GENETIKA BAKTERIJA
• Na temelju stanične organizacije žive organizme dijelimo u prokariote i eukariote
• Eukarioti imaju pravu jezgru obavijenu jezgrinomovojnicom, a u citoplazmi stanice brojni organeli sa vlastitom membranom; u jezgri se nalazi nekoliko parova kromosoma koji su građeni od DNA i proteina, a jezgra se dijeli mitozom i/ili mejozom
• Prokarioti (pro-prije, karyon-jezgra) su organizmi (stanice) bez prave jezgre; cijanobakterije, bakterije i mikoplazme
• Prokarioti imaju samo jedan “kromosom”, a to je gola, dvolančana, prstenasta molekula DNA; dijele se binarnom diobom nakon replikacije DNA
• Sve do 1950. malo se znalo o genetici bakterija, jer je bilo velikih poteškoća u eksperimentalnom radu (uzgoj, križanje, prepoznavanje na temelju fenotipa)
Biljna stanica
Mikoplazme
• Nakon što su tehničke poteškoće oko uzgoja prevladane, prokarioti su postali neizostavni eksperimentalni objekti u genetici, posebno u molekularnoj genetici (preteča je biokemijska genetika): otkrivanje strukture i funkcije gena, regulacija i mutacije gena; razjašnjavanje genetičkog koda ...
• Danas mikroorganizmi (bakterije i virusi) imaju ključnu ulogu u kloniranju gena i genetičkom inženjerstvu
• Bakterije su mali jednostanični organizmi koje je moguće vidjeti pomoću svjetlosnog i elektronskog mikroskopa
• U prirodi ih ima u velikom broju, a pokazuju veliku raznolikost oblika
• Stanična struktura je vrlo jednostavna; prstenasta DNA (nukleoid), ribosomi, plazma membrana, stanična stijenka (ali ne celulozna kao u biljaka) i u nekih polisaharidna kapsula
• Vrlo su pogodni za genetička istraživanja: jednostavna građa, kratak životni ciklus (dijele se svakih 30-40 minuta), jednostavan uzgoj u laboratoriju, raznolikost fenotipa (u smislu funkcije)
• Najpopularniji objekt genetičkih istraživanja bakteriju E. coli otkrio je 1885. Theodor Escherich
BAKTERIJSKA SVOJSTVA (FENOTIP)
• Oblik bakterijske stanice može biti sferičan (koki), štapićast (bacili) ili spiralan (spirili)
• Oblik bakterijske kolonije je važno svojstvo koje je vidljivo na krutoj hranjivoj podlozi (agarskoj ploči)
• Kolonija na agarskoj ploči predstavlja mnoštvo genetički istovjetnih stanica (klon) koje su nastale iz jedne stanice binarnom diobom
• U nekih vrsta bakterija stanice su obavijene polisaharidnom kapsulom što kolonije čini glatkima (S) za razliku od hrapavih (R) kolonija koje stvaraju bakterije bez polisaharidne kapsule
• Drugo vidljivo fenotipsko svojstvo je prisutnost ili odsutnost bičeva na površini stanice (ako su stanice pokretne, kolonije na agarskojploči izgledaju razmazano; ako su nepokretne stanice kolonije su točkaste)
• Najčešća svojstva koja istražuju bakterijski genetičari uključuju biokemijske mutacije (mutacije gena čiji produkti enzimi kontroliraju biosintetske putove)
• Otpornost na antibiotike (Penr), fage, faktore iz okoliša ...
• Bakterije su s obzirom na prehrambene potrebe PROTOTROFI ili AUKSOTROFI
• PROTOTROFI – divlji tip bakterija koji može rasti na MINIMALNOJ PODLOZI (MP): voda, izvor ugljika; glukoza ili saharoza, mješavina anorganskih soli
• Genske mutacije uzrokuju zastoj u biokemijskim putovima -biokemijske mutante
• Biokemijske mutante ne mogu sintetizirati određene supstance kaoaminokiseline, nukleotide ili vitamine i stoga se te supstance moraju dodavati u podlogu kako bi bakterije mogle rasti
• Mutante koje zahtijevaju različite dodatke minimalnoj podlozi nazivamo AKSOTROFNIM MUTANTAMA (npr. auksotrofna mutanta za metionin zahtijeva metionin u podlozi: Met-)
• Auksotrofne mutante mogu rasti na kompletnoj podlozi koja sadrži sve supstance potrebne za rast
• Auksotrofi mogu rasti na selektivnim podlogama: MP uz dodatak određenih supstanci koje bakterija ne može sintetizirati
• Tehnika uz pomoć koje se može brzo utvrditi da li je određeni soj bakterije auksotrofan za određeni metabolit je tehnika otiska ili “replica-plating” tehnika (Joshua Lederberg)
KROMOSOMSKA ORGANIZACIJA
• Geni bakterije organizirani su u jednu grupu vezanih gena (haploidniorganizmi)
• “Kromosom” bakterija je prstenasta, gola, dvolančana molekula DNA – nazivamo ga nukleoid (koristi se još termin GENOFOR = genetički materijal prokariota i virusa)
• U E. coli koja živi u probavnom traktu čovjeka, kromosom je dugačak više od 1 mm, a pakiran je u nukleoid čija je dužina manja od 1 μm (gustoća pakiranja 1000:1); kromosom čini 4x106 pb, oko 3000 gena
• Uz bakterijski kromosom u stanici se mogu nalaziti PLAZMIDI, male kružne molekule DNA
• Plazmid je nezavisna samoreplicirajuća čestica (Lederberg)• Plazmidi se repliciraju neovisno o bakterijskom kromosomu, a svaki
plazmid ima mali broj gena
• Bakterijska stanica dijeli se binarnom diobom nakon replikacije DNA
• U povoljnim uvjetima bakterije se vrlo brzo razmnožavaju, primjerice E. coli se u optimalnim uvjetima dijeli svakih 20 minuta; tijekom kultiviranja preko noći (12 sati) iz jedne stanice nastane kolonija od 107 do 108 stanica
• U prirodnom staništu (debelo crijevo sisavaca) to ide još brže• Zbog nespolnog razmnožavanja sve bakterije u jednoj koloniji
nastale iz jedne stanice su genetički istovjetne• Ipak neke se stanice razlikuju zbog mutacija; za određeni gen u
E. coli vjerojatnost mutacije je oko 1x10-7 po staničnoj diobi; budući da se u crijevu svakodnevno stvara 2x1010 novih stanica E. coli broj mutanata bit će 2000 (2x1010/1x10-7)
• Mutacije su dakle jedini izvor genetičke varijabilnosti u bakterija
• Uz mutacije i genetička rekombinacija pridonosi varijabilnosti, ali na razini populacije
Binarna dioba
REKOMBINACIJA U BAKTERIJA
• Rekombinacija je ujedinjavanje (kombiniranje) genetičkog materijala dviju jedinki u genom jedne jedinke
• Nasljedna tvar jedne bakterije može se ugraditi u nasljednu tvar druge bakterije čime nastaju rekombinantni potomci
• Genetičku rekombinaciju u bakteriji E. coli prvi su uočili i objasnili Lederberg i Tatum 1946.
• Mehanizmi rekombinacije u bakterija su: transformacija, konjugacija i transdukcija
TRANSFORMACIJA
• Izmjena genetičke informacije između gole DNA i DNA stanice recipijenta
• Transformirajući princip otkrio je Griffith 1928.• Gola DNA je kompetentna za transformaciju ako je dvolančana i
relativno velika• Stanice kompetentne za transformaciju moraju na površini imati
protein – faktor kompeticije koji se veže za stranu DNA (vezanje zahtijeva energiju)
• Bakterije koje nisu prirodno kompetentne možemo tretirati npr. CaCl2; tada stanica postaje kompetentna
• Prilikom transformacije u stanicu recipijenta ulazi samo jedan lanac dvolančane DNA, te se ugrađuje u genom domaćina uz pomoć dva krosing-overa
• Preostala jednolančana DNA (dio originalnog bakterijskog kromosoma) razgradit će enzimi egzonukleaze
Griffith-ov eksperiment
KONJUGACIJA
• Konjugacija je indirektni prijenos genetičkog materijala iz stanice DONORA u stanicu RECIPIJENTA tijekom spolnog razmnožavanja
• Stanice koje konjugiraju moraju biti različitih tipova parenja što ovisi o prisustvu F plazmida ili spolnog faktora u citoplazmi
• F plazmid nosi gene za stvaranje F pilusa (sex pili) i gene za prijenos DNA iz donora u recipijenta (najmanje 22 gena)
• Stanica koja ima slobodan F plazmid je F+ stanica ili DONOR, a stanica koja ga nema je F- stanica ili RECIPIJENT
• Uvijek konjugiraju F+ i F- stanice i prilikom toga se F faktor donora replicira i njegova kopija prelazi u F- stanicu preko konjugacijskog mostića
• F plazmid se, osim što može biti slobodan u citoplazmi, može ugraditi u bakterijski kromosom i pri tom nastaje Hfr soj (“high frequency of recombination”)
• F plazmid ugrađuje se u bakterijski kromosom jednim krosing-overom
• Hfr soj konjugira s F- sojem i pri tome Hfr je donor koji daje kopiju svog kromosoma F- stanici (recipijent)
• Prijenos ide uvijek u jednom smjeru preko konjugacijskog mostića
• Bakterijski kromosom se prenosi kao linearna molekula nakon pucanja na određenom mjestu unutar integriranog F plazmida; stoga preko mostića prvo prelazi jedan dio F plazmida koji za sobom “vuče bakterijski kromosom”
• Vrlo rijetko uspije prijeći čitav bakterijski kromosom; u tom slučaju posljednji ulazi dio plazmida
• Najčešće prijeđe samo dio bakterijskog kromosoma, jer je konjugacijski mostić vrlo nestabilna struktura koja lagano puca
• U rekombinaciju je uključen samo dio kromosoma donora koji je ušao u stanicu recipijenta; takva stanica je parcijalni diploid ili merozigota
• Rekombinante se mogu detektirati pomoću selektivnih podloga
Konjugacija
SEKSDUKCIJA (F’ DUKCIJA)
• To je prijenos F’ plazmida koji nastaje izrezivanjem F plazmida iz bakterijskog kromosoma Hfr soja; pri tome dolazi do izrezivanja i susjednih bakterijskih gena
• Prilikom prijenosa F’ u stanicu recipijenta, može ponovno doći do ugradnje u bakterijski kromosom, a pri tome i do ugradnje (rekombinacije) bakterijskih gena donora
• F’ plazmid ima visoku stopu spontane integracije za razliku od F+, a najčešće se integrira na isto mjesto kao u originalnom Hfr soju
• F’ dukcija je značajna u istraživanju ekspresije gena zbog stvaranja stabilnih merozigota
MAPIRANJE (KARTIRANJE) BAKTERIJSKIH GENA
• Za mapiranje se mogu koristiti svi mehanizmi rekombinacije: transformacija, konjugacija, seksdukcija i transdukcija
Konjugacija i mapiranje• Jacob i Wollman - razvili tehniku prekinutog parenja
(konjugacije) kojom su dokazali da je prijenos genetičkog materijala donora u recipijenta za vrijeme konjugacije linearan proces
• Pomiješali soj F- i Hfr u mikseru; svakih nekoliko minuta uključivali mikser kako bi razdvojili stanice u konjugaciji; stanice se nacijepljuju na podlogu koja sadrži antibiotik koji ubija Hfr stanice koje su prirodno osjetljive na njega
• Zatim se preostale stanice nacijepe na minimalne podloge s različitim dodacima (npr. na podlozi bez leucina može rasti samo prototrofna rekombinanta koja nastaje prijenosom gena za Leu iz Hfr u F- i njegovom ugradnjom u genom F- soja)
• Poredak gena određuje se na osnovu vremena koje je potrebno da određeni gen prijeđe iz donora u recipijenta (prekinuta konjugacija –minute) te na osnovu broja prototrofnih rekombinanata koje nastaju prijenosom gena i njihovom ugradnjom u kromosom recipijenta
• Karta bakterijskog kromosoma je kružna karta, a jedinice karte su minute koje dobivamo tehnikom prekinute konjugacije
Kružna karta bakterijskog “kromosoma”
TRANSDUKCIJA
• Prijenos nasljedne tvari iz jedne bakterije u drugu pomoću bakterijskih virusa
• Otkrili su je Lederberg i Zinder 1951.• U-cijev čije su strane odvojene filterom sa veličinom
pora manjom od veličine bakterijske stanice; 2 različita auksotrofna soja bakterije Salmonella typhimurium
• Iako je između sojeva barijera (filter) došlo je do rekombinacijei pri tome je nastao prototrofan soj koji raste na minimalnoj podlozi
• Mogućnost transformacije je isključena jer su podlozi dodali enzime koji razgrađuju golu DNA
• U podlozi su našli čestice virusa P22 koji je dovoljno malen da prođe kroz pore bakterijskog filtra
SAŽETAK
• Prokarioti su jednostavni, jednostanični organizmi bez prave jezgre; nasljedna uputa je u nukleoidu –prstenastoj dvolančanoj molekuli DNA (haploidniorganizmi!)
• U prokariota ubrajamo bakterije, cijanobakterije i mikoplazme
• Bakterije se razmnožavaju binarnom diobom nakon replikacije DNA pri čemu nastaju genetički identični produkti
• u bakterija dolazi do genetičke rekombinacijekonjugacijom, transformacijom i transdukcijom