PROTOKOL PENELITIAN
A. Judul Penelitian
Uji Efek Ekstrak Etanol 70% Daun Bawang Kucai(Allium tuberosum Rottl. ex
Spreng) Terhadap penurunan Low-Density Lipoprotein (LDL) Pada serum Darah
Tikus Jantan (Rattus norvegicus) Galur Wistar
B. Latar Belakang
Hiperlipidemia adalah suatu istilah umum bagi peningkatan konsentrasi setiap
atau semua anggota lipid dalam plasma, meliputi hipertrigliseridemia,
hiperkolesterolemia, dll (Dorland, 2002). Salah satu konsekuensi hiperlipidemia
yang paling penting adalah peningkatan kolesterol serum yang terutama
mencerminkan kolesterol lipoprotein serum densitas rendah (LDL-C), merupakan
faktor predisposisi terjadinya ateroma. Diketahui terdapat hubungan antara
peningkatan kolesterol serum dan peningkatan prematuritas dan keparahan
aterosklerosis (Price dkk, 2005).
Peningkatan kolesterol merupakan faktor penyakit jantung koroner. Menurut
WHO 60% penyebab kematian penyakit jantung disebabkan penyakit jantung
koroner dan pada tahun 2008 tercatat 17, 3 juta kematian akibat penyakit
kardiovaskular dengan 7,3 juta diantaranya karena penyakit jantung koroner.
Laporan Sakernas tahun 2009 menunjukkan PJK merupakan penyebab 23,6%
kematian orang Indonesia dan penyebab utama kematian dini 40% kematian usia
menengah(Asmariani, 2012). Panduan terapi ATP III (Adult Treatment Panel III),
menerapkan metode utama dalam terapi penurunan LDL adalah perubahan gaya
hidup dan terapi obat (price dkk, 2005). Adapun obat yang menjadi pilihan dalam
terapi penurunan LDL-C adalah HMG-KoA inhibitor golongan statin. Obat ini
merupakan obat pertama yang diberikan untuk terapi penurunan LDL (price dkk,
2005).
Statin memiliki aktivitas dalam penurunan LDL-C dengan cara menghambat
HMG-KoA reduktase secara kompetitif. Statin menghambat pembentukan
kolesterol dihati yang menyebabkan peningkatan reseptor LDL. Disamping efek
yang menguntungkan tersebut, statin memiliki kerugian pula yaitu terjadinya
hepatotoksisitas dan efek merugikan utama yang yang disebabkan oleh statin
adalah miopati (Gilman, 2007).
Allium tuberosum Rottl. ex Spreng adalah spesies dari keluarga Allium yang
ditanam diwilayah asia tenggara, Cina dan timur laut India. Dilaporkan tanaman
ini dikonsumsi masyarakat india dan cina salah satunya untuk penurunan
kolesterol (Choudhary, 2008). Dilaporkan pula fraksi metanol memiliki aktivitas
hipoglikemia, keadaan kolesterol yang tinggi merupakan faktor resiko penyakit
diabetes mellitus (Putria,2012). Efek hipolipidemik dikarenakan adanya senyawa
sulfur yang terdapat pada keluarga Allium. Penelitian tentang Allium tuberosum
Rottl. ex Spreng belum banyak dilakukan terutama yang berhubungan dengan
aktivitas antikolesterolnya di Indonesia. Tetapi terdapat tanaman yang berasal dari
genus yang sama yaitu bawang putih ( Allium sativum L) memiliki aktivitas
hipolipidemik yang diamati pada hewan yang diberikan ekstrak bawang putih.
Pada preparat bawang putih menunjukkan adanya penurunan kolesterol pada
serum dan dilaporkan ada efek yang menguntungkan.
Pada penggunaan Allium sativum yaitu untuk mencegah aterosklerosis pada
hewan eksperimental. Hipotesis hegnauer menyatakan tumbuhan yang berasal dari
suku yang sama mempunyai pola kandungan kimia yang hampir sama. Sementara
itu hipotesis fitoekivalen menyatakan bahwa tumbuhan dengan kandungan kimia
yang sama memiliki aktivitas yang sama (Fidriany, 2003). Berdasarkan uraian di
atas maka perlu dilakukan penelitian tentang ektstrak bawang kucai terhadap
penurunan LDL-C, sehingga pada akhirnya didapatkan obat pengendali kolesterol
yang berasal dari tumbuhan.
C. Rumusan Masalah
Permasalahan yang dapat diangkat dalam penelitian ini adalah:
C.1. Apakah ekstrak daun bawang kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng
mampu menurunkan LDL serum?
D. Hipotesis
Ekstrak etanol bawang kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng) mampu
menurunkan kadar LDL serum darah tikus.
E. Tujuan
E.1. Tujuan Umum
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya efek ekstrak etanol daun
bawang kucai terhadap penurunan kadar LDL serum yang pada akhirnya
mengacu penemuan obat penurun kolesterol yang berasal dari alam.
E.2. Tujuan Khusus
E.2.a. Untuk mengetahui dosis ekstrak etanol 70% daun bawang kucai (Allium
tuberosum Rottl. ex Spreng) yang dapat menurunkan LDL serum.
E.2.b. Untuk membandingkan besar penurunan kadar LDL serum yang terjadi
akibat diberikan pravastatin atau ekstrak etanol 70% daun bawang
kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng).
F. Kerangka Teori
G. Kerangka Konsep
H. Metodologi Penelitian
a. Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental dengan rancangan time series.
b. Tempat dan waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi dan Farmasi Klinis,
Laboratorium, Laboratorium Kimia Farmasi, Laboratorium Biologi
Farmasi, laboratorium mikroskopik dan nonmikroskopik Program Studi
Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran, Laboratorium Teknologi Hasil
Hutan, dan Unit Laboratorium Kesehatan (ULK) pada bulan Januari –
juni 2013.
No Kegiatan BulanOkt
2012
Nov
2012
Des
2012
Jan
2013
Feb
2013
Mar
2013
April
2013
Mei 2013
Juni 2013
1 Studi pustaka √ √ √ √
2 Persiapan alat
dan bahan
penelitian
√
3 Penelitian √ √ √ √ √ √
4 Penulisan √ √ √
c. Instrumen dan Bahan Penelitian
c.1. Instrumen yang digunakan
Instrumen yang digunakan yaitu glassware, timbangan analitik,
mikroskop cahaya,mikrokapiler, kandang hewan uji, Spuit oral 3 ml, spuit
injeksi, sentrifuge, spektrofotometer, mikropipet, blender, Hot plate,
tabung effendrof , tabung reaksi, beaker glass, labu ukur, evaporator,
spatula, batang pengaduk, dan oven.
c.2. Bahan yang digunakan
Bahan yang digunakan yaitu alumunium foil, kertas saring,
kloralhidrat, etanol 70%, KI, HgCl2, asam klorida, asam asetat glacial,
pereaksi meyer, ammonia, serbuk magnesium, H2SO4, pereaksi molish,
FeCl3 1%, CMC, pakan komposisi khusus, akuades dan pereaksi
enzimatis.
d. Populasi, Sampel, Kriteria Inklusi dan Eksklusi
d.1. Populasi Penelitian
Tikus yang digunakan adalah tikus putih galur wistar (Rattus
norvegicus) yang berasal dari Peternakan hewan di D.I. Yogyakarta
kabupaten Bantul
d.2. Sampel Penelitian
Pada penelitian ini yang digunakan adalah tikus putih (Rattus
novergicus) jantan galur wistar dengan berat 150-200 g berumur 8-12
minggu. Berdasarkan rumus frederer jumlah sampel yang digunakan
adalah 5 tikus per kelompok dan Drop out 10%.
Rumus Frederer: (n-1)(k-1)≥15
(n-1)(5-1)≥15
(n-1)4≥15
4n-4≥15
4n≥19
n≥19/4
n≥4,75
n≥5
n= jumlah sampel
k= kelompok
d.3. Kriteria Inklusi dan Ekslusi
d.3.a. Kriteria Inklusi
a. Tikus putih galur wistar
b. Sehat dan mempunyai aktivitas normal(tidak cacat secara anatomi
dan tidak ada gangguan dalam berjalan)
c. Berusia 8 – 12 minggu
d. Berat badan 150-200g
d.3.b. Kriteria Ekslusi
a. Tikus menderita sakit saat penelitian berlangsung
b. Tikus mati saat penelitian berlangsung
e. Variabel dan Definisi Operasional
e.1 Variabel
e.1.a Variabel Terikat
Variable terikat adalah kadar LDL serum darah tikus wistar.
e.1.b Variabel Bebas
Variabel bebas adalah dosis ekstrak etanol 70% daun bawang kucai
(Allium tuberosum Rottl ex Spreng).
e.2. Definisi Operasional
Variabel Definisi Alat ukur Skala
Kadar LDL
serum darah
tikus
Istilah yang
mengacu pada
tingkat LDL
serum dalam
darah. Kadar
LDL tikus adalah
spektrofotometri Numerik
20,39mg/dL.
Dosis ekstrak
etanol 70% daun
bawang kucai
Simplisia kering
yang telah
dilakukan
ekstraksi dengan
etanol 70%
Timbangan
analitik
Numerik
f. Cara Kerja
f.1. Pengambilan dan Pengolahan Tanaman
f.1.a Pengambilan
Tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun bawang
kucai dari family Liliaceae. Tanaman diambil di jl. Budi Utomo
kecamatan Pontianak Utara. Tanaman diambil secara purposif tanpa di
bandingkan dengan daerah lain.
f.1.b Determinasi
Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini di identifikasi di
Laboratorium biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Tanjungpura Pontianak. Tanaman yang digunakan bebas
hama, penyakit dan kerusakan lainnya.
f.1.c Pengolahan Tanaman
Daun bawang kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng) yang telah
dikumpulkan dan ditimbang sebagai berat basah 10 kg, disortasi basah
kemudian di cuci dengan air mengalir dan dirajang kemudian ditiriskan.
Kemudian dilakukan pengeringan dengan menggunakan oven dengan
suhu 450C selama 24 jam. Kemudian daun bawang kucai yang sudah
kering ditimbang berat keringnya dan dibuat dalam bentuk simplisia.
f.2. Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik
dan mikroskopik.
a. Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati
simplisia meliputi warna, bau, dan rasa.
b. Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan terhadap serbuk dilakukan dengan cara menaburkan
serbuk simplisia diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan
kloralhidrat dan ditutupi dengan kaca penutup kemudian di lihat
dibawah mikroskop.
f.3. Ekstraksi
Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana maserasi dan
ditambahkann pelarut etanol 70%. Tambahkan pelarut etanol sampai
terendam dan didiamkan sambil sesekali diaduk. Proses dilakukan dengan
mengganti pelarut tiap 1x24 jam selama 5 hari. Hasil maserasi
dikumpulkan dan disaring, kemudian pemekatan dilakukan dengan rotary
evaporator dengan suhu 450C hingga diperoleh ekstrak kental daun
bawang kucai. Pengentalan dilakukan dalam waterbath pada suhu kurang
lebih 450C sehingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental kemudian
diencerkan dalam air panas, diaduk hingga encer dengan air panas.
f.4. Penetapan Susut Pengeringan
Susut pengeringan adalah kadar yang menguap suatu zat kecuali
dinyatakan lain. Suhu penetapan adalah 1050C dan susut pengeringan
ditetapkan sebagai berikut: ditimbang seksama 1 g atau 2 g tanaman
dalam bobot timbangan dangkal tertutup yang sebelumnya telah
dipanaskan pada suhu penetapan 30 menit dan telah ditara. Sebelum
pengeringan botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin dalam
desikator.
f.5. Skrining Fitokimia
f.5.a Steroid
Ekstrak sampel sebanyak 1 mL ditambah 1 mL asam asetat glasial
dan 1 mL larutan asam sulfat pekat. Jika warna berubah menjadi biru
atau ungu, menandakan adanya senyawa steroid sedangkan jika warna
berubah menjadi merah atau terbentuk cincin merah menandakan adanya
seyawa triterpenoid (Lailatul dkk, 2010). Terbentuknya warna merah
kecoklatan pada antar permukaan juga menunjukkan adanya triterpenoid.
f.5.b Alkaloid
Ekstrak sebanyak 1 mL dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu
ditambahkan 5 tetes pereaksi meyer yang dibuat dari 1g KI dilarutkan
dalam 20 mL aquades sampai semuanya larut, lalu di dalam larutan KI
tersebut tambahkan 0,271 g HgCl2. Terbentuknya endapan putih
mengindikasikan adanya alkaloid.
f.5.c Flavonoid
Ekstrak sebanyak 1 mL dimasukkan Dalam tabung reaksi lalu
ditambahkan dengan serbuk Mg sebanyak 1 g dan larutan asam klorida
pekat. Perubahan menjadi warna kuning mengindikasikan adanya
flavonoid.
f.5.d Tanin
Ekstrak dididihkan dengan 20 mL air lalu disaring. Beberapa tetes
ferri klorida 1% ditambahkan hingga terbentuknya warna coklat
kehijauan ataupun biru kehitaman menunjukkan adanya tanin.
f.5.e Glikosida
Larutan ekstrak 0,5 g ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes molish,
ditambahkan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung,
terbentuknya cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya
glikosida.
f.5.f Saponin
Sebanyak 2 mL ekstrak dipipet, dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan 10 mL air, setelah itu didinginkan dan dikocok
kuat-kuat selama 10 menit sehingga terbentuk buih (Lailatul dkk, 2010).
Terbentuknya busa yang stabil berarti positif mengandung saponin.
f.6. Pengujian Efek Antikolesterol
f.6.a Adaptasi Hewan Uji
Tikus putih (Rattus novergicus) galur wistar dengan umur 8 – 12
minggu dengan berat badan 150-200g. diaklimatisasi selama 10 hari dan
dibagi secara acak menjadi 5 kelompok masing-masing 5 hewan uji,
pemberian makanan adalah pakan standar dan minum ad libitum.
f.6.b Pemberian Diet Kolesterol Tinggi
Makanan yang diberikan pada tikus putih jantan galur wistar
berkomposisi sebagai berikut (Prastyan, 2008):
Induksi eksogen
kolesterol 1%
kuning telur 5%
lemak hewan 10%
minyak goreng 1%
makanan standar sampai 100%
Induksi Endogen
Pemberian larutan propiltiourasil 0,01%
Pemberian makanan dan minuman ini diberikan secara oral selama 2
minggu untuk meningkatkan LDL serum, dan dilanjutkan pada saat
perlakuan. Perhitungan dosis propiltiourasil 0,01% artinya 0,01 gram per
100 mL air.
1 tablet PTU sebesar 100mg, maka untuk memenuhi dosis 0,01%
sebagai berikut:
0,01 gram100 ml
= 0,1gram PTUvolumeair yang ditambahkan
0,01 × volumeair yang ditambahkan=10 ml
volumeair yangditambahkan=10ml /0 , 01gram
=1000ml
Jadi untuk membuat dosis PTU 0,01% didapatkan dengan cara
melarutkan 1 tablet PTU kedalam 1 liter akuades.
f.6.c Pembuatan Dosis Ekstrak
Berdasarkan penelitian yang dilakukan (rahadi, 2012) Didapatkan
rendemen yang didapat adalah 19,729%. Dosis empiris yang dipakai
umumnya adalah 9 gram (50 kg berat orang Indonesia).
Jadi jumlah ekstrak yang diberikan (berat orang 50kg)= 9 gram x
19,729% = 1,77561 gram ekstrak
Jadi untuk konversi dosis orang berat 70kg = 1,78gram x 70/50= 2,492
gram.
Konversi ke tikus 200 gram= 2,492 gram x 0,018=0,04486 gr/200gBB=
0,045gr/200gBB
Perhitungan dosis ekstrak :
Dosis 1 = 50% x 0,0456gr/200gBB= 0,0225 gram/200gBB
Dosis 2 = 100% x 0,045gr/200gBB= 0,045gram/200gBB
Dosis 3= 200% x 0,045gr/200gBB=0,09gran/200gBB
f.6.d Pembuatan Dosis Pravastatin
Perhitungan dosis Pravastatin didasarkan pada dosis terapi peroral
pada manusia. Dosis sekali minum untuk berat badan manusia 70 kg
adalah 20 mg. dosis tersebut dikonversikan ke tikus dengan berat badan
200 gram dengan nilai konversi 0,018. Kemudian nilai konversi
dikalikan dengan dosis terapi untuk manusia, yaitu 0,018 x 20 mg = 0,36
mg/200gBB.
f.6.e. Alur Penelitian
f.6.f. Kerangka Kerja Perlakuan
f.6.g. Penetapan Kadar LDL serum
Kadar LDL serum ditetapkan dengan metode CHOD-PAP
menggunakan spektrofotometri. Darah diambil dari sinus retroorbitalis
dengan menggunakan pipet mikrokapiler pada hari ke 1 (setelah
aklimatisasi),hari ke-14, hari ke-21, hari ke-28, hari ke 35 dan hari ke-
42. Kadar kolesterol darah yang di ukur adalah LDL. Serum didapatkan
dengan cara melakukan sentifugasi darah, dan tidak ditambahkan
antikoagulan. Untuk prosedur pengukuran LDL sampel diambil
sebanyak 3 µL ditambah Reagen 1 sebanyak 280µL, kemudiaan
diamkan 5 menit. Setelah 5 menit tambahkan reagen 2 sebanyak 70µL
kemudian didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, lakukan
spektrofotometri pada gelombang 600-700nm. Ambil nilai absorbansi
sampel,Kalibrator, dan blanko.
f.7. Analisa Data
Data hasil pengukuran LDL serum darah tikus kemudian akan dianalisa
menggunakan uji statistik. Uji statistik yang digunakan yaitu:
a. Uji statistik kolmogorov-smirnov untuk menguji distribusi data
yang didapat.
b. Uji statistik test of homogeneity of variances, untuk menguji
homogenitas tiap kelompok
c. Uji statistik one-way Anova, untuk menguji rata-rata perbandingan
tiap kelompok.
d. Uji statistik LSD (least significant difference), untuk menguji
signifikansi dari perbedaan rata-rata tiap kelompok perlakuan
I. Personalia Penelitian
Berikut adalah uraian peran dan jumlah waktu dari setiap kegiatan penelitian yang
dilakukan.
Ferbruari 2013:
12-26 : pembuatan simplisia
24 : Persiapan kandang
25 : pemesanan Tikus
Maret 2013:
11 : Pengurusan surat menyurat hewan
28 : tikus datang dilakukan pembesaran tikus (tikus yang datang umur
1,5 bulan)untuk mencukupkan umur tikus.
April 2013:
11 : aklimatisasi hewan coba
22 :Pengambilan darah hari ke 1
Mei 2013
6 : Pengambilan darah minggu ke 14 setelah diberi induksi selama 2
minggu.
14 : pengambilan darah hari 21
21 : pengambilan darah hari 28
24 : pengambilan darah hari 35
Juni 2013
1 : pengambilan darah hari 42
3 : Hewan coba dimusnahkan
a. Peneliti Utama:
Nama : Igri Septian Risky
NIM : I11109018
Prodi : Program Studi Pendidikan Dokter
Universitas : Universitas Tanjungpura
b. Pembimbing 1:
Nama : Indri Kusharyanti, Msc, Apt
NIP : 19830311 200604 2 001
Bidang Ilmu : Farmasi
Prodi/Fakultas : Fakultas Kedokteran/ Prodi Farmasi
c. Pembimbingan 2:
Nama : dr. Mitra Handini
NIP :19850908 200912 2 005
Bagian Ilmu : Kedokteran
Prodi/Fakultas : Fakultas Kedokteran/ Prodi Kedokteran