bioetika.docx

PROTOKOL PENELITIAN

A. Judul Penelitian

Uji Efek Ekstrak Etanol 70% Daun Bawang Kucai(Allium tuberosum Rottl. ex

Spreng) Terhadap penurunan Low-Density Lipoprotein (LDL) Pada serum Darah

Tikus Jantan (Rattus norvegicus) Galur Wistar

B. Latar Belakang

Hiperlipidemia adalah suatu istilah umum bagi peningkatan konsentrasi setiap

atau semua anggota lipid dalam plasma, meliputi hipertrigliseridemia,

hiperkolesterolemia, dll (Dorland, 2002). Salah satu konsekuensi hiperlipidemia

yang paling penting adalah peningkatan kolesterol serum yang terutama

mencerminkan kolesterol lipoprotein serum densitas rendah (LDL-C), merupakan

faktor predisposisi terjadinya ateroma. Diketahui terdapat hubungan antara

peningkatan kolesterol serum dan peningkatan prematuritas dan keparahan

aterosklerosis (Price dkk, 2005).

Peningkatan kolesterol merupakan faktor penyakit jantung koroner. Menurut

WHO 60% penyebab kematian penyakit jantung disebabkan penyakit jantung

koroner dan pada tahun 2008 tercatat 17, 3 juta kematian akibat penyakit

kardiovaskular dengan 7,3 juta diantaranya karena penyakit jantung koroner.

Laporan Sakernas tahun 2009 menunjukkan PJK merupakan penyebab 23,6%

kematian orang Indonesia dan penyebab utama kematian dini 40% kematian usia

menengah(Asmariani, 2012). Panduan terapi ATP III (Adult Treatment Panel III),

menerapkan metode utama dalam terapi penurunan LDL adalah perubahan gaya

hidup dan terapi obat (price dkk, 2005). Adapun obat yang menjadi pilihan dalam

terapi penurunan LDL-C adalah HMG-KoA inhibitor golongan statin. Obat ini

merupakan obat pertama yang diberikan untuk terapi penurunan LDL (price dkk,

2005).

Statin memiliki aktivitas dalam penurunan LDL-C dengan cara menghambat

HMG-KoA reduktase secara kompetitif. Statin menghambat pembentukan

kolesterol dihati yang menyebabkan peningkatan reseptor LDL. Disamping efek

yang menguntungkan tersebut, statin memiliki kerugian pula yaitu terjadinya

hepatotoksisitas dan efek merugikan utama yang yang disebabkan oleh statin

adalah miopati (Gilman, 2007).

Allium tuberosum Rottl. ex Spreng adalah spesies dari keluarga Allium yang

ditanam diwilayah asia tenggara, Cina dan timur laut India. Dilaporkan tanaman

ini dikonsumsi masyarakat india dan cina salah satunya untuk penurunan

kolesterol (Choudhary, 2008). Dilaporkan pula fraksi metanol memiliki aktivitas

hipoglikemia, keadaan kolesterol yang tinggi merupakan faktor resiko penyakit

diabetes mellitus (Putria,2012). Efek hipolipidemik dikarenakan adanya senyawa

sulfur yang terdapat pada keluarga Allium. Penelitian tentang Allium tuberosum

Rottl. ex Spreng belum banyak dilakukan terutama yang berhubungan dengan

aktivitas antikolesterolnya di Indonesia. Tetapi terdapat tanaman yang berasal dari

genus yang sama yaitu bawang putih ( Allium sativum L) memiliki aktivitas

hipolipidemik yang diamati pada hewan yang diberikan ekstrak bawang putih.

Pada preparat bawang putih menunjukkan adanya penurunan kolesterol pada

serum dan dilaporkan ada efek yang menguntungkan.

Pada penggunaan Allium sativum yaitu untuk mencegah aterosklerosis pada

hewan eksperimental. Hipotesis hegnauer menyatakan tumbuhan yang berasal dari

suku yang sama mempunyai pola kandungan kimia yang hampir sama. Sementara

itu hipotesis fitoekivalen menyatakan bahwa tumbuhan dengan kandungan kimia

yang sama memiliki aktivitas yang sama (Fidriany, 2003). Berdasarkan uraian di

atas maka perlu dilakukan penelitian tentang ektstrak bawang kucai terhadap

penurunan LDL-C, sehingga pada akhirnya didapatkan obat pengendali kolesterol

yang berasal dari tumbuhan.

C. Rumusan Masalah

Permasalahan yang dapat diangkat dalam penelitian ini adalah:

C.1. Apakah ekstrak daun bawang kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng

mampu menurunkan LDL serum?

D. Hipotesis

Ekstrak etanol bawang kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng) mampu

menurunkan kadar LDL serum darah tikus.

E. Tujuan

E.1. Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya efek ekstrak etanol daun

bawang kucai terhadap penurunan kadar LDL serum yang pada akhirnya

mengacu penemuan obat penurun kolesterol yang berasal dari alam.

E.2. Tujuan Khusus

E.2.a. Untuk mengetahui dosis ekstrak etanol 70% daun bawang kucai (Allium

tuberosum Rottl. ex Spreng) yang dapat menurunkan LDL serum.

E.2.b. Untuk membandingkan besar penurunan kadar LDL serum yang terjadi

akibat diberikan pravastatin atau ekstrak etanol 70% daun bawang

kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng).

F. Kerangka Teori

G. Kerangka Konsep

H. Metodologi Penelitian

a. Jenis Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental dengan rancangan time series.

b. Tempat dan waktu penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi dan Farmasi Klinis,

Laboratorium, Laboratorium Kimia Farmasi, Laboratorium Biologi

Farmasi, laboratorium mikroskopik dan nonmikroskopik Program Studi

Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran, Laboratorium Teknologi Hasil

Hutan, dan Unit Laboratorium Kesehatan (ULK) pada bulan Januari –

juni 2013.

No Kegiatan BulanOkt

2012

Nov

2012

Des

2012

Jan

2013

Feb

2013

Mar

2013

April

2013

Mei 2013

Juni 2013

1 Studi pustaka √ √ √ √

2 Persiapan alat

dan bahan

penelitian

√

3 Penelitian √ √ √ √ √ √

4 Penulisan √ √ √

c. Instrumen dan Bahan Penelitian

c.1. Instrumen yang digunakan

Instrumen yang digunakan yaitu glassware, timbangan analitik,

mikroskop cahaya,mikrokapiler, kandang hewan uji, Spuit oral 3 ml, spuit

injeksi, sentrifuge, spektrofotometer, mikropipet, blender, Hot plate,

tabung effendrof , tabung reaksi, beaker glass, labu ukur, evaporator,

spatula, batang pengaduk, dan oven.

c.2. Bahan yang digunakan

Bahan yang digunakan yaitu alumunium foil, kertas saring,

kloralhidrat, etanol 70%, KI, HgCl2, asam klorida, asam asetat glacial,

pereaksi meyer, ammonia, serbuk magnesium, H2SO4, pereaksi molish,

FeCl3 1%, CMC, pakan komposisi khusus, akuades dan pereaksi

enzimatis.

d. Populasi, Sampel, Kriteria Inklusi dan Eksklusi

d.1. Populasi Penelitian

Tikus yang digunakan adalah tikus putih galur wistar (Rattus

norvegicus) yang berasal dari Peternakan hewan di D.I. Yogyakarta

kabupaten Bantul

d.2. Sampel Penelitian

Pada penelitian ini yang digunakan adalah tikus putih (Rattus

novergicus) jantan galur wistar dengan berat 150-200 g berumur 8-12

minggu. Berdasarkan rumus frederer jumlah sampel yang digunakan

adalah 5 tikus per kelompok dan Drop out 10%.

Rumus Frederer: (n-1)(k-1)≥15

(n-1)(5-1)≥15

(n-1)4≥15

4n-4≥15

4n≥19

n≥19/4

n≥4,75

n≥5

n= jumlah sampel

k= kelompok

d.3. Kriteria Inklusi dan Ekslusi

d.3.a. Kriteria Inklusi

a. Tikus putih galur wistar

b. Sehat dan mempunyai aktivitas normal(tidak cacat secara anatomi

dan tidak ada gangguan dalam berjalan)

c. Berusia 8 – 12 minggu

d. Berat badan 150-200g

d.3.b. Kriteria Ekslusi

a. Tikus menderita sakit saat penelitian berlangsung

b. Tikus mati saat penelitian berlangsung

e. Variabel dan Definisi Operasional

e.1 Variabel

e.1.a Variabel Terikat

Variable terikat adalah kadar LDL serum darah tikus wistar.

e.1.b Variabel Bebas

Variabel bebas adalah dosis ekstrak etanol 70% daun bawang kucai

(Allium tuberosum Rottl ex Spreng).

e.2. Definisi Operasional

Variabel Definisi Alat ukur Skala

Kadar LDL

serum darah

tikus

Istilah yang

mengacu pada

tingkat LDL

serum dalam

darah. Kadar

LDL tikus adalah

spektrofotometri Numerik

20,39mg/dL.

Dosis ekstrak

etanol 70% daun

bawang kucai

Simplisia kering

yang telah

dilakukan

ekstraksi dengan

etanol 70%

Timbangan

analitik

Numerik

f. Cara Kerja

f.1. Pengambilan dan Pengolahan Tanaman

f.1.a Pengambilan

Tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun bawang

kucai dari family Liliaceae. Tanaman diambil di jl. Budi Utomo

kecamatan Pontianak Utara. Tanaman diambil secara purposif tanpa di

bandingkan dengan daerah lain.

f.1.b Determinasi

Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini di identifikasi di

Laboratorium biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Tanjungpura Pontianak. Tanaman yang digunakan bebas

hama, penyakit dan kerusakan lainnya.

f.1.c Pengolahan Tanaman

Daun bawang kucai (Allium tuberosum Rottl. ex Spreng) yang telah

dikumpulkan dan ditimbang sebagai berat basah 10 kg, disortasi basah

kemudian di cuci dengan air mengalir dan dirajang kemudian ditiriskan.

Kemudian dilakukan pengeringan dengan menggunakan oven dengan

suhu 450C selama 24 jam. Kemudian daun bawang kucai yang sudah

kering ditimbang berat keringnya dan dibuat dalam bentuk simplisia.

f.2. Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik

dan mikroskopik.

a. Pemeriksaan Makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati

simplisia meliputi warna, bau, dan rasa.

b. Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan terhadap serbuk dilakukan dengan cara menaburkan

serbuk simplisia diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan

kloralhidrat dan ditutupi dengan kaca penutup kemudian di lihat

dibawah mikroskop.

f.3. Ekstraksi

Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana maserasi dan

ditambahkann pelarut etanol 70%. Tambahkan pelarut etanol sampai

terendam dan didiamkan sambil sesekali diaduk. Proses dilakukan dengan

mengganti pelarut tiap 1x24 jam selama 5 hari. Hasil maserasi

dikumpulkan dan disaring, kemudian pemekatan dilakukan dengan rotary

evaporator dengan suhu 450C hingga diperoleh ekstrak kental daun

bawang kucai. Pengentalan dilakukan dalam waterbath pada suhu kurang

lebih 450C sehingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental kemudian

diencerkan dalam air panas, diaduk hingga encer dengan air panas.

f.4. Penetapan Susut Pengeringan

Susut pengeringan adalah kadar yang menguap suatu zat kecuali

dinyatakan lain. Suhu penetapan adalah 1050C dan susut pengeringan

ditetapkan sebagai berikut: ditimbang seksama 1 g atau 2 g tanaman

dalam bobot timbangan dangkal tertutup yang sebelumnya telah

dipanaskan pada suhu penetapan 30 menit dan telah ditara. Sebelum

pengeringan botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin dalam

desikator.

f.5. Skrining Fitokimia

f.5.a Steroid

Ekstrak sampel sebanyak 1 mL ditambah 1 mL asam asetat glasial

dan 1 mL larutan asam sulfat pekat. Jika warna berubah menjadi biru

atau ungu, menandakan adanya senyawa steroid sedangkan jika warna

berubah menjadi merah atau terbentuk cincin merah menandakan adanya

seyawa triterpenoid (Lailatul dkk, 2010). Terbentuknya warna merah

kecoklatan pada antar permukaan juga menunjukkan adanya triterpenoid.

f.5.b Alkaloid

Ekstrak sebanyak 1 mL dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu

ditambahkan 5 tetes pereaksi meyer yang dibuat dari 1g KI dilarutkan

dalam 20 mL aquades sampai semuanya larut, lalu di dalam larutan KI

tersebut tambahkan 0,271 g HgCl2. Terbentuknya endapan putih

mengindikasikan adanya alkaloid.

f.5.c Flavonoid

Ekstrak sebanyak 1 mL dimasukkan Dalam tabung reaksi lalu

ditambahkan dengan serbuk Mg sebanyak 1 g dan larutan asam klorida

pekat. Perubahan menjadi warna kuning mengindikasikan adanya

flavonoid.

f.5.d Tanin

Ekstrak dididihkan dengan 20 mL air lalu disaring. Beberapa tetes

ferri klorida 1% ditambahkan hingga terbentuknya warna coklat

kehijauan ataupun biru kehitaman menunjukkan adanya tanin.

f.5.e Glikosida

Larutan ekstrak 0,5 g ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes molish,

ditambahkan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung,

terbentuknya cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya

glikosida.

f.5.f Saponin

Sebanyak 2 mL ekstrak dipipet, dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

kemudian ditambahkan 10 mL air, setelah itu didinginkan dan dikocok

kuat-kuat selama 10 menit sehingga terbentuk buih (Lailatul dkk, 2010).

Terbentuknya busa yang stabil berarti positif mengandung saponin.

f.6. Pengujian Efek Antikolesterol

f.6.a Adaptasi Hewan Uji

Tikus putih (Rattus novergicus) galur wistar dengan umur 8 – 12

minggu dengan berat badan 150-200g. diaklimatisasi selama 10 hari dan

dibagi secara acak menjadi 5 kelompok masing-masing 5 hewan uji,

pemberian makanan adalah pakan standar dan minum ad libitum.

f.6.b Pemberian Diet Kolesterol Tinggi

Makanan yang diberikan pada tikus putih jantan galur wistar

berkomposisi sebagai berikut (Prastyan, 2008):

Induksi eksogen

kolesterol 1%

kuning telur 5%

lemak hewan 10%

minyak goreng 1%

makanan standar sampai 100%

Induksi Endogen

Pemberian larutan propiltiourasil 0,01%

Pemberian makanan dan minuman ini diberikan secara oral selama 2

minggu untuk meningkatkan LDL serum, dan dilanjutkan pada saat

perlakuan. Perhitungan dosis propiltiourasil 0,01% artinya 0,01 gram per

100 mL air.

1 tablet PTU sebesar 100mg, maka untuk memenuhi dosis 0,01%

sebagai berikut:

0,01 gram100 ml

= 0,1gram PTUvolumeair yang ditambahkan

0,01 × volumeair yang ditambahkan=10 ml

volumeair yangditambahkan=10ml /0 , 01gram

=1000ml

Jadi untuk membuat dosis PTU 0,01% didapatkan dengan cara

melarutkan 1 tablet PTU kedalam 1 liter akuades.

f.6.c Pembuatan Dosis Ekstrak

Berdasarkan penelitian yang dilakukan (rahadi, 2012) Didapatkan

rendemen yang didapat adalah 19,729%. Dosis empiris yang dipakai

umumnya adalah 9 gram (50 kg berat orang Indonesia).

Jadi jumlah ekstrak yang diberikan (berat orang 50kg)= 9 gram x

19,729% = 1,77561 gram ekstrak

Jadi untuk konversi dosis orang berat 70kg = 1,78gram x 70/50= 2,492

gram.

Konversi ke tikus 200 gram= 2,492 gram x 0,018=0,04486 gr/200gBB=

0,045gr/200gBB

Perhitungan dosis ekstrak :

Dosis 1 = 50% x 0,0456gr/200gBB= 0,0225 gram/200gBB

Dosis 2 = 100% x 0,045gr/200gBB= 0,045gram/200gBB

Dosis 3= 200% x 0,045gr/200gBB=0,09gran/200gBB

f.6.d Pembuatan Dosis Pravastatin

Perhitungan dosis Pravastatin didasarkan pada dosis terapi peroral

pada manusia. Dosis sekali minum untuk berat badan manusia 70 kg

adalah 20 mg. dosis tersebut dikonversikan ke tikus dengan berat badan

200 gram dengan nilai konversi 0,018. Kemudian nilai konversi

dikalikan dengan dosis terapi untuk manusia, yaitu 0,018 x 20 mg = 0,36

mg/200gBB.

f.6.e. Alur Penelitian

f.6.f. Kerangka Kerja Perlakuan

f.6.g. Penetapan Kadar LDL serum

Kadar LDL serum ditetapkan dengan metode CHOD-PAP

menggunakan spektrofotometri. Darah diambil dari sinus retroorbitalis

dengan menggunakan pipet mikrokapiler pada hari ke 1 (setelah

aklimatisasi),hari ke-14, hari ke-21, hari ke-28, hari ke 35 dan hari ke-

42. Kadar kolesterol darah yang di ukur adalah LDL. Serum didapatkan

dengan cara melakukan sentifugasi darah, dan tidak ditambahkan

antikoagulan. Untuk prosedur pengukuran LDL sampel diambil

sebanyak 3 µL ditambah Reagen 1 sebanyak 280µL, kemudiaan

diamkan 5 menit. Setelah 5 menit tambahkan reagen 2 sebanyak 70µL

kemudian didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, lakukan

spektrofotometri pada gelombang 600-700nm. Ambil nilai absorbansi

sampel,Kalibrator, dan blanko.

f.7. Analisa Data

Data hasil pengukuran LDL serum darah tikus kemudian akan dianalisa

menggunakan uji statistik. Uji statistik yang digunakan yaitu:

a. Uji statistik kolmogorov-smirnov untuk menguji distribusi data

yang didapat.

b. Uji statistik test of homogeneity of variances, untuk menguji

homogenitas tiap kelompok

c. Uji statistik one-way Anova, untuk menguji rata-rata perbandingan

tiap kelompok.

d. Uji statistik LSD (least significant difference), untuk menguji

signifikansi dari perbedaan rata-rata tiap kelompok perlakuan

I. Personalia Penelitian

Berikut adalah uraian peran dan jumlah waktu dari setiap kegiatan penelitian yang

dilakukan.

Ferbruari 2013:

12-26 : pembuatan simplisia

24 : Persiapan kandang

25 : pemesanan Tikus

Maret 2013:

11 : Pengurusan surat menyurat hewan

28 : tikus datang dilakukan pembesaran tikus (tikus yang datang umur

1,5 bulan)untuk mencukupkan umur tikus.

April 2013:

11 : aklimatisasi hewan coba

22 :Pengambilan darah hari ke 1

Mei 2013

6 : Pengambilan darah minggu ke 14 setelah diberi induksi selama 2

minggu.

14 : pengambilan darah hari 21



Juni 2013


3 : Hewan coba dimusnahkan

a. Peneliti Utama:

Nama : Igri Septian Risky

NIM : I11109018

Prodi : Program Studi Pendidikan Dokter

Universitas : Universitas Tanjungpura

b. Pembimbing 1:

Nama : Indri Kusharyanti, Msc, Apt

NIP : 19830311 200604 2 001

Bidang Ilmu : Farmasi

Prodi/Fakultas : Fakultas Kedokteran/ Prodi Farmasi

c. Pembimbingan 2:

Nama : dr. Mitra Handini

NIP :19850908 200912 2 005

Bagian Ilmu : Kedokteran

Prodi/Fakultas : Fakultas Kedokteran/ Prodi Kedokteran

bioetika.docx

Documents