com o cromógeno DAB líquido (3,3’-diaminobenzide)
(DakoCytomation®) preparado conforme as recomendações do fabricante;
14. Contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi;
15. Desidratação em gradiente de água-álcool-xileno;
16. Montagem das lâminas com lamínulas e Bálsamo de Canadá.
Em cada bateria de reação, foi adicionado como controle positivo, um caso de
adenocarcinoma gástrico sabidamente positivo pelo EBV.
3.5 Imunohistoquímica
Realizou-se o método imunohistoquímico da estreptoavidina-biotina-peroxidase
adaptado de Hsu et al. (1981) para a detecção das proteínas celulares RE, RP, HER2, Ki67,
TP53, CK5/6 e CK8/18 conforme descrito a seguir:
1. Cortes histológicos de 4 µm foram fixados em lâminas de vidro limpas e tratadas
com silano a 4%;
2. Passagem das lâminas em estufa pré-aquecida a 60ºC durante 180 minutos;
3. Desparafinização e hidratação em gradiente xileno-álcool-água;
4. Recuperação antigênica em panela pressurizada (Pascal - DakoCytomation®)
utilizando tampão Citrato 10 mM pH=6,0 (120º C, 18 psi) por 3 minutos e 40
segundos;
5. Bloqueio da peroxidase endógena em peróxido de hidrogênio a 3% por 10
minutos;
6. Incubação das lâminas com anticorpo primário (RE – Spring Bioscience®,
diluição 1:50; RP - Spring Bioscience®, diluição 1:50; HER2 - Spring
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Bioscience®, diluição 1:80; Ki67 - Spring Bioscience®, diluição 1:80; TP53 -
Spring Bioscience®, diluição 1:50; CK5/6 Biocare medical®, diluição 1:70 e
CK8/18 Biocare medical®, diluição 1:150) em geladeira (4 a 8ºC) por 16 horas;
7. Detecção pelo sistema LSAB/HRP seguindo as recomendações do fabricante
(tabela 06);
8. Revelação com o cromógeno DAB líquido (3,3’-diaminobenzide)
(DakoCytomation®) preparado conforme as recomendações do fabricante;
9. Contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi;
10. Desidratação em gradiente de água-álcool-xileno;
11. Montagem das lâminas com lamínulas e Bálsamo de Canadá.
Em cada bateria de imunohistoquímica foi incluído um espécime clínico sabidamente
positivo para cada proteína como controle positivo das reações.
3.6 Critérios para Análise das lâminas
Admitiu-se como marcação, a presença de uma coloração marrom característica,
adquirida pelo cromógeno após oxidação, situadas nas regiões celulares previstas para cada
alvo avaliado (tabela 06) em contraste com o azul/violeta conferido pela hematoxilina
constatada por microscopia óptica.
Tabela 06: Regiões celulares de expressão dos alvos das técnicas empregadas e os
respectivos clones dos anticorpos e kits de detecção.
Técnica Alvo Região celular de
expressão
Clone Kit de detecção
Hibridação in situ EBER1 Nuclear - GenPoint
Imunohistoquímica RE Nuclear SP1 Match 4
RP Nuclear SP42 Match 4
HER2 Membranar SP3 Match 4
Ki67 Nuclear SP6 DBS
TP53 Nuclear SP5 DBS
Continua
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42
Continuação
Técnica Alvo Região celular de
expressão
Clone Kit de detecção
Imunohistoquímica CK5/6 Citoplasmática CK5/6.007 Match 4
CK8/18 Citoplasmática 5D3 Easy path
GenPoint - DakoCytomation®; Match 4 - Universal HRP-polymer detection (Biocare
Medical®); DBS - Universal HRP immunostaining kit (Diagnostic BioSystems®); Easy Path
– Sistema de detecção ultra estreptavidina (Erviegas®).
No caso da Hibridação in situ, considerou-se positivo qualquer marcação nuclear em
células tumorais, independente do percentual de células marcadas.
Quanto à imunohistoquímica, o índice de marcação LI (do inglês, Labelling índex) foi
estimado através da contagem manual utilizando microscopia óptica (Landberg e Ross, 1993).
Foram selecionados campos aleatórios com representativa quantidade de células tumorais.
Um mínimo de 300 células foi contado e o índice de marcação foi calculado com base na
seguinte fórmula:
LI = (Total de células marcadas) / (Total de células contadas) X 100
Os critérios de positividade definidos para as diferentes proteínas detectadas foram
estabelecidos de acordo com a tabela 07.
Tabela 07: Critérios de positividade definidos para as proteínas detectadas por
imunohistoquímica.
Proteína Negativo Positivo
RE Nenhuma coloração ou menos de 1% dos
núcleos das células neoplásicas corados.
Coloração nuclear em 1% ou mais dos
núcleos das células neoplásicas.
RP Nenhuma coloração ou menos de 1% dos
núcleos das células neoplásicas corados.
Coloração nuclear em 1% ou mais dos
núcleos das células neoplásicas.
Continua
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Continuação
Proteína Negativo Positivo
HER2 Escore 0 ausência de reatividade ou
reatividade em ≤ 10% das células
tumorais.
Escore + Reatividade fraca em > 10%
das células tumorais, mas a coloração é
incompleta, só parte da membrana é
positiva.
Escore ++ Reatividade fraca ou
moderada, mas completa em > 10% das
células tumorais ou há coloração intensa,
circunferencial ≤ 30% das células
tumorais.
Escore +++ Mais de 30% das células
tumorais mostram coloração intensa,
circunferencial, homogênea.
Ki67 Nenhuma coloração ou menos de 1% dos
núcleos das células neoplásicas corados.
Coloração nuclear em 1% ou mais dos
núcleos das células neoplásicas.
TP53 Nenhuma coloração nuclear ou menos de
30% das células neoplásicas coradas.
Marcação nuclear em ≥ 30% das células
neoplásicas.
CK5/6 Nenhuma coloração membranosa ou
citoplasmática ou menos de 25% das
células neoplásicas coradas.
Marcação membranosa ou citoplasmática
em mais de 25% das células neoplásicas.
CK8/18 Nenhuma coloração membranosa ou
citoplasmática ou menos de 25% das
células neoplásicas coradas.
Marcação membranosa ou citoplasmática
em mais de 25% das células neoplásicas.
(Subhawong et. al., 2009; Bacchi et. al., 2013)
3.7 Análise estatística
Os dados sócio-epidemiológicos e clínicos, assim como os resultados das técnicas de
hibridação in situ e imunohistoquímica foram demonstrados através de gráficos e tabelas com
o auxílio do programa Microsoft Excel® 2007. A correlação das variáveis observadas foi
realizada através do programa estatístico EPINFO® versão 6.04d e SPSS® 17.0, utilizando-se
o Teste do Qui-quadrado (x2), Teste Exato de Fisher, Correlação Linear de Spearman e de
Pearson. Foram considerados estatisticamente significantes, os valores de p ≤ 0,05.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abreu E, Koifman S. Fatores prognósticos no câncer da mama feminina. Revista brasileira de
cancerologia. v. 48, p. 113 – 131, 2002.
Ambinder RF, Mann RB. Detection and characterization of Epstein-Barr virus in clinical
specimens. Am. J. Pathol., v. 145, n. 2, p. 239-252, 1994.
Ambinder RF et al. Functional Domains of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1.
Journal of Virology, v. 65, n. 3, p. 1466-1478, 1991.
Andreopoulou E, Hortobagyi GN. Prognostic Factors in Metastatic Breast Câncer: Successes
and Challenges Toward Individualized Therapy. J Clin. Oncol., v. 26, p. 3660–3662, 2008.
Arrand JR et al. Molecular cloning of the complete Epstein-Barr virus genome as a set of
overlapping restriction endonuclease fragments. Nucleic Acids Research, v. 9, n. 13, 1981.
Bacchi CE et al. AIDS-related lymphoma in Brazil. Histopatology, immunophenotype and
associated with Epstein-Barr Virus. Am. J. Clin. Pathol., v. 105, p. 230-237,1996.
Bacchi CE, Melo CRA, Franco MF, Neto RA. Manual de padronização de laudos
histopatológicos. Sociedade Brasileira de Patologia, 4 ed. São Paulo: Manole, 2013.
Baltzell K, Buehring GC, Krishnamurthy S, Kuerer H, Shen HM, Sison JD. Epstein-Barr
virus is seldom found in mammary epithelium of breast cancer tissue using in situ molecular
methods. Breast Cancer Res Treat., v. 132, n. 1, p. 267-74, 2012.
Benz CC, Scott GJ, Sarup JC et al: Estrogen- dependent tamoxifen-resistant Tumorigenic
growth of MCF-7 cells transfected with HER-2/neu. Breast Câncer Res Treat., v. 24, p. 85-95,
1992.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
45
Bonnet M, Guinebretiere J-M, Kremmer E, Grunewald V, Benhamou E et al. Detection of
Epstein-Barr virus in invasive breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 91, p. 1376 – 1381, 1999.
Buitrago F, Uemura G, Sena MCF. Fatores prognósticos em câncer de mama Com. Ciências
Saúde, v. 22, p.69-82, 2011.
Cady B. Use of primary breast carcinoma characteristics to predict lymph node metastases.
Câncer, v. 79, p. 1856–1861. 1997.
Callan MFC. The immune response to Epstein-Barr virus. Microbes and Infection, v. 6, p.
937-945, 2004.
Carey LA, Perou CM, Livasy CA, Dressler LG, Cowan D, Conway K, Karaca G, Troester
MA, Tse CK, Edmiston S, Deming SL, Geradts J, Cheang MC, Nielsen TO, Moorman PG,
Earp HS, Millikan RC. Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast
Cancer Study. JAMA, v. 295, p. 2492-2502, 2006.
Carey LA. Through a glass darkly: advances in understanding breast cancer biology. 2000-
2010. Clin Breast Cancer, v. 10, p. 188-195, 2010.
Carter CL, Allen C, Henson DE. Relation of tumor size, lymph node status and survival in
24740 breast cancer cases. Cancer, v. 63, p. 181-187, 1989.
Cheang MC, Voduc D, Bajdik C, Leung S, McKinney S, Chia SK, Perou CM, Nielsen TO.
Basal-like breast cancer defined by five biomarkers has superior prognostic value than triple-
negative phenotype. Clin Cancer Res., v. 14, p. 1368-1376, 2008.
Cheang MC, Chia SK, Voduc D, Gao D, Leung S, Snider J, Watson M, Davies S, Bernard PS,
Parker JS, Perou CM, Ellis MJ, Nielsen TO. Ki67 index, HER2 status, and prognosis of
patients with luminal B breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 101, p. 736-750, 2009.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
46
Clark GM. Prognostic and predictive factors. In: Harris JR, Lippman ME, Morrow M,
Hellman S, editors. Diseases of breast, 5th ed., Philadelphia: Lippincott-Raven, p. 461-70,
1996.
Creighton CJ. The molecular profile of luminal B breast cancer. Biologics, v. 6, p. 289-297,
2012.
Dadmanesh F, Peterse JL, Sapino A, Fonelli A, Eusebi V. Lymphoepithelioma-like carcinoma
of the breast: lack of evidence of Epstein-Barr virus infection. Histopathol., n. 38, p. 54-61,
2001.
De Paoli P, Pratesi C, Bortolin MT. The Epstein Barr Virus DNA Levels As A Tumor Marker
In EBV-Associated Cancers. J Cancer Res Clin Oncol., v. 133, p. 11, p. 809-15, 2007.
Deshpande CG, Badve S, Kidwai N, Longnecker R. Lack of expression of the Epstein-Barr
Virus (EBV) gene products, EBERs, EBNA1, LMP1, and LMP2A, in breast cancer cells. Lab
Invest., v. 82, p.1193-1199, 2002.
Di Fiore PP, Pierce JH, Fleming TP, Hazan R, Ullrich A. King CR, Schlessinger J, Aaronson
SA. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed
phenotype to NIH 3T3 cells. Cell, v. 51, p. 1063-1070, 1987.
Diab SG, Clark GM, Osborne CK, Libby A, Allred DC, Elledge M. Tumor characteristics
and clinical outcome of tubular and mucinous breast carcinomas. J Clin Oncol., v. 17, p. 1442
- 1448, 1999.
Dolcetti R, Masucci MG. Epstein-Barr vírus: Induction and controlo of cell transformation.
Journal of Cellular Physiology, v. 196, p. 207-218, 2003.
Edge SB, Burd DR, Compton CC et al. AJCC câncer staging handbook. 7 ed. New York:
Springer, 2010.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
47
Ellerman V, Bang O. Experimentelle leukÌmie beihÏhnern. Zentralbl. Bakt. Abt. I (Orig.), v.
46, p. 595-609, 1908.
Ellis I et al. Tavassoli F.A., Devilee P. (Eds.): World Health Organization Classification of
Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs.
IARC Press: Lyon, 2003.
Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast câncer I. The value of
histological grade in breast câncer: experience from a large study with long-term follow-up.
Histopathology, v. 19, p. 403-410, 1991.
Rakha EA, El-Sayed ME, Green AR, Lee AHS, Robertson JF, Ellis IO. Prognostic Markers in
Triple-Negative Breast Cancer. Cancer, v. 109, n. 1, 2007.
Epstein MA, Achong BG, Barr YM. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s
lymphoma. Lancet, p. 702-703, 1964.
Epstein MA. Historical background. Phil. Trans. R. Soc. Lond B., v. 356, p. 413-420, 2001.
Evans AS, Niderman JC, Mccollum RW. Seroepidemiologic studies of infectious
mononucleosis with EB vírus. New England Journal of Medicine, v. 279, p. 1121-1127, 1968.
Fawzy S, Sallam M, Awad NM. Detection of Epstein-Barr Virus In Breast Carcinoma In
Egyptian Women. Clin Biochem., v. 41, n. 7-8, p. 486 – 492, 2008.
Fernandez MJ, Farina GJ, Arangoncillo BP. Immunohistochemical expression of p-53 and c-
ERβ-2 in breast carcinoma: relation with epide- miologic factors, histologic featuresand
prognosis. Gen & Diagnostic Pathol., v. 142, p. 289-96,1997.
Ferrero-Pous M, Hacene K, Bouchet C et al. Relationship between c-ERβB-2 and other tumor
characteristics in breast câncer prognosis. Clin. Câncer Res., v. 6, p. 4745–4754, 2000.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
48
Fina F, Romain S, Ouafik L, Palmari J, Ben Ayed F et al. Frequency and genome load of
Epstein-Barr virus in 509 breast cancers from different geographical areas. Br J Cancer., v.
84, p. 783 – 790, 2001.
Fisher ER, Anderson S, Redmond C, Fisher B. Pathologic findings from the National Surgical
Adjuvant Breast Project Protocol B-06: 10-year pathologic and clinical prognostic
discriminants. Câncer, v. 71, p.. 2507–2514, 1993.
Geyer FC, Rodrigues DN, Weigelt B, Reis-Filho JS. Molecular classification of estrogen
receptor-positive/luminal breast cancers. Adv Anat Pathol., v. 19, p. 39-53, 2012.
Geyer FC, de Nigro MV. Tipos histológicos especiais de câncer de mama. Onco&, 2013.
Glaser SL, Ambinder RF, DiGiuseppe JA, Horn-Ross PL, Hsu JL. Absence of Epstein-Barr
virus EBER-1 transcripts in an epidemiologically diverse group of breast cancers. Int J
Cancer, v. 75, p. 555-558, 1998.
Glaser SL, Hsu JL, Gulley ML. Epstein-Barr virus and breast cancer: state of the evidence for
viral carcinogenesis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., v. 13, n. 5, p. 688 – 697, 2004.
Glenn WK, Heng B, Delprado W, Lacopetta B, Whitaker NJ, Lawson JS, Epstein-Barr virus,
human papillomavirus and mouse mammary tumour virus as multiple viruses in breast cancer.
PloS One, v. 7, n. 11, 2012.
Grinstein S, Preciado MV, Gattuso P, Chabay PA, Warren WH et al. Demonstration of
Epstein-Barr virus in carcinomas of various sites. Cancer Res., v. 62, p. 4876-4878, 2002.
Goldhirsch A, Winer EP, Coates AS, Gelber RD, Piccart- Gebhart M, Thürlimann B, Senn
HJ. Personalizing the treat- ment of women with early breast cancer: highlights of the St
Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2013.
Ann Oncol., v. 24, p. 2206-2223, 2013.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
49
Guarneri V, Conte P. Metastatic breast cancer: therapeutic options according to molecular
subtypes and prior adjuvant therapy. Oncologist, v. 14, p. 645-656, 2009
Gulley ML. Molecular diagnosis of Epstein-Barr vírus-related diseases. J. Mol. Diagn., v. 3,
n. 1, p. 1-10, 2001.
Gutierrez C, Schiff R. HER2: biology, detection, and clinical implications. Arch Pathol Lab
Med., v. 135, p. 55-62, 2011.
Hachana M, Amara K, Ziadi S, Romdhane E, Gacem RB, Trimeche M. Investigation of
Epstein-Barr virus in breast carcinomas in Tunisia. Pathol Res Pract., v. 207, n. 11, p. 695 –
700, 2011.
He JR, Song EW, Ren ZF. Research advancement on relationship between Epstein-Barr virus
and breast cancer. Chinese Journal of Cancer, v. 28, n. 8, 2009.
Heng B, Glenn WK, Ye Y, Tran B, Delprado W, Lutze-Mann L, Whitaker NJ, Lawson JS.
Human papilloma virus is associated with breast cancer. British Journal of Cancer, v. 101, p.
1345 – 1350, 2009.
Henle G, Henle W, Diehl V. Relation of Burkitt’s tumor-associated herpes-type virus to
infectious mononucleosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, v.
59, p. 94-101, 1968.
Henson DE, Ries L, Freedman LS, Carriaga M. Relationship among outcome, stage of
disease, and histologic grade for 22,616 cases of breast cancer. The basis for a prognostic
index. Câncer, v. 68, p. 2142-2149, 1991.
Hoadley KA, Weigman VJ, Fan C, Sawyer LR, He X, Troester MA, Sartor CI, Rieger-House
T, Bernard PS, Carey LA, Perou CM. EGFR associated expression profiles vary with breast
tumor subtype. BMC Genomics, v. 31, p. 8-258, 2007.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
50
Hollstein M et al. P53 mutations in human cancers. Science, v. 253, n. 49, 1991.
Hsieh WS, Ambinder RF, Lemas MV. The biology of Epstein-Barr virus in post-transplant
lymphoproliferative disease. Transplant Infectious Disease, v. 1, p. 204-212, 1999.
Hsu SM, Raine L, Fagner H. Use of avidin-biotin peroxidade complex (ABC) in
immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabled antibody (PAP)
procedures. J. Histochem. Cytochem., v. 29, p. 577-580, 1981.
Huo Q, Zhang N, Yang Q. Epstein-Barr virus infection and sporadic breast cancer risk: A
meta analysis. Plos one, v. 7, n. 2, 2012.
IARC – International Agency of Research on Cancer. Epstein-Barr vírus and Kaposi’s
sarcoma hervesvirus/human herpesvirus 8. IARC monographs on the evaluation of
carcinogenic risks to humans, v. 70, Lyon, 1997.
Ignatiadis M, Bedard P, HaibeKains B, Singhal S, Loi S, Criscitiello C, Desmedt C, Bontempi
G, Piccart M, Piccart M, Sotiriou C. A meta analysis of gene expression profiling studies
identifies clinically relevant oncogenic pathways in basal like breast cancer. Cancer Res., v.
69, p. 106, 2009.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA (Brasil).
Estimativa 2014 - Incidência do Câncer no Brasil. Disponível em:
http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/. Acesso em 01 de outubro de 2014.
Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Thun, MJ. Câncer statistics, Cancer J Clin., v. 59, p. 225–
49, 2009.
Kadivar M, Monabati A, Joulaee A, Hosseini N. Epstein-Barr Virus And Breast Cancer: Lack
Of Evidence For An Association In Iranian Women. Pathol Oncol Res., v. 17, n. 3, p. 489 –
492, 2011.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
51
Kalkan A, Ozdarendeli A, Bulut Y, Yekeler H, Cobanoglu B, Doymaz M. Investigation Of
Epstein-Barr Virus Dna In Formalin-Fixed And Paraffin- Embedded breast Cancer Tissues.
Med Princ Pract., v. 14, n. 4, p. 268-71, 2005.
Kennecke H, Yerushalmi R, Woods R, Cheang MC, Voduc D, Speers CH, Nielsen TO,
Gelmon K. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol., v. 28, p. 3271-3277,
2010.
Khan G, Philip PS, Al Ashari M, Houcinat Y, Daoud S Localization of Epstein-Barr virus to
infiltrating lymphocytes in breast carcinomas and not malignant cells. Exp Mol Pathol., v. 91,
n. 1, p. 466-70, 2011.
Kieff E, Rickinson AB. Epstein-Barr virus and its replication. In: Fields BN et al. Virology. 4ª
ed. Philadelphia: Lippincott William & Wilkins, 2001. 3280p.
Konecny G, Pauletti G, Pegram M, Untch M, Dandekar S, Aguilar Z, Wilson C, Rong HM,
Bauerfeind I, Felber M, Wang H-J, Beryt M, Seshadri R, Slamon DJ. Quantitative association
between HER-2/neu and steroid hormone receptors in hor- mone receptor positive primary
breast câncer.J Natl Câncer inst., v. 95, p. 142-153, 2003.
Kreike B, Van Kouwenhove M, Horlings H, Weigelt B, Peterse H, Bartelink H, Van de
Vijver MJ. Gene expression profiling and histopathological characterization of triple-
negative/basal-like breast carcinomas. Breast Cancer Res., v. 9, p. R65, 2007.
Landberg G, Ross G. Proliferating cell nuclear antigen and Ki67 antigen expression in human
haematopoietic cells during growth stimulation and differenciation. Cell Prolif., v. 26, p. 427-
437, 1993.
Le Roux A, Kerdiles B, Walls D, Dedieu JF, Perricaudet M. The Epstein-Barr virus
determined nuclear antigens EBNA-3A, -3B, and -3C repress EBNA-2-mediated
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
52
transactivation of the viral terminal protein 1 gene promoter. Virology, v. 205 (2), p. 596-
602, 1994.
Leitner SP, Swern AS, Weinberger D et al. Predictors of recurrence for patients with small
(one centimeter or less) localized breast câncer (T1a,b N0 M0). Cancer, v. 76, p. 2266–2274,
1995.
Leon DC, De Montiel DP, Nemcova J, Mykyskova I, Turcios E, Villavicencio V, Cetina L,
Coronel A, Hes O. Human Papillomavirus (HPV) in breast tumors: prevalence in a group of
Mexican patients. BMC Cancer, v. 9, n. 26, 2009.
Levine PH et al. Elevated antibody titers to Epstein-Barr vírus in Hodgkin’s disease. Cancer,
v. 27, p. 416-421, 1971.
Lima MAP, Rabenhorst SHB. Associação do vírus de Epstein-Barr (EBV) com tumores
sólidos. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 52(1), p. 87-96, 2006.
Lima MAP. Estudo do Vírus Epstein-Barr (EBV) em adenocarcinoma gástrico: frequência,
associação clínico-histopatológica e relação com a expressão das proteínas BCL-2, BAX e C-
MYC. Dissertação de mestrado. Fortaleza-CE, 2006.
Lorenzetti MA, De Matteo E, Gass H, Martinez Vazquez P, Lara J, Gonzalez P, Preciado
MV, Chabay PA. Characterization of Epstein Barr Virus Latency Pattern In Argentine Breast
carcinoma. Plos One, v. 5, n. 10, 2010.
Lopes AA, Oliveira AM, Prado CBC. Principais genes que participam da formação de
tumores. Revista de Biologia e Ciências da Terra, v. 2, p. 02, 2002.
Macmahon, B. Epidemiology of Hodgkin’s disease. Cancer Res., v. 26, p. 1189-1201, 1966.
Marie K, Par-Ola B, Dorthe G, Kristina L, Per M, Marten F, for the South Sweden Breast
Câncer Group. The prognostic value of Ki67 is dependent on estrogen receptor estado and
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
53
histological grade in premenopausal patients with node-negative breast cancer. Modern
Pathology, v. 23, p. 251–259, 2010.
Mazouni C, Fina F, Romain S, Ouafik L, Bonnier P, Brandone JM, Martin PM. Epstein-Barr
virus as a marker of biological aggressiveness in breast cancer. British Journal of Cancer, v.
104, p. 332–337, 2011.
Murray PG. Epstein-Barr virus in breast cancer: artefact or aetiological agent? J. Pathol., v.
209, n. 4, p. 427 – 429, 2006.
Ohga S et al. Immunological aspects of Epstein-Barr virus infection. Critical Reviews in
Oncology/Hematology, v. 44, p. 203-215, 2002.
Okano M. Haematological associations of Epstein-Barr vírus infection. Baillieres Best Pract.
Res. Clin. Haematol., v. 13, n. 2, p. 199-214, 2000.
Perrigoue JG, den Boon JA, Friedl A, Newton MA, Ahlquist P et al. Lack of association
between EBV and breast carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.. n. 14, p. 809-814,
2005.
Preciado MV, Chabay PA, De Matteo EN, Gonzalez P, Grinstein S, Actis A, Gass HD.
Epstein-Barr virus in breast carcinoma in Argentina. Arch Pathol Lab Med., v. 129, n. 3, p.
377 – 381, 2005.
Press MF, Berstein L, Thomas PA et al. HER-2/neu gene amplification characterized by
fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J Clin
Oncol., v. 15, p. 2894- 2904, 1997.
Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B et al. Trastuzumabe after adjuvant
chemotherapy in HER-2-positive breast cancer. N Engl J Med., v. 353, p. 1659-1672, 2005.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
54
Pollack JR, Sorlie T, Perou CM, Rees CA, Jeffrey SS, Lonning PE, Tibshirani R, Botstein D,
Borresen-Dale AL, Brown PO. Microarray analysis reveals a major direct role of DNA copy
number alteration in the transcriptional program of human breast tumors. Proc Natl Acad Sci
U S A., v. 99, p. 12963-12968, 2002.
Rakha EA, Elsheikh SE, Aleskandarany MA, Habashi HO, Green AR, Powe DG, El-Sayed
ME, Benhasouna A, Brunet JS, Akslen LA, Evans AJ, Blamey R, Reis-Filho JS, Foulkes WD,
Ellis IO. Triple-negative breast cancer: distinguishing between basal and nonbasal subtypes.
Clin Cancer Res., v. 15, p. 2302-2310, 2009.
Reedman B, Klein G. Cellular localization of Epstein-Barr vírus associated complement-
fixing antigen in producer and nonproducer lymphoblastoid cell lines. International Journal of
Cancer, v. 11, p. 499-520, 1973.
Reinfuss M, Stelmach A, Mitus J, Rys J, Duda K. Typical medullary carcinoma of the breast:
a clinical and pathological analysis of 52 cases. J Surg Oncol., v. 60, p. 89-94, 1995.
Reis-Filho JS, Milanezi F, Steele D et al. Metaplastic breast carcinomas are basal-like
tumours. Histopathol., v. 49, p. 10-21, 2006.
Ribeiro-Silva A, Ramalho LN, Garcia SB, Brandão DF, Chahud F, Zucoloto S. p63 correlates
with both BRCA1 and cytokeratin 5 in invasive breast carcinomas: further evidence for the
pathogenesis of the basal phenotype of breast cancer. Histopathology, v. 47, p. 458-466, 2005.
Rosen PP, Groshen S, Kinne DW, Norton L. Factors influencing prognosis in node-negative
breast carcinoma: analysis of 767 T1N0M0/T2N0M0 patients with long-term follow up. J
Clin Oncol., v. 11, p. 2090–2100, 1993.
Schneider J. et al. Molecular subgroups of small (pT1) breast carcinomas belonging
exclusively to the ductal infiltrating variety. Cancer Genomics Proteomics, v. 4, n. 6, p. 399-
402, 2007.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
55
Shibata D et al. Association of Epstein-Barr virus with undifferentiated gastric carcinomas
with intense lymphoid infiltration. Lymphoepithelioma-like carcinoma. Am. J. Pathol., v. 139,
p. 469-474, 1991.
Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer:
correlation of relapse and survival with amplification of HER-2/ neu oncogene. Science, v.
235, p. 177-182, 1987.
Sorlie T, Tibshirani R, Parker J et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in
independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci., v. 100, p. 8418–8423, 2003.
Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, Hastie T, Marron JS, Nobel A, Deng S, Johnsen H, Pesich R,
Geisler S, Demeter J, Perou CM, Lonning PE, Brown PO, Borresen-Dale AL, Botstein D.
Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc
Natl Acad Sci U S A., v. 100, p. 8418-8423, 2003.
Subhawong AP, Subhawong T, Nassar H, Kouprina N, Begum S, Vang R, Westra WH,
Argani P. Most Basal-like Breast Carcinomas Demonstrate the Same Rb−/ p16+
Immunophenotype as the HPV-related Poorly Differentiated Squamous Cell Carcinomas
Which They Resemble Morphologically. Am J Surg Pathol., v. 33, n. 2, p. 163-175, 2009.
Sugawara Y et al. Detection of Epstein-Barr virus (EBV) in hepatocellular carcinoma tissue: a
novel EBV latency characterized by the absence of EBV-encoded small RNA expression.
Virology, v. 256, n. 2, p. 196-202, 1999.
Yersal O, Barutca S. Biological subtypes of breast cancer: Prognostic and therapeutic
implications. World J Clin Oncol August, v. 10, p. 412-424, 2014.
Thompson MP, Kurzrock R. Epstein-Barr virus and cancer. Clin Cancer Res., v. 10, n. 3, p.
803–821, 2004.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
56
Thorley-Lawson DA. Epstein-Barr virus: exploiting the immune system. Nat. Rev. Immunol.,
vol. 1, n. 1, p. 75-82, 2001.
Toikkanen S, Helin H, Isola J Joensuu H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein
expression in breast câncer: a 30-year follow-up. J Clin Oncol., v. 10, p. 1044–1048, 1992.
Trabelsi AR, Stita W, Mokni W, Mourou A, Korbi S. Detection of Epstein Barr virus in
breast cancers with lymphoid stroma. Ann Biol Clin., v. 66, p. 59-62, 2008.
Tsuchiya S. Diagnosis of Epstein-Barr virus associated diseases. Critical Reviews in
Oncology/Hematology, v. 44, p. 227-238, 2002.
Tsutsui S, Ohno S, Murakami S, Kataoka A, Kinoshita J, Hachitanda Y. Prognostic
significance of the coexpression of p53 protein and c-erbB2 in breast cancer. Am J Surg., v.
185, p. 165-167, 2003.
Veronesi U, Galimberti V, Zurrida S et al. Prognostic significance of number and level of
axillary nodal metastases in breast cancer. Breast, v. 2, p. 224– 228, 1993.
Viale G, Regan MM, Maiorano E, Mastropasqua MG, Dell’Orto P, Rasmussen BB, Raffoul J,
Neven P, Orosz Z, Braye S et al. Prognostic and predictive value of centrally reviewed
expression of estrogen and progesterone receptors in a randomized trial comparing letrozole
and tamoxifen adjuvant therapy for postmenopausal early breast cancer: BIG 1-98. Journal of
Clinical Oncology, v. 25 p. 3846–3852, 2007.
Viale G. The current state of breast cancer classification. Ann Oncol., v. 23, p. 10, 2012.
Young LS, Murray PG. Epstein–Barr virus and oncogenesis: from latent genes to tumours.
Oncogene, v. 22, p. 5108–5121, 2003.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
57
Wolf H, Zur Hausen H, Becker V. EBV viral genomes in epithelial nasopharyngeal
carcinoma cells. Nature, v. 244, p. 245-247, 1973.
Zuccari DAPC, Berton CR, Terzian ACB, Ruiz CM. Fatores prognósticos e preditivos nas
neoplasias mamárias – importância dos marcadores imunohistoquímicos nas espécies humana
e canina – estudo comparativo. Arq Ciênc Saúde, v. 15 (4), p. 189-198, 2008.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
58
APÊNDICE I – ARTIGO
Low frequency of Epstein-Barr virus (EBV) in Breast Cancer in patients from Ceara –
Brazil
Emanuele Silva de Oliveira1; Márcia Valéria Pitombeira Ferreira
2; Sílvia Helena Barem
Rabenhorst3
1. Department of Pathology and Forensic Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.
2. Department of Pathology and Forensic Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.
3. Department of Pathology and Forensic Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.
ABSTRACT
Breast cancer (BC) is the major cause of cancer mortality among women worldwide.
Recently, an association between BC and Epstein-Barr Virus (EBV) infection was reported,
but the results are controversial. Thus, this study aimed to determine the presence of EBV in
archival formalin-fixed paraffin-embedded samples from 75 patients diagnosed with invasive
BC. EBV was detected by In situ hybridization, and the expression of ER, PR, HER2, Ki67,
TP53, CK5/6 and CK8/18 was evaluated by immunohistochemistry for tumor molecular
characterization. The median age of the patients was 55 years. Absence of known risk factors
was observed in 48.6% (34/70) of them. Five cases were positive for EBV (6.67%), however
with few infected cells. Only four tumors were diagnosed in early stages, of which two were
EBV positive, but there was no difference in the number of EBV positive cells between the
tumor degrees, nor was there a difference between specific molecular subtypes. All EBV+
tumors were ER+ and only two were TP53+. Despite the EBV presence observed, the small
numbers of cases and the weak positivity do not support the notion that EBV is an etiologic
factor for BC development. Nonetheless, it is important to note that EBV was detected based
on the latency profile in BC considering EBER expression, but other EBV targets could be
considered in BC tissue.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
59
INTRODUCTION
Breast cancer (BC) is the major cause of cancer mortality among women worldwide.
This is a multifactorial disease and although some risk factors are well described. In about 50
to 80% of cases none of the known risk factors are identified, suggesting the existence of
additional factors (1, 2). More recently, it was suggested that there is an association between
viral infection and the development of BC, such as in the case of Epstein-Barr Virus (EBV),
Human Papillomavirus (HPV) and Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) (3).
EBV is a gamma herpes virus and was the first human virus to be directly involved in
carcinogenesis. EBV is a well-established etiological factor of Burkitt's lymphoma,
nasopharyngeal cancer, Hodgkin's disease and cancers associated with immunodeficiency (4).
In BC, the presence of EBV is a controversial issue (5, 6, 7). Thus, this study aimed to
determine the presence of EBV in breast cancer of patients in the state of Ceará, Northeast
Brazil.
MATERIAL AND METHODS
Clinical specimens: The present study was approved by the Hospital Ethics Committee of the
Assis Chateaubriand Maternity School, Ceará, Brazil. Seventy-five samples from the
pathology archives at the Federal University of Ceará were obtained. Histological and
clinical data of BC cases were from pathology records. Confirmed cases of invasive breast
carcinoma of no special type were included.
In situ hybridization (ISH) for EBV: ISH was performed using deparaffinized sections.
Tissues were hybridized (8) with the probe described by Shibata et al. (9), which was
complementary to viral RNA EBER1. The cases were considered positive when there was
nuclear staining in tumor cells, regardless of the percentage of labeled cells. Cases of gastric
adenocarcinomas previously tested and found positive for EBV were used as positive reaction
controls.
Immunohistochemistry (IHC): IHC adapted from Hsu et al. (10) was performed for
detection of cellular proteins ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 for tumor
molecular characterization. In each round of IHC, we included a known positive clinical
sample for each protein as positive control reactions.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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Statistical analyses: The data were organized using tables in Microsoft Excel® 2007, and the
analyses were carried out using the statistical software EPINFO® version 6.04d and SPSS
version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Statistically significant differences were evaluated by
the chi-square test and Fisher’s exact test, and correlations between groups were analyzed by
Spearman’s and Pearson’s rank correlation coefficient. The results were considered
statistically significant when p-values were ≤ 0.05.
RESULTS
The median age of the 75 patients included in this study was 55 years, ranging from 28
to 100 years. Of these, 21 were younger than 45 years. With regard to risk factors, 32.4%
(22/70) of the women were smokers, 13.2% (9/70) drank alcohol, 20% (14/70) were
nulliparous, 8.57% (6/70) uniparous and 71.42% (50/70) multiparous. It was observed that
48.6% (34/70) of women had none of the above risk factors. Only four tumors (8.7%) were
diagnosed early stages (IA and IB). Regarding the analysis of the expression of cellular
proteins, most tumors were positive for CK8/18, ER, PR and Ki67 (frequencies: 88%, 72%,
57% and 89%, respectively), while two were present in only a small fraction of tumors,
namely TP53 (31%) and HER2 (15%). In the patients studied, the luminal subtype B was the
most common (33.3%), followed by luminal A (32%), HER2 positive (14.7%) and normal
like (14.7%).
The analysis showed positivity for EBV in five (6.67%) cases, all of them displaying
stained nuclei of tumor cells, which was occasional and weak (Figure 1).
Figure 1 – EBV-positive cases. [a] and [b] Breast carcinoma: nuclear staining in a few tumor cells
(arrows); [c] Positive control (400X).
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61
There was no difference in the number of EBV+ cells between the most advanced and
early tumor stages. One of the cases was luminal A molecular subtype, three cases were
luminal B and one case was HER2 positive. All EBV+ cases were positive for hormone
receptors, one case had Ki67 index under 10%, three had Ki67 between 25% and 35% index
and the last one had high Ki67 index. They were predominantly negative for HER2 and TP53.
One EBV+ patient was younger than 45 years old and the four other patients were
over 45. The average age of EBV+ cases was slightly lower (53) than that of the uninfected
cases (58.36).
Table 1 - Pathological profile and protein expression of ER, PR, HER2, TP53, Ki67, CK5/6
and CK8/18 in EBV+ cases (n= 5).
ISH Immunohistochemistry
Histopathology ER PR HER2 TP53 Ki67 CK5/6 CK8/18
Age R S R LI R LI R E R LI R LI R R G S. Tumor
55 + F + 60 + 20 - - - 0 + 99 - + III T2
45 + F + 5 - 0 - - + 80 + 8 - + I T2
64 + F + 40 - 0 - + - 0 + 35 - + I T1
54 + F + 80 + 40 - + - 0 + 20 - + III T1
47 + F + 80 + 80 + +++ + 95 + 25 - + III T3
ER, estrogen receptor; PR, progesterone receptor; HER2, epidermal growth factor receptor 2;
CK, cytokeratin; R, result; S, staining; F, focal; LI labelling index (%); E, score; G, grade; S.
tumor, tumor size.
DISCUSSION
For the last years, EBV has been hypothesized to have potential causal roles in breast
cancer, however, the establishment of this virus as an etiological factor of breast cancer has
been challenging (11). This virus is the most cited as a possible cause of breast cancer,
although the literature is controversial about this. The different methods used and different
populations studied may be the reason for the disparities reported (12). In this study, EBV
positivity was 6.67% in breast tumors, in disagreement with other studies using ISH (13, 14,
15, 16, 17), in which no positive cases were found. This difference could be due to our use of
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GenPoint™ Amplified Signal Detection System, which is more sensitive than the usual Dako
PNA ISH Detection kit used in the above cited studies.
On the other hand, the presence of EBV in BC has been confirmed by PCR at
frequencies varying from 0% to 100% (18, 19, 20). Even when EBV is PCR positive, this is
not a confirmation that the virus is in the tumor cells. In this way, Fina et al. (21) confirmed
their results using HIS and found that in some of the 31.8% EBV positive cases, revealed by
PCR, the signal intensity with HIS was lower in paraffin-embedded sections than in frozen
sections. This observation may explain the few EBV-staining cells in our study, where the
paraffin-embedding process can affect the preservation of the EBER molecules, making them
more difficult to detect.
Glenn et al. (11) detected EBV by PCR in situ and immunohistochemistry and found a
statistically significant difference in mean age between the EBV-positive and -negative
patients (57.3 and 65.9 years, respectively). This study showed the same tendency, but not
statistically significant (53 and 58.36 years for EBV-positive and -negative cases,
respectively). Fina et al. (21) did not find any correlation between age, tumor size, nodal
status, or histological grade, the same results as observed in the present study. However, it is
interesting to note that among the four cases with grade I (early stage) in this study, two were
EBV-positive. An agent is required to be present in the tumor from the beginning of its
development, if it is to be recognized as a cause of the disease.
Despite detecting the presence of EBV in this study, we cannot affirm that this is an
etiologic factor of breast carcinogenesis because of the low number of positives cases. The
methods chosen ensured that EBV was exclusively localized in malignant cells, however, this
technique is based on EBER-1 detection, which is a protein that may or may not be
overexpressed in the EBV latency pattern of BC. As already cited, the detection of this
protein might have also been hindered due to tissue being formalin-fixed and paraffin-
embedded, resulting in a lower signal intensity.
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REFERENCES
1. Leon DC, De Montiel DP, Nemcova J, Mykyskova I, Turcios E, Villavicencio V, Cetina L,
Coronel A, Hes O. Human papillomavirus (HPV) in breast tumors: prevalence in a group
of Mexican patients. BMC Cancer, v. 9, n. 26, 2009.
2. NATIONAL INSTITUTE FOR CANCER (INCA) José Alencar Gomes da Silva (Brazil).
Estimate 2014 - Cancer Incidence in Brazil. Available in:
http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/. Access to October 1, 2014.
3. Heng B, Glenn WK, Ye Y, Tran B, Delprado W, Lutze-Mann L, Whitaker NJ, Lawson JS.
Human papilloma virus is associated with breast cancer. British Journal of Cancer, v. 101,
p. 1345 – 1350, 2009.
4. Lima MAP, Rabenhorst SHB. Associação do Vírus Epstein-Barr (EBV) com tumores
sólidos. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 52, n. 1, p. 87 – 96, 2006.
5. Chu JS, Chen CC, Chang KJ. In situ detection of Epstein-Barr virus in breast cancer.
Cancer Lett., v. 124, p. 53 – 57, 1998.
6. Bonnet M, Guinebretiere J-M, Kremmer E, Grunewald V, Benhamou E et al. Detection of
Epstein-Barr virus in invasive breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 91, p. 1376 – 1381,
1999.
7. Grinstein S, Preciado MV, Gattuso P, Chabay PA, Warren WH et al. Demonstration of
Epstein-Barr virus in carcinomas of various sites. Cancer Res,. v. 62, p. 4876 – 4878, 2002.
8. Bacchi CE et al. AIDS-related lymphoma in Brazil. Histopatology, immunophenotype and
associated with Epstein-Barr virus. Am. J. Clin. Pathol., v. 105, p. 230-237, 1996.
9. Shibata D et al. Association of Epstein-Barr virus with undifferentiated gastric carcinomas
with intense lymphoid infiltration. Lymphoepithelioma-like carcinoma. Am. J. Pathol., v.
139, p. 469-474, 1991.
10. Hsu SM, Raine L, Fagner H. Use of avidin-biotin peroxidade complex (ABC) in
immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP)
procedures. J. Histochem. Cytochem., v. 29, p. 577-580, 1981.
11. Glenn WK, Heng B, Delprado W, Lacopetta B, Whitaker NJ, Lawson JS, Epstein-Barr
virus, human papillomavirus and mouse mammary tumour virus as multiple viruses in
breast cancer. PloS One, v. 7, n. 11, 2012.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do
serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
64
12. Khan G, Philip PS, Al Ashari M, Houcinat Y, Daoud S Localization of Epstein-Barr virus
to infiltrating lymphocytes in breast carcinomas and not malignant cells. Exp Mol
Pathol., v. 91, n. 1, p. 466-70, 2011.
13. Glaser SL, Ambinder RF, DiGiuseppe JA, Horn-Ross PL, Hsu JL. Absence of Epstein-
Barr virus EBER-1 transcripts in an epidemiologically diverse group of breast cancers. Int
J Cancer, v. 75, p. 555 – 558, 1998.
14. Dadmanesh F, Peterse JL, Sapino A, Fonelli A, Eusebi V. Lymphoepithelioma-like
carcinoma of the breast: lack of evidence of Epstein-Barr virus infection. Histopathol, v.
38, p. 54 – 61, 2001.
15. Deshpande CG, Badve S, Kidwai N, Longnecker R. Lack of expression of the Epstein-Barr
virus (EBV) gene products, EBERs, EBNA1, LMP1, and LMP2A, in breast cancer cells.
Lab Invest., v. 82, p. 1193 – 1199, 2002.
16. Trabelsi AR, Stita W, Mokni W, Mourou A, Korbi S. Detection of Epstein Barr virus in
breast cancers with lymphoid stroma. Ann Biol Clin., v. 66, p. 59 – 62, 2008.
17. Lorenzetti MA, De Matteo E, Gass H, Martinez Vazquez P, Lara J, Gonzalez P, Preciado
MV, Chabay PA. Characterization Of Epstein Barr virus latency pattern In
Argentine breast carcinoma. Plos One, v. 5, n. 10, 2010.
18. Bonnet M, Guinebretiere J-M, Kremmer E, Grunewald V, Benhamou E et al. Detection of
Epstein-Barr virus in invasive breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 91, p. 1376 – 1381,
1999.
19. Grinstein S, Preciado MV, Gattuso P, Chabay PA, Warren WH et al. Demonstration of
Epstein-Barr virus in carcinomas of various sites. Cancer Res., v. 62, p. 4876 – 4878, 2002.
20. Perrigoue JG, Den Boon JA, Friedl A, Newton MA, Ahlquist P et al. Lack of association
between EBV and breast carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., v. 14, p. 809 –
814, 2005.
21. Fina F, Romain S, Ouafik L, Palmari J, Ben Ayed F et al. Frequency and genome load of
Epstein-Barr virus in 509 breast cancers from different geographical areas. Br J Cancer, v.
84, p. 783 – 790, 2001.
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APÊNDICE II – ARTIGO
Molecular characterization of Breast Cancer in Brazilian Northeast women
Emanuele Silva de Oliveira1; Márcia Valéria Pitombeira Ferreira
2; Ana Patricia Freitas
Vieira3; Denise Ellen Francelino Cordeiro
4; Sílvia Helena Barem Rabenhorst
5
1. Department of Pathology and Forensic Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.
2. Department of Pathology and Forensic Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.
3. Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. [email protected].
4. Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. [email protected].
5. Department of Pathology and Forensic Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.
ABSTRACT
Breast cancer (BC) is the major cause of cancer mortality among women worldwide and
represents a heterogeneous group of tumors that differ in behavior, outcome, and response to
therapy. Breast tumor can be classified into five subtypes: luminal A and B, HER2-positive,
basal-like and normal-like. This study aimed to characterize BC tumors from Brazilian
Northeast women according to molecular subtypes, including the tumor supressor TP53. The
expression of ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 was evaluated by
immunohistochemistry for tumor molecular characterization in archival formalin-fixed
paraffin-embedded samples from 75 patients diagnosed with invasive BC. The median age of
the patients was 55 years. Twenty one patients were younger than 45 years. Only 8.7% of
tumors were diagnosed early. The more frequent molecular subtype was luminal B (33.3%),
followed by luminal A (32%), normal-like (14.7%), HER2-positive (14.7%) and basal-like
(5.3%). HER2-positive and basal-like included the more advanced staging. TP53 was
significantly more frequent in basal-like subtype than in luminal A. Considering the age, only
in patients up to 45 years, TP53 frequencies of triple-negative and specifically the basal-like
tumors differed significantly from luminal subtypes (A and B). These data show the
importance of TP53 as a marker for triple-negative tumors in women below 45 years.
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Although is not part of the characterization of triple-negative and HER2-positive tumors
subtypes. The verification of the TP53 frequencies offers more information about tumor
behavior. There are limited data regarding breast cancer subtypes among Brazilian women.
The significant data found was interesting and contribute to an understanding the molecular
subtypes in the population studied.
INTRODUCTION
Breast cancer (BC) is the major cause of cancer mortality among women worldwide.
This is a multifactorial disease and although some risk factors are well described (1, 2). Breast
tumors are diverse and represent a heterogeneous group of tumors that are diverse in
behavior, outcome, and response to therapy (3, 4, 5).
Recently, it has been demonstrated that breast tumor may be classified by gene
expression profiles into five subtypes based on immunohistochemical markers: luminal A and
B, HER2-positive, basal-like and normal-like (4, 6, 7).
The luminal subtypes A and B are characterized by the ER (estrogen receptor)
expression and high expression of many genes expressed by breast luminal cells. As they
differ in cell proliferation index, the Ki67 is the marker that differentiates luminal B tumors
from luminal A in clinical practice (cut off point: 14%). The ER negative tumors are further
divided into HER2-positive, basal-like and normal-like. HER2-positive tumors are
characterized by the expression of high levels of HER2 oncogene. Basal-like and normal-like
tumors are HER2 negative and they can also be classified as triple-negative. Basal-like tumors
express basal keratins (CK5/6) and many of the characteristics of breast basal epithelial cells
while, normal-like tumors are negative for CK5/6 and EGFR (7).
Even with this classification, tumors with similar pathological presentations and
markers may have different behaviors (7). Then, It is important to characterize new tumors
markers. Among the tumors marker, one of the most studied is TP53, which is associated to
poor prognosis (4), however it is not used to categorize any subtype. Knowing the tumor and
have information about its biology allow to ensure adequate therapy and to improve patients’
outcome to reduce mortality from breast cancer. Besides the importance of this classification,
there are no reports about the incidence of the molecular subtypes in the Brazilian Northeast.
Thus, this study aimed to know the distribution of mammary tumors of patients in the state of
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67
Ceará, Northeast Brazil according to the molecular subtypes, including the tumor suppressor
TP53.
MATERIAL AND METHODS
Clinical specimens: The present study was approved by the Hospital Ethics Committee of the
Assis Chateaubriand Maternity School, Ceara, Brazil. Seventy-five samples from the
pathology archives at the Federal University of Ceara were obtained. Histological and
clinical data of BC cases were from pathology records. Confirmed cases of invasive breast
carcinoma of no special type were included.
Immunohistochemistry (IHC): IHC adapted from Hsu et al. (8) was performed for detection
of cellular proteins ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 for tumor molecular
characterization. In each round of IHC, we included a known positive clinical sample for each
protein as positive control reactions.
Statistical analyses: The data were organized using tables in Microsoft Excel® 2007, and the
analyses were carried out using the statistical software EPINFO® version 6.04d and SPSS
version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Statistically significant differences were evaluated by
the chi-square test and Fisher’s exact test, and correlations between groups were analyzed by
Spearman’s and Pearson’s rank correlation coefficient. The results were considered
statistically significant when p-values were ≤ 0.05.
RESULTS
The median age of the 75 patients included in this study was 55 years, ranging from 28
to 100 years. Of these, 21 were younger than 45 years. With regard to risk factors, 32.4%
(22/70) of the women were smokers, 13.2% (9/70) drank alcohol, 20% (14/70) were
nulliparous, 8.57% (6/70) uniparous and 71.42% (50/70) multiparous. Previous history of
cancer (uterus and ovary cancer) was observed in 4.3% (3/70) of the patients, only one patient
aged 45 years, and familiar history of other cancers was observed in a larger fraction of
patients 20.3% (14/70). Two patients had a family history of cancer, smoking and alcohol
concomitantly. Conversely, 48.6% (34/70) of women had none of the above risk factors.
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As shown in table 1, only four tumors (8.7%) were diagnosed early (stages IA and IB).
Most of them belonged to the upper grades and had lymph node involvement. In neither case
distant metastases was informed.
Table 1 - Histopathological characteristics of women's tumors (≤45 and >45 years old) with
breast carcinomas.
Variables Total ≤ 45 years old > 45 years old
n (%) n (%) n (%)
Clinical staging IA 2 (4,3%) 0 (0%) 2 (6,3%)
IB 2 (4,3%) 1 (9,1%) 1 (3,1%)
IIA 8 (17,4%) 2 (18,2%) 6 (18,8%)
IIB 5 (10,9%) 3 (27,3%) 2 (6,3%)
IIIA 9 (19,6%) 1 (9,1%) 8 (25%)
IIIB 10 (21,7%) 2 (18,2%) 7 (21,9%)
IIIC 10 (21,7%) 2 (18,2%) 6 (18,8%)
IV 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
Tumor size T1 19 (26,8%) 4 (21,1%) 15 (28,8%)
T2 35 (49,3%) 12 (63,2%) 23 (44,2%)
T3 3 (4,2%) 0 (0%) 3 (5,8%)
T4 14 (19,7%) 3 (15,8%) 11 (21,2%)
Histolopathological
grade
I 16 (24,2%) 3 (15,8%) 13 (27,7%)
II 17 (25,8%) 8 (42,1%) 9 (19,1%)
III 33 (50%) 8 (42,1%) 25 (53,2%)
Lymph node
involvement
NEG 11 (19,3%) 2 (13,3%) 9 (21,4%)
POS 34 (59,6%) 10 (66,7%) 24 (57,1%)
Most tumors included in this study were positive for CK8/18, ER, PR and Ki67
(frequencies: 88%, 72%, 57% and 89%, respectively), while TP53 and HER2 were present in
a smaller fraction of tumors, (31% and 15% respectively). There were no differences in the
cellular markers frequencies between the age groups taken in account cut-off point of 45
years.
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Considering the risk factors, the frequencies of hormone receptors and CK8/18 were
higher in non-smokers (ER: 82.6% vesus 50%, RP: 65.2% vesus 45.5% and CK8/18: 91.3%
vesus 77.3%), but only the ER showed a tendency of significance (p = 0.07). The frequency of
HER2 was higher in smokers (22.7% vesus 10.9%), but these frequencies were not
statistically different. The three patients’ tumors with previous history of cancer were ER and
CK 8/18 positives and negatives to HER2 and CK 5/6. Two of them were PR and Ki67
positives and finally, one of the tumors was TP53 positive.
Regarding to molecular subtypes, in the patients studied, the luminal subtype B was
the most common (33.3%), followed by luminal A (32%). The HER2-positive and normal-
like subtypes had the same frequency (14.7%) and basal-like subtype were less common
(5.3%). The tumors classified as subtypes HER2-positive and basal-like included the more
advanced staging and those classified as normal-like subtype included grades II and III
tumors. There is a lower frequency of lymph nodes involvement in luminal A subtype tumors
(42,9%) differing statistically from the luminal B (68,4%) and HER2-positive (75%) subtypes
(p = 0.02 and 0.05 respectively).
The table 3 shows the distribution of the molecular markers according to the molecular
subtypes. From this table, it is possible to observe that, as expected, Ki67 was statistically
more frequent in luminal B than in luminal A tumors in the total sample and among patients
older than 45 years. TP53 was significantly more frequent in the basal-like than luminal A in
all patients, independently of the age. Among patients up to 45 years, all tumors triple-negativ
e subtype (basal-like and normal-like) were TP53 positive, while a low positivity was found
in the luminal A and B subtypes with a statistical difference between triple-negative and
luminal A and B, and basal-like and luminal A and B. TP53 frequencies did not differ
between the molecular subtypes among over 45 years.
Comparing the age groups, it is interesting to note that triple-negative tumors subtype
in patients up to 45 years old had TP53 statically more frequent than patients over 45 years
when compared to luminal B, while in tumors luminal B, TP53 was more frequent in patients
over 45 years old.
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Table 2 - Histopathological features of the tumors according to the molecular subtypes.
Variables LUM. A LUM. B HER2+ BL NL TN
Age n n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Total 75 24 (32%) 25 (33.3%) 11 (14.7%) 4 (5.3%) 11 (14.7%) 15 (20%)
≤ 45 21 7 (33.3%) 6 (28.6%) 3 (14.3%) 2 (9.5%) 3 (14.3%) 5 (23.8%)
> 45 54 17 (31.5%) 19 (35.2%) 8 (14.8%) 2 (3.7%) 8 (14.8%) 10 (18.5%)
Clinical staging
IA 2 2 (11.8%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
IB 2 2 (11.8%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
IIA 8 6 (35.3%) 1 (7.7%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (20%) 1 (14.3%)
IIB 5 1 (5.9%) 1 (7.7%) 2 (33.3%) 0 (0%) 1 (20%) 1 (14.3%)
IIIA 9 2 (11.8%) 2 (15.4%) 4 (66.7%) 1 (50%) 0 (0%) 1 (14.3%)
IIIB 9 1 (5.9%) 5 (38.5%) 0 (0%) 1 (50%) 2 (40%) 3 (42.9%)
IIIC 8 3 (17.6%) 4 (30.8%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (20%) 1 (14.3%)
IV 0 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
Tumor size
T1 19 7 (31.8%) 5 (20.8%) 3 (27.3%) 1 (25%) 3 (30%) 4 (28.6%)
T2 35 13 (59.1%) 11 (45.8%) 7 (63.6%) 1 (25%) 3 (30%) 4 (28.6%)
T3 3 0 (0%) 0 (0%) 1 (9.1%) 1 (25%) 1 (10%) 2 (14.3%)
T4 14 2 (9.1%) 8 (33.3%) 0 (0%) 1 (25%) 3 (30%) 4 (28.6%)
Histopathological
grade
I 16 9 (47.4%) 7 (29.2%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
II 17 5 (26.3%) 6 (25%) 4 (44.4%) 1 (33.3%) 1 (9.1%) 2 (14.3%)
III 33 5 (26.3%) 11 (45.8%) 5 (55.6%) 2 (66.7%) 10 (90.9%) 12 (85.7%)
Lymph node
involvement
NEG 11 8 (38.1%) 1 (5.3%) 0 (0%) 1 (33.3%) 1 (16.7%) 2 (22.2%)
POS 75 9 (42.9%) 13 (68.4%) 6 (75%) 2 (66.7%) 4 (66.7%) 6 (66.7%)
LUM. A, Luminal A; LUM. B, Luminal B; HER2+, HER2-positive; BL, Basal-like; NL,
Normal-like; NEG, negative; POS, positive.
Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira
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DISCUSSION
In this study, luminal B molecular subtype was the most common found (33.3%),
followed by luminal A (32%), contradicting the literature that relates the luminal A subtype is
the most frequent, representing 50%-60% and luminal B, 15%-20% of all breast cancers (7).
On the other hand, 14,7% of the tumors were classified as HER2-positive subtype,
corroborating with the 15-20% described by Yersal & Barutca (7), the triple-negative
phenotype frequency found in this study was 20%, corroborating with 16.3% observed by the
survey from Rakha et al. (4) with 1944 cases of breast carcinoma from Nottingham. Another
Brazilian study found in the literature also selected the invasive breast carcinoma and showed
different frequencies of the current study, where the luminal A subtype was the most frequent,
followed by basal-like, HER2-positive and at lastly, luminal B, however this published study
was restricted to women aged between 19 and 40 years (11).
Breast cancer is a heterogeneous disease and molecular classification is affected
by race, ethnicity and geographic variation of patients (9, 5, 10), then, molecular subtype
frequencies vary according to the different ethnic groups of patients. In Egyptian women,
luminal A subtype was the most prevalent (41.2%), followed by triple-negative (28.5%),
HER2-positive (19.4%) and luminal B (13.9%) (6). In Iranian women, luminal A subtype was
the most common (63.8%) followed by luminal B (8.4%), basal-like (15.9%) and HER2-
positive (11.9%) (9). In United States, non Hispanic white women had the highest incidence
rate of the luminal subtypes and non Hispanic black women had the highest rate of the triple-
negative subtype (12).
In this study, part of the differences among the subtypes may be due to pre selection of
the invasive breast carcinoma of no special type, while the other studies carried out tests in all
histological types of tumors. However, since the invasive breast carcinoma of no special type
is the most common type of breast cancer, the frequencies should vary slightly (13, 6).
Considering the triple-negative subdivision, in the population studied, the basal-like
subtype frequency was very low, while normal-like subtype was slightly higher than related in
the literature. In the literature, Yersal & Barutca (7) relate that the basal-like subtype
represents from 8% to 37% and normal-like subtype, 5% to 10% of all breast cancers.
Triple-negative tumors are more aggressive and were associated with high expression
of TP53 when compared with other tumor groups (4), as was also observed in this study. Han
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et al. (14) study with Korean women reveals that the high grade tumors with high TP53 and
Ki-67 were found more commonly in non-luminal tumors using cDNA microarray technique.
In this study, 31% of tumors were TP53 positive, corroborating with Ihemelandu et al. (15)
that reported in African-American women, 27.6% cases over-expressed TP53. They searched
the clinical significance of TP53 and Bcl-2 coexpression but although TP53 and Bcl-2 were
assessed concurrently, it was concluded that the TP53 positive tumors are related to basal-like
and HER2-positive subtypes and TP53 negative tumors were related to luminal subtype.
Likewise, in this study, TP53 positive was more frequent in basal-like subtype tumors,
differing significantly from the luminal A and luminal B tumors.
Considering the age, only in patients up to 45 years, TP53 frequencies of triple-
negative and specifically the normal-like tumors differed significantly from luminal subtypes.
In fact the TP53 were significantly more frequent in this age group comparing with patients
over 45 years old. This data point the importance of the age in the TP53 evaluation.
Data from this study indicate that TP53 has been shown to be important for the
scoreboard of malignancy of the triple-negative and HER2-positive tumors. It is interesting to
note the importance of TP53 as a marker of differential triple-negative tumors in women
below 45 years. Although is not part of the characterization of HER2-positive tumors subtype,
verification of the TP53 frequencies offer more information about tumor behavior.
There are limited data regarding breast cancer subtypes among Brazilian women.
Besides this study did not include a very large number of samples, the significant data found
are interesting and contribute to understanding the molecular subtypes in the population
studied.
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74
REFERENCES
1. Leon DC, De Montiel DP, Nemcova J, Mykyskova I, Turcios E, Villavicencio V, Cetina L,
Coronel A, Hes O. Human papillomavirus (HPV) in breast tumors: prevalence in a group
of Mexican patients. BMC Cancer, v. 9, n. 26, 2009.
2. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA
(Brasil). Estimativa 2014 - Incidência do Câncer no Brasil. Disponível em:
http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/. Acesso em 01 de outubro de 2014.
3. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, Van de Rijn M, Jeffrey SS, Rees CA, Pollack JR, Ross
DT, Johnsen H, Akslen LA, Fluge O, Pergamenschikov A, Williams C, Zhu SX, Lonning
PE, Borresen-Dale AL, Brown PO, Botstein D. Molecular portraits of human breast
tumours. Nature, v. 406, p. 747-752, 2000.
4. Rakha EA, El-Sayed ME, Green AR, Lee AHS, Robertson JF, Ellis IO. Prognostic
Markers in Triple-Negative Breast Cancer. Cancer, v. 109, n. 1, 2007.
5. Mehdi I, Monem AA, Al Bahrani B, Ramadhan FA. Breast cancer molecular subtypes in
oman: correlation with age, histology, and stage distribution - analysis of 542 cases. Gulf
J Oncolog., v. 1, n. 15, p. 38-48, 2014.
6. El-Hawary AK, Abbas AS, Elsayed AA, Zalata KR.
Molecular subtypes of breast carcinoma in Egyptian women: clinicopathological features.
Pathol Res Pract., v. 208, n. 7, p. 382-386, 2012.
7. Yersal O, Barutca S. Biological subtypes of breast cancer: Prognostic and therapeutic
implications. World J Clin Oncol., v. 5, n. 3, p. 412-424, 2014.
8. Hsu SM, Raine L, Fagner H. Use of avidin-biotin peroxidade complex (ABC) in
immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabled antibody (PAP)
procedures. J. Histochem. Cytochem., v. 29, p. 577-580, 1981.
9. Kadivar M, Mafi N, Joulaee A, Shamshiri A, Hosseini N.
Breast cancer molecular subtypes and associations with clinicopathological
characteristics in Iranian women, 2002- 2011. Asian Pac J Cancer., v. 13, n. 5, p. 1881-
1886, 2012.
10. Telli ML, Chang ET, Kurian AW, Keegan TH, McClure LA, Lichtensztajn D, Ford
JM, Gomez SL. Asian ethnicity and breast cancer subtypes: a study from the California
Cancer Registry. Breast Cancer Res Treat., v. 127, n. 2, p. 471-478, 2011.
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serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará
75
11. Carvalho LV, Pereira EM, Frappart L, Boniol M, Bernardo WM, Tarricone V, Tavtigian
S, Southey MC. Molecular Characterization Of Breast Cancer In Young Brazilian
Women. Rev Assoc Med Bras., v. 56, n. 3, p. 278-287, 2010.
12. Howlader N, Altekruse SF, Li CI, Chen VW, Clarke CA, Ries LA, Cronin KA. US
incidence of breast cancer subtypes defined by joint hormone receptor and HER2 status. J
Natl Cancer Inst., v. 106, n. 5, 2014.
13. Geyer, FC, de Nigro, MV. Tipos histológicos especiais de câncer de mama. Onco&,
2013.
14. Han W, Nicolau M, Noh DY, Jeffrey SS. Characterization of molecular subtypes of
Korean breast cancer: an ethnically and clinically distinct population. Int J Oncol., v. 37,
n. 1, p. 51-59, 2010.
15. Ihemelandu CU, Dewitty RL Jr, Leffall LD Jr, Suryanarayana SM, Frederick WA.
Clinical significance of p53 and bcl-2 protein coexpression phenotypes
in molecular breast cancer subtypes of pre-menopausal and post-menopausal African-
American women. Am Surg., v. 75, n. 9, p. 776-784, 2009.
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76
APÊNDICE III – TABELAS E FIGURAS COMPLEMENTARES
Figura complementar A - Percentual de casos de câncer de mama estudados distribuídos
segundo a faixa etária das pacientes (n=75).
Tabela complementar A - Percentual de casos de carcinoma mamário estudados,
distribuídos quanto à gestação e presença de fatores de risco (história prévia de câncer,
história familiar, tabagismo e etilismo.
Total ≤ 45 anos > 45 anos
n (%) n (%) n (%)
Tabagismo 22 (32,4%) 7 (36,8%) 15 (30,6%)
Etilismo 9 (13,2%) 3 (15,8%) 6 (12,2%)
Gestação 56 (80%) 15 (75%) 41 (82%)
Uníparas 6 (10,7%) 2 (33,3%) 4 (66,7%)
Multíparas 50 (89,3%) 13 (26%) 37 (74%)
História prévia (útero e ovário) 3 (4,3%) 1 (5%) 2 (4%)
História familiar (outros tipos de câncer) 14 (20,3%) 4 (21,1%) 10 (20%)
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Figura complementar B - Frequência da expressão das proteínas celulares RE, RP, HER2,
Ki67, TTP53, CK5/6 e CK8/18 e percentual de células tumorais marcadas (n=75).
Tabela complementar B - Características imunohistoquímicas de carcinomas de mama em
pacientes ≤ 45 anos e > 45 anos.
Marcador Total ≤ 45 anos > 45 anos
Valores de p n (%) n (%) n (%)
RE 54 (72%) 14 (66,7%) 40 (74,1%) 0,26
RP 43 (57%) 11 (52,4%) 32 (59,3%) 0,29
HER2 11 (15%) 03 (14,3%) 08 (14,8%) 0,17
Ki67 67 (89%) 17 (81,0%) 50 (92,6%) 0,09
TP53 23 (31%) 08 (38,1%) 15 (27,8%) 0,2
CK5/6 9 (12%) 03 (14,3%) 06 (11,1%) 0,35
CK8/18 66 (88%) 18 (85,7%) 48 (88,9%) 0,35
RE, receptor de estrógeno; RP, receptor de progesterona; HER2, receptor de fator de
crescimento epidérmico 2; CK, citoqueratina (n = 75); Valor de p calculado entre pacientes ≤
45 e > 45 anos.
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Tabela complementar C - Características imunohistoquímicas de carcinomas de mama em
pacientes tabagistas/não tabagistas e com/sem história prévia/familiar de câncer.
Tabagistas Não tabagistas Com história
prévia/familiar
Sem história
prévia/familiar
Marcadores n (%) n (%) n (%) n (%)
RE 11 (50%) 38 (82,6%) 14 (82,4%) 40 (72,7%)
RP 10 (45,5%) 30 (65,2%) 12 (70,6%) 31 (56,4%)
HER2 5 (22,7%) 5 (10,9%) 2 (11,8%) 8 (14,5%)
Ki67 19 (86,4%) 41 (89,1%) 16 (94,1%) 47 (85,5%)
TP53 7 (31,8%) 14 (30,4%) 9 (52,9%) 15 (27,3%)
CK5/6 5 (22,7%) 4 (8,7%) 0 (0%) 9 (16,4%)
CK8/18 17 (77,3%) 42 (91,3%) 17 (100%) 46 (83,6%)
RE, receptor de estrógeno; RP, receptor de progesterona; HER2, receptor de fator de
crescimento epidérmico 2; CK, citoqueratina.
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APÊNDICE IV – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA
MATERNIDADE ESCOLA ASSIS CHATEAUBRIAND (MEAC).
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APÊNDICE V - FICHA DE COLETA DE DADOS SOCIOEPIDEMIOLÓGICOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
LABORATÓRIO DE GENÉTICA MOLECULAR- LABGEM
CADASTRO CÂNCER DE MAMA FICHA Nº
I- IDENTIFICAÇÃO
Nome Completo:_____________________________________________________
Hospital/Prontuário n°.:_____________________Data da 1ª consulta:___/___/___
Médico responsável:__________________________________________________
Sexo: ( ) F ( ) M Data de Nascimento: ___/___/___ Idade: ________ ABO:_____
Cor: ( ) caucasiano ( ) negro ( ) pardo ( ) outra- especificar:_______________
Grau de instrução:___________________ Profissão: ________________________
Naturalidade:____________________ Procedência:____________________
Endereço: ___________________________________________________________
CEP:__________________ Cidade: ____________________Estado:_____________
Tel.: (__)___________/______________ email: ____________________________
II- HÁBITOS
( )Tabagista Tipo______ Freqüência________________ Fum. passivo ( )
( ) Etilista Tipo______ Freqüência________________
III- HISTÓRIA GINECO-OBSTETRÍCIA
Menarca:_________ Ciclo:__________ Última menstruação:__________________
Gravidez:__________ Parto: __________ Aborto: __________ Idade 1º parto: __________
Amamentou: __________ TRH: __________ Tempo de uso: ____________________
Idade da primeira mamografia: ____________
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IV- ANTECEDENTES PESSOAIS E FAMILIARES
Patologias associadas: ( ) Diabetes mellitus ( ) HAS ( )DST ( ) Outra –
especificar __________________________________________________________________
História prévia de câncer: ( )sim ( )não
Se sim, qual o tipo____________________ Idade na época do diagnostico: _______
Familiares com história de câncer
( ) Avô materno ( ) paterno ( ) Avó materna ( ) paterna ( ) Mãe( ) Pai
( )Tio(a) ( ) Materno ( ) Paterno ( ) Irmão(a)
Obs:________________________________________________________________
V- DADOS RELATIVOS À NEOPLASIA
Data do primeiro diagnóstico ___/_____/___
Histopatologia: __________________________________________________
Estadiamento: ____________________ Est. Clínico: T___N_____M___
Mama do tumor primário: ( ) 1-direita ( ) 2-esquerda ( ) 3-bilateral
Quadrante: ( ) 1-QSD ( ) 2-QSE ( ) 3-QID ( ) 4-QIE ( ) 5-S/especificação
Quimioterapia: Data do início ____/_____/____Data do término ___/____/___
Radioterapia Adjuvante: ( ) Sim ( ) Não. Período ___/___/___ a ___/____/___
Esquema: ( ) CMF ( ) FAC ( ) FEC ( ) AC Número de ciclos _______
Cirurgia: ( ) Mastectomia radical ( ) Quadrantectomia ( ) Outro_______________
VI- MARCADORES MOLECULARES
RE __________
RP __________
C-erb-2 __________
TP53 __________
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VII- RECORRÊNCIA
( 1a ) Data ___/____/____ (2
a )Data ___/____/____ ( 3
a )Data ___/____/____
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
VIII- SOBREVIDA
Livre de doença (meses)_______________________________________________
Com evidência de doença (meses) _______________________________________
Geral (meses)________________________________________________________
Data do óbito ___/___ /___ ( ) Relacionado á neoplasia primária da mama
( ) Relacionado à outra causa______________
IX- MAPA DO RETORNO AMBULATORIAL
Data Observações:
___/____/____ ____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
___/____/____ ____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
___/____/____ ____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________