USPOREDBA FLUORESCENTNIH PROBI U ORAC METODI · 2015-12-22 · fluorescent probe, and a standard or a sample for which the antioxidant capacity needs to be determined. During the

Sveučilište u Splitu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Odjel za kemiju

Blanka Roje

USPOREDBA FLUORESCENTNIH PROBI U ORAC METODI

Diplomski rad

Split, 2015.



Odjel za kemiju

Blanka Roje


Diplomski rad

Split, 2015.

2

Ovaj rad, izrađen na Odjelu za kemiju, pod

voditeljstvom mentora doc. dr. sc. Ivice Ljubenkova,

predan je na ocjenu Odjelu za kemiju Prirodoslovno-

matematičkog fakulteta Sveučilišta u Splitu radi

stjecanja zvanja magistre edukacije biologije i kemije.



Odjel za kemiju Diplomski rad


Blanka Roje

Teslina 12, 21 000 Split

ORAC (engl. oxygen radical absorbance capacity - kapacitet za apsorpciju kisikovih radikala)

je standardizirana metoda koja se koristi za dobivanje antioksidacijskih vrijednosti raznih

prehrambenih proizvoda. Tipična reakcijska smjesa u ORAC eksperimentu sadrži izvor peroksilnih

radikala, fluorescentnu probu, te standard ili uzorak kojem je potrebno odrediti antioksidacijski

kapacitet. Uslijed reakcije slobodnih radikala i fluorescentne probe (boja), boja se oksidira i prelazi u

nefluorescentni oblik, što se očituje kao pad intenziteta fluorescencije. Ukoliko se u reakcijsku smjesu

dodaju antioksidansi, dolazi do usporavanja ove reakcije, budući da antioksidansi reagiraju sa

slobodnim radikalima. U ovom radu napravljena je usporedba rezultata ORAC testa korištenjem

fluorescentnih proba B-PE, fluoresceina i diklorofluoresceina. Od tri ispitane probe, najveću

reproducibilnost rezultata pokazao je fluorescein. Ostale dvije probe, B-PE i diklorfluorescein zbog

manje osjetljivosti, visoke nabavne cijene te nedovoljnog poznavanja reakcijskog mehanizma nisu

korištene za daljna ispitivanja antioksidacijskog kapaciteta.

(33 stranice, 17 slika, 5 tablica, jezik izvornika: hrvatski)

Ključne riječi: ORAC test, antioksidans, B-PE, fluorescein, diklorofluorescein

Voditelj: dr. sc. Ivica Ljubenkov, doc.

Neposredni voditelj: dr. sc. Matilda Šprung

Ocjenitelji: dr. sc. Ivica Ljubenkov, doc.

dr.sc. Matilda Šprung

Barbara Soldo, prof.

Rad prihvaćen: 21.12.2015.

University of Split

Faculty of Science

Department of Chemistry Graduation Thesis

COMPARISON OF DIFFERENT FLUORESCENT PROBES IN ORAC ASSAY

Blanka Roje

Teslina 12, 21 000 Split

ORAC (oxygen radical absorbance capacity) assay is a standardized method for measuring

antioxidant values in different foods. A typical ORAC reaction contains a source of peroxyl radicals, a

fluorescent probe, and a standard or a sample for which the antioxidant capacity needs to be

determined. During the collision of free radicals and the fluorescent probe, dye is oxidized to a non-

fluorescent form, which can be measured as a decrease in fluorescence intensity. An addition of

antioxidants to the reaction mixture slows down the reaction, since antioxidants reacts with free

radicals. In this paper a comparison of three fluorescent probes is conducted: B-PE, fluorescein and

dichlorofluorescein. Of the tested probes, the highest reproducibility of results had the fluorescein dye.

The other two probes, B-PE and dichlorofluorescein, due to a higher purchase price, a lack of

understanding of the reaction mechanism and a generally lower sensitivity range were not used in

further studies of antioxidant capacity.

(33 pages, 17 figures, 5 tables, original in: Croatian language)

Keywords: ORAC assay, antioxidant, B-PE, fluorescein, dichlorofluorescein

Supervisor: Ph. D. Ivica Ljubenkov, Asst. Prof.

Intermediate supervisor: Ph. D. Matilda Šprung

Reviewers: Ph. D. Ivica Ljubenkov, Asst. Prof.

Ph. D. Matilda Šprung

Barbara Soldo, Prof.

Thesis accepted: 21.12.2015.

SADRŽAJ:

1. UVOD................................................................................................................................. 1

2. LITERATURNI PREGLED ............................................................................................ 2

2.1. Antioksidansi ................................................................................................... 2

2.2. Reaktivne vrste ................................................................................................ 2

2.3. Stanični mehanizmi regulacije koncentracije reaktivnih vrsta ........................ 4

2.4. Auotooksidacija lipida..................................................................................... 5

2.5. Reakcijski mehanizmi gašenja radikala.......................................................... 8

2.6. Fluorescentna spektroskopija .......................................................................... 9

2.6.1. Fluorescencija ...................................................................................... 9

2.6.2. Spektrofluorimetar ............................................................................. 11

3. MATERIJALI I METODE............................................................................................ 12

3.1. Materijali ...................................................................................................... 12

3.2. ORAC metoda ............................................................................................... 13

3.2.1. Postavke uređaja ................................................................................ 15

3.2.2. Priprema otopina................................................................................ 16

3.2.3. Priprema mikrotitarske pločice .......................................................... 16

3.2.4. Prednosti i nedostaci ORAC metode ................................................. 18

3.2.5. Ograničenja ORAC metode ............................................................... 19

4. REZULTATI ................................................................................................................... 21

4.1. Obrada podataka ............................................................................................ 21

4.2. Izrada baždarnog dijagrama .......................................................................... 24

5. RASPRAVA..................................................................................................................... 28

5.1 B- PE .............................................................................................................. 28

5.2 Fluorescein ..................................................................................................... 28

5.3 2',7' - Diklorofluorescein ................................................................................ 30

2

5.6 Zaključak ........................................................................................................ 31

6. LITERATURA................................................................................................................ 32

1. UVOD

Posljednjih godina razni mediji nas izvještavaju o zdravstvenim koristima namirnica

bogatih antioksidansima. Razlog rastućeg medijskog interesa je pojava velikog broja

znanstvenih istraživanja koja su dokazala negativan utjecaj slobodnih radikala i drugih

reaktivnih vrsta na stanicu, a posljedično i na organizam tako što ubrzavaju proces starenja i

omogućuju patogenezu raznih bolesti. U više kliničkih i epidemioloških istraživanja uočena je

veza između povećanog uzimanja prehrane bogate antioksidansima, poput voća i povrća, sa

smanjenom pojavom kardiovaskularnih bolesti, tumora te općenito starenja. Ispitivanja

antioksidacijskih svojstava hrane dobila su snažan zamah te je u posljednjih dvadeset godina

pojavljivanje samog izraza „antioksidans“ u znanstvenoj literaturi poraslo preko 300%.

Zbog kompleksnog sastava hrane, izdvajanje svih antioksidansa i njihovo pojedinačno

proučavanje je skupo i neučinkovito, pogotovo uzimajući u obzir mogući sinergistički učinak

koji imaju u hrani. Osim vanjskih izvora antioksidansa, u biološkim sustavima postoje i razni

unutarstanični enzimski i neenzimski antioksidacijski mehanizmi koji se zajednički nazivaju

antioksidacijski kapacitet stanice. Budući da u stanici postoji više ovakvih mehanizama, niti

jedan test ne može istovremeno dokazati sve izvore radikala kao ni sve antioksidanse [1].

Veliki broj metoda za mjerenje antioksidacijskog kapaciteta dovodi do nepravilne

interpretacije rezultata pa se javlja potreba za standardiziranom metodom koja bi omogućila

jednoznačno mjerenje antioksidacijskog kapaciteta bilo unutar stanice bilo u hrani [2]. ORAC

(engl. oxygen radical absorbance capacity - kapacitet za apsorpciju kisikovih radikala) je

općeprihvaćena standardizirana metoda koja se najčešće koristi za dobivanje antioksidacijskih

vrijednosti prehrambenih proizvoda.

Cilj ovog rada je napraviti usporedbu tri fluorescentne probe, B-PE, fluorescein i

diklorofluorescein koje će se koristiti u ORAC metodi. Uzorci standarda koji će se analizirati

tijekom ovog istraživanja su otopine Troloxa preko kojih će se u konačnici izražavati ORAC

vrijednosti (Trolox ekvivalenti).

2

2. LITERATURNI PREGLED

2.1. Antioksidansi

Antioksidans se može definirati na više načina. U kemijskoj industriji to su molekule

koje usporavaju autooksidaciju (lančanu reakciju s radikalima koju započinje molekula

kisika) kemijskog proizvoda poput plastike i gume. U biologiji definicija glasi: „sintetička ili

prirodna tvar koja sprječava ili odgađa propadanje zbog djelovanja kisika iz zraka, odnosno

enzimi ili druge organske molekule koje mogu neutralizirati štetne učinke oksidacije u stanici

ili u tkivu.“ [2]. U znanosti o prehrani antioksidansi imaju dvostruko značenje: to su spojevi u

prehrambenim proizvodima koji (a) sprječavaju pojavu užeglosti masti ili (b) značajno

smanjuju štetne učinke kisikovih i dušikovih reaktivnih vrsta na normalno fiziološko

funkcioniranje ljudskog organizma [2].

Postoje barem četiri vrste antioksidansa: to su enzimi (superoksid-dismutaza,

glutation-peroksidaza i katalaza), velike molekule poput proteina, male molekule (glutation,

karotenoidi, polifenoli) i hormoni (estrogen, angiotensin, metatonin). Antioksidansi mogu

djelovati na dva načina: mogu inhibirati stvaranje reaktivnih vrsta ili mogu sudjelovati u

njihovom gašenju. Kada uzmemo u obzir oba mehanizma djelovanja možemo govoriti o

širokom spektru molekula ili atoma koje djeluju antioksidacijski, poput metalnih kelatora,

inhibitora oksidativnih enzima, kofaktora antioksidacijskih enzima i molekula koje gase

lančane reakcije. Prema ovoj definiciji selenij spada u antioksidanse pošto djeluje kao

kofaktor selenoproteina. Međutim sam selenij nema nikakav utjecaj na reaktivne vrste te bi

ispitivanje njegovog antioksidacijskog učinka in vitro testovima bilo neučinkovito. In vitro

testovi antioksidacijskih svojstava, ograničeni su na ispitivanje sposobnosti antioksidansa da

ugasi određene reaktivne vrste i time zaustavi lančanu reakciju koju one uzrokuju [2]. Često

se izrazi antioksidansi i antioksidacijski kapacitet koriste u užem značenju kako bi opisali

tvari koje ispitujemo ovakvim testovima. U tom slučaju, selenij ne bi spadao u antioksidanse.

2.2. Reaktivne vrste

3

Reaktivne kisikove vrste su svi spojevi i oblici kisika koji su reaktivniji od

molekularnog kisika (O2) poput superoksidnog aniona (O2-), hidroksila (HO), perhidroksil

radikala (O2H), vodikovog peroksida (H2O2), singlet kisika (1O2) i ozona (O3). Zbog visoke

reaktivnosti imaju veoma kratko vrijeme poluživota. Njihovo postojanje u okolišu posljedica

je velikog udjela kisika u atmosferi. Slobodni radikali, atomi ili molekule koje posjeduju

jedan ili više nesparenih elektrona, također spadaju u skupinu reaktivnih vrsta. Elektroni su

stabilni kada su spareni, odnosno kada dva elektrona suprotnog spina zajedno popunjavaju

istu orbitalu. Radikali imaju nestabilne nesparene elektrone te su zato reaktivniji od ne-

radikala. Osim reaktivnih kisikovih spojeva, postoje i reaktivni dušikovi spojevi poput

dušikovog (II) oksida (˙NO), dušikovog dioksid radikala (˙NO2) te drugih reaktivnih spojeva

koje nisu radikali [3].

U normalnim uvjetima koncentracija reaktivnih vrsta u stanicama je niska. Reaktivne

vrste su proizvodi normalnih staničnih procesa te su esencijalne za život – sudjeluju u

provođenju signala, relaksaciji glatkih mišića, nakupljanju krvnih pločica, kontroli imunosnog

sistema, fagocitozi, regulaciji krvnog tlaka, sintezi bioloških molekula, metabolizmu

ksenobiotika itd. Stresna stanja poput suše, toplinskog šoka ili izloženosti teškim metalima

dovode do gubitka homeostaze i povećane koncentracije reaktivnih spojeva u stanici. Osim

toga može doći do oksidacije DNA i proteina što zajedno dovodi do uništavanja stanice koje

nakon određenog stupnja postaje nepovratno te nastupa stanična smrt. Istraživanje reaktivnih

vrsta zahtijeva osjetljive i specifične metode koje bi omogućile detaljan uvid u njihove

reakcijske mehanizme kao i na učinke koje reaktivne vrste imaju na samu stanicu. Budući da

su reaktivne vrste kratkog životnog vijeka te da u stanici postoji veliki broj kemijskih spojeva

koje djeluju kao antioksidansi, njihova identifikacija i detekcija u živim sustavima uvelike je

otežana. Međutim, obećavajuća suvremena metoda kojom se velikom osjetljivošću može

detektirati široki spektar različitih reaktivnih vrsta je fluorescentna spektroskopija [3].

Oksidativni stres generira mnoštvo radikala u stanici, a jedan od najučestalijih je

peroksil radikal opće formule ROO·. Najčešće nastaje oksidacijom lipida u staničnoj

membrani [2]. Peroksil radikal se za potrebe ORAC testa generira iz azo spoja opće formule

R2N2. To su nestabilni spojevi te se raspadaju na alkilni radikal i dušik, a alkilni radikal ubrzo

reagira s kisikom te nastaje peroksil radikal (1,2). Azo spoj koji se najčešće koristi je AAPH,

punim imenom 2,2'-Azobis (2-amidinopropan) dihidroklorid (Slika 1). Ovu reakciju pokreće

toplina pa se raspad spoja zove još i termoliza.

4

R2N2 N2+ R∙ (1)

R∙ + O2 ROO∙ (2)

Slika 1. AAPH - 2,2'-Azobis (2-amidinopropan) dihidroklorid [11]

2.3. Stanični mehanizmi regulacije koncentracije reaktivnih vrsta

Gašenje reaktivnih vrsta je neizbježno za preživljavanje svih aerobnih oblika života.

Reaktivne vrste su štetne za stanicu u većim koncentracijama, a u isto vrijeme u malim

količinama imaju važnu ulogu jer djeluju kao unutarstanični i međustanični glasnici.

Stanice su tijekom evolucije razvile različite obrambene mehanizme kako bi osigurale

ravnotežu između stvaranja i uklanjanja reaktivnih vrsta. Superoksid-dismutaza katalizira

pretvorbu dva superoksidna aniona u vodikov peroksid i kisik (3). U peroksisomima

eukariota, enzim katalaza pretvara vodikov peroksid u vodu i kisik tako dovršava gašenje koje

je započela superoksid-dismutaza (4) pretvaranjem superoksidaniona u vodikov peroksid.

Glutation-peroksidaza je vrsta enzima koja sadržava selenij te katalizira razgradnju vodikovog

peroksida do vode kao katalaza, ali i razgradnju organskih peroksida do alkohola (5).

2O2−+2H+ 2 H2O2+ O2 (3)

2 H2O2 2 H2O+ O2 (4)

2 RO2H 2 ROH + O2 (5)

Osim navedenog, unutar stanice postoje i brojne neproteinske male molekule koje

imaju ulogu u antioksidacijskom djelovanju. Glutation je jedna od najbitnijih malih molekula

5

koja štiti stanicu od štetnih reaktivnih kisikovih vrtsa. Po kemijskom sastavu, glutation je

tripeptid sačinjen od glutaminske kiseline, cisteina i glicina, pri čemu sulfhidrilna skupina

cisteina djeluje kao donor protona tijekom sudara s reaktivnom vrstom. Reducirani oblik

glutationa regenerira se djelovanjem NADPH-ovisne-reduktaze, a omjer oksidiranog i

reduciranog glutationa može dati informaciju o obimu oksidativnog stresa. Koncentracija

glutationa u stanici je relativno visoka te doseže mikromolarne vrijednosti. Osnovna uloga je

detoksikacija peroksida i regeneracija drugih antioksidansa, primjerice vitamina C i E.

Vitamin C ili askorbinska kiselina je molekula topljiva u vodi koja ima mogućnost reduciranja

reaktivnih vrsta, a vitamin E ili α-tokoferol je molekula topljiva u lipidima koja, prema nekim

istraživanjima, ima sličnu ulogu kao glutation, ali s djelovanjem u staničnoj membrani [4].

Osim što se raznim mehanizmima štite od reaktivnih vrsta, stanice ih također mogu i

same ciljano sintetizirati, a taj je proces enzimski reguliran. U fagocitima najvažniji takav

enzim je NADPH-oksidaza, membranski proteinski kompleks, koji omogućuje baktericidno

djelovanje fagocitnih stanica [4].

2.4. Auotooksidacija lipida

Autooksidacija lipida je lančana reakcija i može se podijeliti u tri faze: inicijacija,

propagacija i terminacija. Inicijacija podrazumijeva stvaranje slobodnih radikala ili drugih

reaktivnih vrsta, primjerice djelovanjem UV svijetlosti ili topline. U nekim slučajevima uzrok

inicijacije nije poznat, ali se smatra se da je riječ o spontanoj reakciji kisika s vrstom kojoj se

lako može ukloniti vodik. Jednom kad su slobodni radikali formirani, započinje lančana

reakcija koja traje sve dok se slobodni radikali međusobno ne ugase, ili ih ne ugasi

antioksidans, odnosno ne spari svoj nespareni elektron. Nezasićene masne kiseline, poput

onih prisutnih u lipidima u staničnoj membrani, česta su meta reaktivnih vrsta. Peroksidacija

ili autooksidacija lipida je ključni pokazatelj oksidacijskog stresa u stanici [5].

U reakciji s azo-spojem kao izvorom radikala, inicijacija započinje reakcijama (1) i

(2), odnosno raspadom tog spoja na peroksil radikale. Peroksil radikal (ROO·) reagira s

lipidnom molekulom (LH) te nastaje alkilni radikal (L·) (6) [2].

ROO∙ + LH ROOH+L∙ (6)

6

Alkilni radikal je nestabilan te ubrzo reagira s kisikom pri čemu nastaje lipidni

peroksil radikal (LOO·) (7). Propagacija je nastavljanje reakcijskog lanca s prve lipidne

molekule na ostale. Lipidni peroksil radikal vrlo je nestabilan te reagira s lipidnom

molekulom. Produkti su lipidni peroksil (LOOH) i novi alkilni radikal (8). Novi radikal

reagira na isti način te se ciklus se ponavlja [2].

L∙ + O2 LOO∙ (7)

LOO∙ + LH LOOH+L∙ (8)

Terminacija ili zaustavljanje reakcijskog lanca se događa kada se radikali međusobno

povežu u neradikalni produkt (9).

LOO∙ + LOO∙ neradikalni produkt (9)

Antioksidansi djeluju inhibicijski na lančanu reakciju tako što reagiraju sa slobodnim

radikalom (10). Radikalni produkt antioksidansa je manje reaktivan te se može prevesti u

neradikalni produkt u reakciji s preostalim radikalima (11).

LOO∙ + AH LOOH+A∙ (10)

LOO∙ +A∙ neradikalni produkti (11)

Posljedica autooksidacije lipida je stvaranje velikog broja molekula lipidnih

hidroperoksida (LOOH) iz membranskih lipida (LH). Prevelika količina hidroperoksida može

oštetiti staničnu membranu. Oni nisu stabilni te se mogu dalje raspadati na produkte koji

mogu biti vrlo štetni za stanicu (Slika 2) [2].

7

Slika 2. Shema autooksidacije nezasićene masne kiseline [5]

8

2.5. Reakcijski mehanizmi gašenja radikala

Antioksidansi mogu ugasiti radikale na dva načina – transferom vodika ( hydrogen

atom transfer - HAT) i transferom jednog elektrona ( single electron transfer - SET). Oba

mehanizma imaju isti krajnji rezultat, ali je kinetika različita. Energija veze vodik-donorske

skupine i ionizacijski potencijal su glavni čimbenici koji određuju koji od ova dva mehanizma

će se odvijati [1].

HAT reakcije ovise o energiji veze vodika u donorskoj skupini antioksidansa, a

neovisne su o otapalu i pH te su uglavnom vrlo brze. Prisutnost metala ili drugih reducensa

dovodi do pogrešno visokih rezultata. U HAT reakciji, radikal (R) se gasi prijenosom atoma

vodika pri čemu nastaje radikal antioksidansa koji bi treba biti manje reaktivan:

R∙+AH RH+ A∙ (12)

SET reakcija je redoks reakcija. Antioksidant (AH) prenosi jedan elektron na radikal,

nastaje radikal koji se kasnije deprotonira, a ion R- se protonira. Krajnji produkti su isti kao i

kod HAT mehanizma:

R∙+AH R−+AH∙+ (13)

AH∙+ H2OA∙+H3O+ (14)

R−+H3O+ RH+H2O (15)

SET i HAT mehanizmi gotovo uvijek se pojavljuju zajedno, a njihov omjer je određen

strukturom antioksidansa i pH. SET reakcija ovisi o deprotoniranju i ionizacijskoj energiji

reaktivne funkcionalne skupine. Povećanjem pH povećava se elektron-donorski kapacitet

funkcionalne skupine, a s tim i zastupljenost SET mehanizma. SET reakcije traju dulje pa

međuprodukt može ući u sekundarne reakcije zbog čega su SET reakcije ujedno i manje

pouzdane. Elementi u tragovima i kontaminanti (posebice metali) mogu ometati SET reakciju

te dovesti do visoke varijabilnosti i slabe reproducibilnosti rezultata [1].

Testovi za ispitivanje antioksidacijskog kapaciteta baziraju se na jednom od ova dva

mehanizma. Primjer testova sa SET mehanizmom su FRAP (engl. Fluorescence Recoveery

9

After Photobleaching), TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) i FCR (Folin–

Ciocalteu reagent) testovi. Sva tri mjere redoks reakciju, odnosno redukciju fluorescentne

probe koja označava kraj reakcije. U FRAP testu to je nefluorescentna molekula Fe3+-TPTZ

(željezov (III) tripiridiltriazin) koja redukcijom prelazi u fluorescentni oblik Fe2+-TPTZ. Kod

biranja vrste oksidansa (fluorescentne probe) bitna je njihova selektivnost, oksidans ne bi

trebao oksidirati stanične građevne molekule. Ovo se najviše odnosi na šećere koji mogu

reducirati metalne ione (Fehling reakcija s bakrovim ionima). Takva redukcijska sposobnost

se ne uvrštava u antioksidacijski kapacitet, a takav bi neselektivni oksidans dao lažno visoke

rezultate. S obzirom na reakcijski mehanizam, bilo bi prikladnije SET testove nazivati

testovima redukcijske sposobnosti, umjesto testovima za antioksidacijski kapacitet.

Redukcijska sposobnost je bitna za gašenje lančanih reakcija koje su pokrenule reaktivne

vrste i dio je ukupnog antioksidacijskog kapaciteta [2].

HAT reakcijski mehanizam je najbitniji u biologiji čovjeka. ORAC (engl. oxygen

radical absorbance capacity) i TRAP (engl. total radical-trapping antioxidant parameter)

testovi su dvije standardizirane metode temeljene na HAT reakcijskom mehanizmu [2].

2.6. Fluorescentna spektroskopija

Fluorescentna spektroskopija (fluorometrija ili spektrofluorometrija) je vrsta

elektromagnetske spektroskopije koja mjeri fluorescenciju uzorka, a zbog jednostavne

detekcije počela se koristiti još u 19. stoljeću. U spektrofluorimetru, uzorak se osvjetljuje

snopom zraka UV svjetlosti koja pobuđuje elektrone u ispitivanim molekulama, nakon

pobude dolazi do relaksacije (emisije apsorbirane energije) oslobađanja energije u obliku

svjetlosti, odnosno fluorescencije. Suvremena fluorescentna spektroskopija počela se razvijati

pedesetih godina prošlog stoljeća [6].

2.6.1. Fluorescencija

Luminiscencija je emisija svjetlosti iz neke tvari koja se događa zbog pobuđenih

elektrona. Povratkom u osnovno energetsko stanje oni otpuštaju višak energije tako što

emitiraju svjetlost. Takva emisija svjetlosti se dijeli na fluorescenciju i fosforescenciju. Kod

fluorescencije pobuđeni elektron je u singlet stanju, odnosno sparen je suprotnim spinom s

elektronom u polupopunjenoj orbitali u osnovnom stanju te je zato njegov povratak u osnovno

stanje brz (otprilike 10 ns). Fosforescencija je emisija svijetla od elektrona u triplet

10

pobuđenom stanju istog spina kao i nepobuđeni elektron. Isti spin ne dopušta povratak

elektrona u orbitalu u osnovnom stanju te je zato povratak sporiji, a emisija svijetla odgođena.

Molekule koje fluoresciraju se zovu fluorofori. Najčešće su to molekule koje

sadržavaju aromatski prsten. Takve molekule uglavnom imaju više konjugiranih dvostrukih

veza i više rezonantnih struktura. Osim molekula, fluorescenciju pokazuju i neki kristali. Svi

fluorofori imaju karakteristični ekscitacijski (pobudni) i emisijski spektar. Ekscitacijski

spektar je grafički prikaz količine apsorbirane svjetlosti u odnosu na valnu duljinu (λex), a

emisijski spektar je isti takav prikaz za emitiranu svijetlost (λem). Emisijski spektar uvijek ima

maksimum na većim valnim duljinama od ekscitacijskog spektra, što znači da se ukupno

emitira manje svjetlosne energije nego što se apsorbira. Razlog za to je otpuštanje energije u

obliku topline vrlo brzim prelaskom u osnovni vibracijski nivo pobuđenog stanja što se

događa prije emisije svijetlosti. Prelasci u različite energetske nivoe i podnivoe, a koji nastaju

kao poslijedica apsorpcije i emisije elektormagnetskog zračenja, obično se prikazuju pomoću

Jablonski dijagrama (Slika 3). Jablonski dijagram, između ostalog, pokazuje odnos

energetskih stanja elektrona i razliku između fluorescencije i fosforescencije. S0 je osnovno

singletno stanje, S1 i S2 su ekscitirana singlet stanja, a T1 je ekscitirano tripletno stanje. Unutar

svakog energetskog stanja postoje i podstanja ili vibracijski energetski nivoi, označeni

brojkama 0, 1 i 2. Nakon apsorpcije svjetlosne energije fluorofor prelazi iz S0 stanja u S1 ili S2

stanje. Povratak u najniže energetsko stanje (S0) je brz te se ponekad odvija uz emisiju

svijetlosti. Tada imamo pojavu fluorescence.

Bitna stavka svakog fluorofora koji se koristi u istraživanjima je i kvantni prinos

fluorescencije. Kvantni prinos je omjer emitiranih fotona i apsorbiranih fotona. Što je veći

kvantni prinos, to molekula ima veću emisijsku efikasnost, odnosno više flourescira. Pri

odabiru fluorescentnih proba u istraživanjima, prednost imaju fluorofori s visokim kvantnim

prinosom [6].

11

Slika 3. Jablonski dijagram [6]

2.6.2. Spektrofluorimetar

Spektrofluorimetar je instrument koji mjeri intenzitet fluorescencije uzorka uglavnom

u svrhu određivanja koncentracije fluorescentnih molekula. U mjerenjima se koriste

ekscitacijska (pobudna) i emisijska svjetlost određene valne duljine. To se postiže

dovođenjem svjetlosti na filter ili na monokromator koji razdvaja polikromatsku svjetlost na

monokromatsku te propušta onu koja je odabrane valne duljine. Put koji svjetlost pređe u

uređaju može se opisati na sljedeći način: svjetlost kreće od njenog izvora - lampe s

plemenitim plinom (ksenon, argon), zatim prolazi kroz monokromator, monokromatska

svjetlost osvjetljuje uzorak, uzorak fluorescira, emitirana svjetlost dolazi do emisijskog

monokromatora, on omogućuje propuštanje samo svjetlosti određene valne duljine koja se

zatim detektira u detektoru. Dakle, pri spektrofluorimetriji potrebno je odrediti valne duljine

ekscitacijske (pobudne) i emisijske svjetlosti prije početka mjerenja. Spektrofluorimetrija daje

izuzetno točne rezultate čak i kada se ispituju uzorci vrlo niskih koncentracija, čak u ppm (

engl. particles per milion - broj čestica u milijun čestica). Spektrofluorimetriju može ometati

gašenje fluorescencije (engl. quenching). To su različite interakcije fluorofora s drugim

molekulama u uzorku, a koje gase fluorescenciju te smanjuju njen intenzitet. Gašenje se

pojavljuje zbog nečistoća u uzorku ili zbog otopljenog kisika. Osim tvari u uzorku na

intenzitet fluorescencije utječe i temperatura: povećanje temperature dovodi do većeg broja

sudara među molekulama te se time smanjuje intenzitet fluorescencije [6].

12

3. MATERIJALI I METODE

3.1. Materijali

2,2'-Azobis (2-amidinopropan) dihidroklorid (AAPH), fluorescein, diklorofluorescein,

6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilna kiselina (Trolox), natrij dihidrogenfosfat,

natrij hidrogenfosfat i B-fikoeritrin kupljeni su od Sigma-Aldrich.

Za mjerenje fluorescencije korišten je spektrofluorimetar PerkinElmer (LS55) sa

dodatkom za mikrotitarske pločice (Slika 4).

Slika 4. Spektroflourimetar s čitačem mikrotitarskih pločica

Bijele mikrotitarske pločice s 96 jažica kupljene su od Porvair Sciences (Slika 5).

Slika 5. Mikrotitarska pločica

13

3.2. ORAC metoda

ORAC metoda je standardizirani test kojeg su razvili znanstvenici Ghiselli i Glazer

[1]. Najčešće se koristi za dobivanje antioksidacijskih vrijednosti raznih prehrambenih

proizvoda. Prehrambena industrija je prihvatila ovu metodu u toj mjeri da su mnogi

proizvođači počeli isticati ORAC vrijednosti na svojim proizvodima.

ORAC mjeri antioksidacijsku inhibiciju peroksil radikala HAT reakcijskim

mehanizmom. Izvor radikala je azo-spoj AAPH, punog naziva 2,2'-Azobis (2-amidinopropan)

dihidroklorid, koji se raspada na temperaturi od 37°C konstantnom brzinom te tako generira

peroksil radikale.

Fluorescentna proba u testu predstavlja staničnu molekulu koja je izložena

oksidativnom stresu, to jest oksidaciji od strane peroksilnog radikala. Dodani antioksidans se

natječe s fluorescentnom probom za radikale što inhibira i usporava oksidaciju same probe.

Jednadžba reakcije (16) prikazuje reakciju između fluorescentne probe (PH) i peroksilnog

radikala, a jednadžba reakcije (17) prikazuje reakciju između antioksidansa i peroksilnog

radikala. P· je oksidirana proba koja ne fluorescira. Njezino stvaranje može usporiti reakcija

(17) trošenjem peroksil radikala. Što je veća razlika u brzinama ove dvije reakcije u korist

reakcije (17), to antioksidant bolje djeluje [2].

ROO∙+PH ROOH+P∙ (16)

ROO∙+AH ROOH+A∙ (17)

Koliko će uspješno antioksidans djelovati ovisi o konstantama brzine reakcija (16) i

(17) te o koncentracijama antioksidansa i fluorescentne probe. Na početku je koncentracija

antioksidansa velika te je reakcija (17) puno brža od reakcije (16). Kako se antioksidans troši

reakcija (16) se ubrzava pa tako i stvaranje nefluorescentnog produkta. Ovo se može

jednostavno kvantificirati mjerenjem fluorescencije (Slika 7). Antioksidacijski kapacitet je

određen kao smanjenje brzine stvaranja nefluorescentnog produkta P·, odnosno usporavanje

reakcije pod (16), što se očituje usporenim padom intenziteta fluorescencije. Razlika u padu

intenziteta fluorescencije između otopine s antioksidansom i otopine bez antioksidansa

(slijepa proba) se uzima kao mjera antioksidacijskog djelovanja.

14

U testu se kao standardna otopina koristi sintetski antioksidans Trolox. Trolox (6-

hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilna kiselina) je u vodi topljivi analog vitamina

E. To je antioksidans poput vitamina E i koristi se u više bioloških ili biokemijskih testova za

mjerenje oksidativnog stresa i oštećenja (Slika 6). U ORAC testu se mjeri antioksidacijski

kapacitet u Trolox – ekvivalent jedinicama (TE), primjerice: mikromol TE / 100 g uzorka.

Slika 6. Trolox ili 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilna kiselina [10]

ORAC test traje od pola sata do nekoliko sati (Slika 7). Ukupni antioksidacijski učinak

se računa kao površina ispod krivulje intenziteta fluorescencije. Na ovaj način u izračun je

uvršteno ne samo početno odolijevanje radikalima, već ukupni učinak antioksidansa na

odgađanje oksidacije od strane radikala. ORAC je jedina metoda koja kombinira stupanj i

trajanje inhibicije u jednu vrijednost, te daje informacije o zaštitnom učinku antioksidansa u

dužem vremenskom periodu [2].

Slika 7. Prikaz pada intenziteta fluorescencije u ovisnosti o vremenu: krivulje pada intenziteta

fluorescencije za četiri otopine s različitim koncentracijama antioksidansa i otopina slijepe probe

(engl. blank) [2]

15

Računa se iznos površine ispod krivulje za četiri standardne koncentracije

antioksidansa te se od njih oduzima iznos površine ispod krivulje slijepe probe (Slika 7).

Jednadžba pravca se dobije tako da se za y-vrijednosti uzima površina ispod krivulje

standarda umanjena za vrijednost slijepe probe, odnosno neto površina ispod krivulje, a za x-

vrijednosti množina Troloxa u uzorku (Slika 8). Dobije se linearna ovisnost, odnosno pravac

formule y=ax+b.

Slika 8. Ovisnost neto površine ispod krivulje pada intenziteta fluorescencije o množini

Troloxa u uzorku [2]

3.2.1. Postavke uređaja

Prije početka eksperimenta na uređaju su namješteni parametri prikazani u Tablici 1.

Tablica 1. Instrumentalni parametri

Proba

λem (nm)

Širina pukotine za

ekscitacijsku svjetlost (nm)

λex (nm)

Širina pukotine za

emisijsku svjetlost (nm)

B-PE

540

15

565

2,8

Diklorofluorescein

485

15

530

2,8

Fluorescein

485

15

530

2,8

16

Uređaj je mjerio fluorescenciju ukupno sat ili sat i trideset minuta, te svakih 5 ili 10

minuta ovisno o postavkama u pojedinom mjerenju.

Uređaj s čitačem mikrotitarske ploče je kupljen bez termostata te je on naknadno

ugrađen, a očitavanje temperature se vršilo pomoću termometra. Termostat je bio uključen

najmanje sat vremena prije svakog testa, a pred početak testa termometrom se provjeravala

temperatura unutar uređaja.

3.2.2. Priprema otopina

Za otapanje svih kemikalija korišten je natrij-fosfatni pufer pH 7,0. Pufer je

pripremljen miješanjem otopine natrij-dihidrogenfosfata (0,2 molL-1), otopine natrij-

hidrogenfosfata (0,2 molL-1) i vode u omjeru 19,5:30,5:50. Sviježe pripemljena osnovna

otopina Troloxa (13,3 mmolL-1) podijeljena je u alikvote od 100 µL te je pohranjena pri -

80°C. Ovako pripremljena otopina Troloxa stabilna je tri mjeseca. Za svako mjerenje,

korišten je jedan alikvot Troloxa od kojeg su priređena odgovarajuća razrijeđenja. Nakon

pripreme otopine fluorescentnih probi, B-PE (20.833 µmolL-1) diklorofluorescein (4,2

mmolL-1) i fluorescein (200 µ molL-1) su razdijeljene i pohranjene pri temperaturi od -20 do

4°C. Od alikvota boje priređeno je odgovarajuće razrjeđenje pred svaki eksperiment. Jedino

se AAPH (0,15 molL-1) pripremao sviježe za svako mjerenje.

3.2.3. Priprema mikrotitarske pločice

U svaku jažicu mikrotitarskih pločica dodano je : 30 µL otopine AAPH koncentracije

0,15 molL-1, 30 µL otopine Troloxa koncentracije 6,25 µmolL-1 , 12,5 µmolL-1, 25 µmolL-1 ili

50 µmolL-1 (četiri standardne otopine: ST4, ST3, ST2, ST1) ili 30 µL otopine pufera ( za

blank, odnosno slijepu probu) te 180 µL otopine fluorescentne probe koncentracije 0,08

µmolL-1. Otopina AAPH je dodavana u reakcijsku smjesu pred sam početak testa i to

pipetiranjem s multikanalnom pipetom kako bi se skratilo vrijeme potrebno da se doda u sve

jažice. U svakom mjerenju 4 standardne otopine su pipetirane svaka u jedan red na

mikrotitarskoj pločici (u svih 8 jažica), te je u jedan red je dodana reakcijska smjesa sa

slijepom probom. Mikrotitarska pločica s dodanom probom i standardnom otopinom/puferom

termostatirana je desetak minuta pri 37°C prije dodatka otopine AAPH. Dodavanjem AAPH u

reakcijsku smjesu započinje reakcija, stoga je bitno što prije početi mjeriti fluorescenciju.

Shema popunjavanja jažica na mikrotitarskoj pločici prikazana je u Tablici 2.

17

Tablica 2. Shema popunjavanja mikrotitarske pločice

18

3.2.4. Prednosti i nedostaci ORAC metode

ORAC test je samo jedna od niza metoda koje se koriste za mjerenje antioksidacijskih

vrijednosti različitih uzoraka. Prednosti ORAC metode su automatiziranost, mogućnost

prilagodbe na lipofilne uzorke, poznavanje mehanizma kemijske reakcije (vrijedi za

fluorescein, ne i za B-PE i diklorofluorescein) te mogućnost adaptacije na druge izvore

radikala. Prilagodba na lipofilne uvijete je bitna pošto lipofilni antioksidansi čine između 30 i

40% ukupnog antioksidacijskog kapaciteta [8]. ORAC metoda također može mjeriti

antioksidacijski učinak lipofilnih supstanci tako da se ispitivani uzorak otopi u 50% otopini

acetona sa 7% RMCD (engl. randomly methylated beta cycodextrin) koji povećava topljivost

fluoresceina u nepolarnom otapalu [7]. ORAC je jedina metoda koja kombinira stupanj i

trajanje inhibicije oksidacije u jednu vrijednost. Osim lipofilnih i hidrofilnih antioksidansa u

hrani, ORAC test može mjeriti i antioksidacijski kapacitet krvne plazme. Na taj način

možemo dobiti podatke o promjeni antioksidacijskog kapaciteta krvi nakon konzumacije

različitih namirnica [7].

Prednost ORAC testa jest i to što je standardizirana metoda. Previše analitičkih metoda

dovodi do nedosljednih rezultata, nepravilne upotrebe i interpretacije testova i netočne

specifikacije antioksidacijskog djelovanja. Standardiziranje metoda omogućuje: navođenje na

ispravnu uporabu testova, značajniju mogućnost usporedbe prehrambenih proizvoda, način

kontrole varijabilnosti proizvoda i određivanje standarda kvalitete hrane. Standardizirana

metoda se ispituje kroz duži vremenski period i u više laboratorija. Na taj način prednosti i

mane metode se uočavaju te se uočeni problemi rješavaju. Metoda mora ispunjavati sljedeće

zahtjeve: mjeri točno određenu kemijsku reakciju, ima definirani kemijski mehanizam i kraj

mjerenja, koristi biološki važan izvor radikala, jednostavna je, ima visoku reproduktibilnost te

mogućnost ispitivanja hidrofilnih i lipofilnih antioksidansa, omogućuje korištenje različitih

izvora radikala te da se može prilagoditi za analizu velikog broja podataka za rutinske

provjere kvalitete [1].

Među nedostatke spada dugo trajanje testa, no to je kompenzirano velikom količinom

uzoraka koji se mogu ispitati u jednom ispitivanju. To se postiže korištenjem mikrotitarskih

pločica sa 48 ili 96 jažica za uzorke. Koeficijent varijacije je niži za manje pločice i iznosi 4-

5% u usporedbi s 4-10% za veće [1]. To je posljedica visoke temperaturne osjetljivosti

19

reakcije te je pažljiva kontrola temperature nužna prilikom izvođenja testa. Ovo se postiže

inkubiranjem mikrotitarskih pločica na 37°C u trajanju od desetak minuta prije početka samog

eksperimenta. Usprkos ovoj mjeri, vanjski rubovi pločice pokazuju drugačije rezultate zbog

različite temperature unutar uređaja. Ovo je svojstveno svim testovima koji su izrazito

temperaturno ovisni, stoga se ova varijabilnost ne može u potpunosti ukloniti. Nadalje, u

istraživanjima se pokazalo da inkubiranje pufera za otapanje AAPH bitno smanjuje

varijabilnost rezultata testa [7]. U ovom istraživanju provođeno je inkubiranje mikrotitarskih

pločica s uzorcima, ali ne i pufera za otapanje AAPH.

3.2.5. Ograničenja ORAC metode

Svi testovi za mjerenje antioksidacijskog kapaciteta su in vitro metode kao i većina

drugih testova za analizu hrane te sadrže sve inherentne nedostatke takvih metoda. In vitro

istraživanja nikada ne preslikavaju točno ono što se događa u organizmu niti se to od njih

očekuje. ORAC test mjeri antioksidacijska svojstva prvenstveno grupe spojeva koji se

nazivaju flavonoidi. U biljnim stanicama ima na tisuće ovakvih spojeva. Iako smo unaprijedili

analitičke metode za njihovo detektiranje i kvantificiranje i dalje nemamo metode kojima

možemo jednostavno kvantificirati sve ove molekule u jednom uzorku. ORAC test je zato

izrazito koristan analitički alat za određivanje ukupne količine ovih spojeva te također ostalih

neflavonoidnih molekula poput vitamina C i E. No, to ne znači da sve ove molekule imaju

antioksidacijska svojstva in vivo - neki spojevi se ne apsorbiraju u tijelu ili prelaze u drugačiji

oblik koji nema ista antioksidacijska svojstva. Odgovori na ova pitanja su u domeni

istraživanja in vivo, zato su potrebna daljnja istraživanja o bioaktivnosti flavonoida tijekom

unosa i probave hrane [8].

USDA (Američko ministarstvo poljoprivrede) je nedavno uklonila ORAC vrijednosti

iz svoje baze podataka o hrani. Kao najvažniji razlog naveli su da tvrtke za proizvodnju hrane

i dodataka prehrani namještaju ORAC vrijednosti svojih proizvoda u svrhu njihovog

promoviranja. USDA u izvješću o uklanjanju ORAC rezultata sa svojih službenih stranica

navodi i da ne postoje dokazi o korisnim učincima hrane bogate polifenolima koji se mogu

pripisati antioksidacijskim svojstvima te hrane. Richard Prior u svom odgovoru na njihovo

izvješće navodi studije koje pružaju znanstvene dokaze o zdravstvenoj dobrobiti hrane s

visokim udjelom antioksidansa, iako nije uvijek jasno jesu li pozitivni učinci rezultat

isključivo antioksidacijskih mehanizama. Međutim, poznato je da oksidativni stres važan

20

čimbenik u većini bolesti starenja. Podaci iz više istraživanja pokazali su da uzimanje hrane s

visokim udjelom antioksidansa, poput voća bogatog polifenolima, povećava antioksidacijski

kapacitet krvi, te njegovo konzumiranje zajedno s hranom s visokim udjelom masti ili

ugljikohidrata, koja je prooksidativna i proinflamatorna, može biti protuteža njihovim

negativnim učincima. Vrijednost korištenja ORAC testa je u dobivanju mnoštva podataka koji

su dostupni u ORAC bazi podataka. Bez tih baza podataka ne bi bile moguće iscrpne

epidemiološke studije o odnosu unosa antioksidansa hranom i tijeka bolesti. Bitno je provoditi

test ispravno: koristiti standardiziranu metodu te jasno odrediti jedinice u kojima će se

izražavati ORAC vrijednosti. Mora se naglasiti radi li se o svježoj, osušenoj hrani ili

sokovima zato što se takve ORAC vrijednosti mogu samo indirektno uspoređivati. Proces

proizvodnje hrane utječe na promjenu antioksidacijskog kapaciteta, stoga se na proizvodu

smije naznačiti isključivo ORAC vrijednost za krajnji proizvod [8].

21

4. REZULTATI

4.1. Obrada podataka

Za obradu i vizualizaciju podataka korišteni su softverski alati FL WINLAB

(PerkinAlmer), Excel (Microsoft) te Grafit 6.0 (Erithacus Software).

Nakon mjerenja program FL WINLAB sprema rezultate u Excel datoteku. Za svako

mjerenje dobiveno je između 280 i 800 očitanja fluorescencije (broj jažica x broj mjerenja; 40

x br.mj.), ovisno o ukupnom trajanju testa i o vremenskom intervalu između dvaju mjerenja.

Podatci su obrađeni u Excelu tako da su za 4 standarda i slijepu probu izračunate srednje

vrijednosti za pojedine cikluse mjerenja. Srednje vrijednosti i odgovarajuća vremena su

uvršteni u graf.

Primjer obrade podataka dobivenih u jednom mjerenju s fluorescentnom probom

fluorescein:

Tablica 3. Rezultati iz jednog ciklusa mjerenja

Slijepa proba Std 1 Std 2 Std 3 Std 4

116,55 190,41 180,50 204,17 206,34

114,69 187,57 176,44 215,88 202,45

129,33 184,88 188,65 197,33 217,50

133,64 182,94 178,16 188,54 215,28

144,72 182,13 174,19 193,15 205,10

144,78 190,83 180,11 183,51 189,99

146,44 171,32 180,46 184,02 191,96

155,23 160,64 173,34 185,12 174,61

Izračun srednje vrijednosti za taj ciklus mjerenja:

Slijepa proba Std 1 Std 2 Std 3 Std 4

135,67 181,23 179,67 194,08 199,73

Svako bitno odstupanje uočeno uspoređujući očitanja tijekom jednog ciklusa mjerenja,

bilo za standard ili slijepu probu, nije se koristilo za konačni izračun srednje vrijednosti.

22

Od podataka za srednje vrijednosti u pojedinim ciklusima mjerenja (min) konstruirana

je tablica s vrijednostima za pet otopina (Tablica 4) koja je korištena za grafički prikaz (Slika

9).

Tablica 4. Srednje vrijednosti mjerenja kroz cikluse

ciklus t/min Slijepa proba Std 1 Std 2 Std 3 Std 4

1 0 135,67 181,23 179,67 194,08 199,73

2 5 135,67 181,23 179,67 194,08 199,73

3 10 52,26 181,81 181,03 194,82 155,83

4 15 12,87 183,56 181,58 132,99 55,20

5 20 4,96 184,35 149,11 40,63 13,59

6 25 4,48 186,33 54,46 9,02 5,16

7 30 4,38 165,61 12,40 4,66 4,36

8 35 4,37 69,99 4,95 4,42 4,29

9 40 4,36 16,14 4,41 4,36 4,27

10 45 4,36 5,42 4,38 4,36 4,24

11 50 4,37 4,57 4,37 4,39 4,26

12 55 4,37 4,57 4,37 4,39 4,26

13 60 4,37 4,57 4,37 4,39 4,26

Iz tablice je konstruiran graf:

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40 50 60 70

Inte

nzite

t flu

ores

cenc

ije

Vrijeme / minute

blank

Std 1

Std 2

Std 3

Std 4

23

Slika 9. Pad intenziteta fluorescencije kroz vrijeme za pet otopina

Kako bi se sve dobivene vrijednosti intenziteta fluorescencije normalizirale na istu

vrijednost (Fi=100) korišten je program FL WINLAB. Primjer normaliziranih grafova za

fluoerescentne probe fluorescein i B-PE prkazan je na slikama 10 i 11.

Slika 10. Normalizirani graf ovisnosti fluorescencije o vremenu za fluorescein

24

Slika 11. Normalizirani graf ovisnosti fluorescencije o vremenu za B-PE probu

4.2. Izrada baždarnog dijagrama

U programu FL WINLAB izračunate su vrijednosti površina ispod normaliziranih

krivulja. Neto povrišine za pojedine otopine Troloxa dobivene su na način da se iznos

površine ispod krivulje slijepe probe oduzeo od iznosa površine ispod krivulje za otopinu

standarda (Troloxa). U tablici 5 prikazane su površine ispod krivulja (P), neto površine (P

(neto)) i množina Troloxa u uzorku za četiri standardne otopine.

Tablica 5. Podaci za baždarni dijagram

Otopina n(Trolox) / nmol P P (neto)

Std 1 1,5 3425,27 2295,83

Std 2 0,75 2403,22 1273,78

Std 3 0,375 1789,78 660,34

Std 4 0,1875 1394,84 265,399

U koordinatnom sustavu s x i y osi dodane su točke tako da im je x vrijednost množina

Troloxa (nmol), a y vrijednost razlika u površinama standarda i slijepe probe. Kroz te četiri

točke povučen je pravac (Slika 12).

Slika 12. Ovisnost neto površine ispod krivulje pada intenziteta fluorescencije o množini

Troloxa u uzorku

y = 1519,4x + 55,54 R² = 0,9938

0

500

1000

1500

2000

2500

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

P (n

eto)

n(Trolox) / nmol

25

Kako bi se za svaku fluorescentnu probu konstruirao baždarni dijagram s

pripadajućom jednadžbom pravca, korišten je program Grafit 6.0 (Slike 13- 15). Ovako

pripemljeni baždarni dijagrami koristit će se u daljnjim istraživanjima kako bi se iz istih

odredio antioksidacijski kapacitet ispitivanog uzorka. Svi dijagrami priređeni su koristeći

podatke prikupljene kroz tri nezavisna eksperimenta.

Slika 13. Jednadžba pravca za diklorofluorescein dobivena u programu Grafit 6.0

26

Slika 14. Jednadžba pravca za fluorescein dobivena u programu Grafit 6.0

27

Slika 15. Jednadžba pravca za B-PE dobivena u programu Grafit 6.0

28

5. RASPRAVA

5.1 B- PE

B-phycoeryrhrin (B-PE) je protein izoliran iz crvene alge Porphyridium cruentum. To

je crveni pigment iz proteinske obitelji fikobilina koji se nalaze u crvenim algama i

kriptofitima kao pomoćni pigmenti za fotosintezu. Sastoji se od proteinskog dijela koji je

kovalentno vezan na kromofor. ORAC test je prvotno osmišljen s B-PE kao fluorescentnom

probom iz nekoliko razloga: ima jasne emisijske i ekscitacijske maksimume, visoki

fluorescentni kvantni prinos, osjetljiv je na reaktivne vrste i topljiv je u vodi. Kasnije je

otkriveno da intenzitet fluorescencije i osjetljivosti na peroksil radikal varira između

pojedinačnih serija B-PE. Razlog tomu je to što komercijalni B-PE sadržava samo 30% čiste

supstance što je posljedica postupka izolacije iz alge. Postupak izolacije je skup pa 75%

troškova testa opada na probu, što nije slučaj s drugim sintetičkim probama. Problem s B-PE

probom je i to što pokazuje tzv. quenching učinak s polifenolima, odnosno veže se s

polifenolima nespecifičnom proteinskom interakcijom što uzrokuje gašenje fluorescencije.

Ova interakcija je uzrok lažno niskim rezultatima pri ispitivanju ORAC vrijednosti polifenola.

Također je uočeno da se intenzitet fluorescencije B-PE nakon izlaganja svijetlu smanjuje, a to

je poslijedica tzv. photobleaching učinka. B-PE je protein od više podjedinica koje su

organizirane u (αβ)6γ strukturu. Zbog kompleksne građe teško je pretpostaviti mehanizam

reakcije s reaktivnim vrstama, dok je za manje sintetičke molekule to moguće [9].

U ovom radu, rezultati dobiveni s B-PE kao fluorescentnom probom uvelike se

razlikuju od onih s fluoresceinom i diklorofluoresceinom. Tako krivulja pada intenziteta

fluorescencije nema sigmoidalni oblik kao kod druge dvije probe, a razlika između najmanjeg

standarda (otopina Troloxa koncentracije 6,25 µmolL-1) i slijepe probe manja je nego s druge

dvije boje (Slika 11). Ovo upućuje na manju osjetljivost B-PE u odnosu na fluorescein i

diklorfluorescein.

5.2 Fluorescein

Fluorescein je sintetička fluorescentna neproteinska molekula s visokim kvantnim

prinosom fluorescencije pri pH 7,0. Zato što je to mala organska molekula postupak dobivanja

29

je nekoliko puta jeftiniji od postupka izolacije B-PE iz alge. Fluorescein ne reagira s

molekulama poput polifenola i nije podložan photobleaching efektu. ORAC metoda koja

koristi fluorescein kao fluorescentnu probu ima jako veliku osjetljivost. Budući da je prije

izvođenja eksperimenta, uzorke potrebno višestruko razrijediti, mogu se ispitivati i jako kisele

tvari bez mijenjanja pH testnog uzorka. Produkti reakcije fluoresceina i peroksil radikala su

ispitani metodom tekuće kromatografije i masene spektrometrije, a reakcijski mehanizam je

određen kao vodik – transfer (HAT) [9]. Razjašnjavanje reakcijskog mehanizma je bitno za

procjenu valjanosti metode. HAT mehanizam je biološki najbitniji mehanizam gašenja

radikala, stoga je reakcijski mehanizam ORAC testa s fluoresceinom povoljan za usporedbu s

biološkom antioksidacijskom aktivnošću. Fluorescein je jedini od tri probe korištene u ovom

radu kojemu je ispitivanjem LC/MS određen reakcijski mehanizam [9].

Na slici 16. prikazan je raspad fluoresceina na tri fluorescentna produkta (FL1, FL2 i

FL3) i jedan nefluorescentni (FL4). Prvi korak oksidacije fluoresceina (FL) je oduzimanje

jednog atoma vodika fenolnoj skupini od strane peroksilnog radikala čime se formira stabilni

FLO ͘˙ radikal koji se može dimerizirati u fluorescentini FL1 produkt. Alternativno, FLO˙

može reagirati s CO2 prisutnim u puferu i formirati FL2 produkt. FL2 produkt reagira s

peroksil radikalom te se u nizu reakcija raspada na FL3 produkt. Svi ovi produkti

fluoresciraju. FL3 se raspada na nefluorescentini FL4 produkt nepoznate strukture [9].

30

Slika 16. Oksidacija fluoresceina s peroksil radikalom [9]

U ovom istraživanju fluorescein je davao najbolje rezultate. Reproducibilnost testa s

fluoresceinom je najveća od sve tri ispitivane probe.

5.3 2',7' - Diklorofluorescein

Diklorofluorescein je molekula slične građe kao i fluorescein sa supstituiranim

atomima klora na 2' i 7' mjestu. Diklorofluorescein (DCF) je fluorofor i može se oksidacijom

prevesti u nefluorescentni produkt. Dikorofuorescein diacetat je oblik diklorofluoresceina koji

prolazi staničnu membranu, nakon čega ga stančni enzimi pretvaraju u diklorofluorescein [3].

Koristi se u istraživanjima antioksidacijskih mehanizama u stanici (in vivo). U ovom

istraživanju korišten je diklorodihidrofluorescein (DCFH) koji je nefluorescentan, ali

oksidacijom prelazi u fluorescentni diklorofluoresecin (DCF). Ova reakcija se događala

spontano pri otapanju DCFH u fosfatnom puferu. U reakciji s peroksil radikalom u ORAC

testu fluorescentni DCF prelazi u neflourescentni produkt. Mehanizam te reakcije nije do

kraja jasan, no pretpostavka je da prelazi u DCF·- kao što je prikazano na slici 17. DCF·- nema

konjugirane dvostruke veze u svim aromatskim prstenima kao DCF te zato i ne fluorescira.

Slika 17. Oksidacija diklorofluoresceina [3]

31

U ovom istraživanju diklorofluorescein je pokazivao različite početne intenzitete

fluorescencije u pojedinačnim mjerenjima, unatoč oprezu pri pripravljanu osnovne otopine i

razrijeđenih otopina probe. Sama otopina diklorofluoresceina je pokazivala rast intenziteta

fluorescencije prije dodavanja AAPH i početka testa. Reproducibilnost testa je na ovaj način

umanjena zbog konačne razlike u neto površinama ispod krivulja intenziteta fluorescencije.

Dodatni problem korištenja ove probe u ORAC metodi jest i nepoznavanje točnog mehanizma

oksidacije fluorescentne probe.

5.6 Zaključak

Od tri ispitivane probe u ovom radu, fluorescein je pokazao najbolje rezultate.

Prednosti fluoresceina nad probom B-PE su: cijena, osjetljivost, mogućnost prilagodbe na

lipofilne uzorke i poznavanje mehanizma reakcije s peroksil radikalom. Fluorescein s peroksil

radikalom reagira HAT mehanizmom, biološki najbitnijim mehanizmom gašenja radikala,

stoga je reakcijski mehanizam ORAC testa s fluoresceinom povoljan za usporedbu s

antioksidacijskom aktivnošću u stanicama. B-PE proba je podložna photobleaching učinku i

reagira s polifenolima što uzrokuje lažno niske rezultate u ORAC testu. Diklorofluorescein je

imao slične rezultate kao fluorescein, no zbog nepoznavanja mehanizma reakcije s peroksil

radikalom u testu te zbog različitih početnih vrijednosti intenziteta fluorescencije može se

zaključiti da nije podjednako primjeren kao fluorescein.

ORAC metoda mjeri sposobnost antioksidacijskog djelovanja protiv peroksilnog

radikala, stoga je ORAC vrijednost specifična mjera antioksidacijskog djelovanja te ne

predstavlja ukupni antioksidacijski kapacitet. Test se izvodi in vitro, prema tome

antioksidacijski učinak koji se mjeri različit je od stvarnog učinka u stanicama. Prednosti

ORAC metode su automatiziranost, mogućnost prilagodbe na lipofilne uzorke i uzorke krvne

plazme, poznavanje mehanizma kemijske reakcije (vrijedi samo za fluorescein) te mogućnost

adaptacije na druge izvore radikala.

32

6. LITERATURA

[1] R. L. Prior, X. Wu, and K. Schaich, “Standardized methods for the determination of

antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements,” J. Agric. Food

Chem., vol. 53, no. 10, pp. 4290–4302, 2005.

[2] R. L. Prior, “The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays,” J. Agric. Food

Chem., vol. 53, pp. 1841-1856, 2005.

[3] A. Gomes, E. Fernandes, and L. F. C. Lima, “Fluorescence probes used for detection of

reactive oxygen species,” J. Biochem. Biophys. Methods, vol. 65, pp. 45–80, 2005.

[4] B. P. Held, “An Introduction to Reactive Oxygen Species Measurement of ROS in

Cells,” 2015. [Online]. Dostupno na: http://www.biotek.com/resources/articles

/reactive-oxygen-species.html. (pristupljeno: 15.12.2015.)

[5] N. Mimica-Dukić, N. Simin, E. Svirčev, D. Orčić, I. Beara, M. Lesjak, and B. Božin,

“The Effect of Plant Secondary Metabolites on Lipid Peroxidation and Eicosanoid

Pathway,”, 2012. [Online]. Dostupno na: http://www.intechopen.com/books/lipid-

peroxidation/the-effect-of-plant-secondary-metabolites-on-lipid-peroxidation-and-

eicosanoid-pathway pristupljeno: 15.12.2015.)

[6] J. R. Lakowicz, "Introduction to Fluorescence" in Principles of Fluorescence

Spectroscopy, third. ed. Baltimore, University of Maryland School of Medicine, 2006.,

ch. 1, pp. 1-26

[7] R. L. Prior, H. Hoang, L. Gu, X. Wu, M. Bacchiocca, M. Hampsch-woodill, D. Huang,

B. Ou, and R. Jacob, “Assays for Hydrophilic and Lipophilic Antioxidant Capacity

(oxygen radical absorbance capacity (ORAC)) of Plasma and Other Biological and

Food Samples” J. Agric. Food Chem., vol. 51, pp. 3273-3279, 2003.

[8] R. L. Prior, “Antioxidant Food Databases? Valuable or Not?,” 2013. [Online].

Dostupno na: http://cdn2.hubspot.net/hub/153979/file-17993920-pdf/docs/a_response

_to_the_usda_orac_statement.pdf. (pristupljeno: 15.12.2015.)

[9] B. Ou, M. Hampsch-Woodill, and R. L. Prior, “Development and validation of an

improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent

33

probe,” J. Agric. Food Chem., vol. 49, no. 10, pp. 4619–4626, 2001.

[10] Trolox - Wikipedia, the free encyclopedia, https://en.wikipedia.org/wiki/Trolox,

(pristupljeno: 15.12.2015.)

[11] 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride - Wikipedia, the free encyclopedia,

https://en.wikipedia.org/wiki/2,2%27-Azobis(2-amidinopropane)_dihydrochloride

(pristupljeno: 15.12.2015.)

METODIČKI DIO

Mentor: mr. Sc. Roko Vladušić

2

Detaljna priprema za nastavni sat

Ime i prezime studenta: Blanka Roje

Nastavna tema Građa atoma

Nastavna jedinica Boja tvari

Cilj sata Upoznavanje s načinima na koje tvari poprimaju boju koju vidimo

Pogrešna razumijevanja pronađena u znanstvenoj literaturi • Toplinska energija ne može postati svjetlosna energija • Boje postoje neovisno o svijetlu

• Jedino sjajni objekti reflektiraju svjetlost • Tvar ne može reflektirati i apsorbirati svjetlost u isto vrijeme • Boja neke tvari je posljedica jedino svojstava te tvari

Jezični termini koje su učenici trebali ranije usvojiti Elektromagnetsko zračenje, kontinuirani spektar, linijski spektar, energetske razine ili ljuske, pobuđeni elektron Jezični termini koje treba usvojiti tijekom ove nastavne jedinice Apsorpcija, refleksija i emisija svjetlosti, inkandescencija, fluorescencija, fosforescencija

Ograničenja – poteškoće s kojima se prilikom poučavanja možemo susresti Očekujem poteškoće s razumijevanjem što je spektar i što su valne duljine svjetlosti, no to je

obrađeno u prethodnoj lekciji. U ovoj lekciji bi se mogla susresti s nerazumijevanjem prikaza energetskih stanja u kojima se nalazi elektron.

Udžbenik Za pripremu predavanja koristila sam se raznim izvorima zato što u udžbeniku ne postoji nastavna jedinica koja obrađuje ovu temu. Koristila sam se udžbenikom kako bih procijenila gdje bih mogla

uklopiti ovu nastavnu jedinicu te koje predznanje bi učenici trebali imati. Pronašla sam u udžbeniku za prvi razred gimnazije lekciju „Spektri i građa elektronskog omotača“. U toj lekciji obrađuje se priroda svijetla kao elektromagnetskog zračenja. Učenici nauče da vidljiva svjetlost ima kontinuirani

spektar sastavljen od svih duginih boja, a elementi u plinovitom stanju imaju linijski spektar. Procijenila sam da bi se ova lekcija dobro uklopila nakon nje jer proširuje znanje o vrstama emisija svjetlosti i nadograđuje znanje o linijskim spektrima.

Temeljni koncepti (temeljne ideje) Boja tvari ovisi o fizikalnim i kemijskim osobinama tvari, prirodi svijetla koje ju osvjetljava te o oku i

mozgu koji je percipiraju. Tvari poprimaju one boje koje se reflektiraju i one koje se emitiraju s njihove površine. Kada svjetlost stigne na površinu neke tvari može se reflektirati, odnosno odbiti se o površinu i nastaviti putovati dalje. Svjetlost se može i apsorbirati, a primljena energija će zagrijati

3

predmet. Primljena svjetlosna energija osim zagrijavanja tvari može uzrokovati da elektron prijeđe na višu energetsku razinu. Povratak elektrona na nižu energetsku razinu može se dogoditi uz emisiju,

odnosno otpuštanje svjetlosti. To može biti u obliku fluorescencije (odvija se istovremeno kad i osvjetljenje predmeta) ili fosforescencije (odvija se i nakon završetka osvjetljivanja predmeta). Tvar koja se zagrijava može emitirati svjetlost. Ovaj fenomen se naziva inkandescencija. Prema bojama

plamena pri gorenju soli možemo zaključiti koji se metal nalazi u soli. Tvari mogu emitirati svjetlost zbog oslobađanja energije tijekom kemijske reakcije. Ako je kemijska energija uzrok emisije svijetla, pojava se naziva kemiluminiscencija. Ishodi učenja

1. Učenici će moći objasniti vlastitu percepciju boja uz pomoć usvojenog znanja o prirodi svijetlosti

2. Učenici će moći objasniti vlastitu percepciju boje tvari uz pomoć usvojenog znanja o

interakciji svjetlosti s atomom 3. Učenici će moći opisati i razlikovati pojave refleksije, apsorpcije i emisije svjetlosti,

fluorescencije, fosforescencije, inkandescencije i kemiluminiscencije

Zadatak/ pitanje za provjeru ishoda učenja

1. Opiši svojim riječima što je to emisijski linijski spektar. 2. Kako znanstvenici mogu otkriti koji se kemijski elementi nalaze na nekom udaljenom planetu

ili zvijezdi? 3. Natrijeve lampe u uličnoj rasvjeti isijavaju svjetlost žute boje. Označi natrijev linijski spektar

od ponuđenih linijskih spektara. Označi neonov linijski spektar ako znaš da neon emitira

najintenzivniju svjetlost od ponuđenih elemenata.

4. Zašto će se na suncu crni predmet ugrijati prije nego bijeli?

5. Prikazani su linijski spektri pojedinačnih elemenata i smjese elemenata. Koji su elementi prisutni u smjesi?

4

6. Električna žarulja radi na principu zagrijavanja tanke volframove niti. Opiši što se događa na

atomskoj razini i kako se ovaj efekt naziva. 7. Molekula koja uzrokuje zelenu boju listova naziva se klorofil. Nabroji koje boje iz vidljivog

spektra reflektira, a koje apsorbira ta molekula? Što biljka čini s energijom apsorbiranom na

ovaj način? 8. Objasni razliku između inkandescencije, fluorescencije i fosforescencije!

Poveznica submikroskopskog i makroskopskog „svijeta“ Koristit ću se crtežom na ploči kako bih prikazala na submikroskopskoj razini interakciju svjetlosti s atomom. Kao poveznicu s makroskopskim svijetom učenici će izvest pokus s gorenjem soli nekih metala (makroskopski prikaz inkandescencije). Za makroskopski prikaz fluorescencije koristit ću se

otopinom fluoresceina, dok ću za fosforescenciju koristiti video.

Artikulacija (pregledni nacrt nastavnog sata) STRUKTURNI ELEMENT NASTAVNOG SATA

AKTIVNOSTI UČENIKA SOCIOLOŠKI OBLIK RADA

TRAJANJE

Uvod Slušanje, odgovaranje, povezivanje, zaključivanje Frontalni, individualni

5 min

Obrada Slušanje, memoriranje, povezivanje, zaključivanje,

crtanje

Frontalni,

individualni

20 min

Eksperiment Čitanje, izvođenje eksperimenta, povezivanje, zaključivanje, rješavanje problema, primjenjivanje

Grupni 20 min

Razrada sata po izvorima znanja i ključnim pojmovima Izvori znanja Izvor znanja Detaljan opis što se želi postići svakim od navedenih izvora znanja

Crtež na ploči Prikaz pobuđivanja Na crtežu ću prikazati pobuđivanje elektrona i povratak u

5

elektrona kod inkandescencije,

fluorescencije, fosforescencije i kemiluminiscencije

osnovno stanje. Rezultat je emisija svjetla. Na slici će biti jasno označeni uzroci pobuđivanja elektrona: zagrijavanje

(inkandescencija), apsorpcija svjetlosti (fluorescencija, fosforescencija) i kemijska energija (kemiluminiscencija).

kemikalija Otopina

fluoresceina

Prikazat ću ovu fluorescentnu otopinu te ih navesti na

razmišljanje odakle energija za emisiju svjetlosti.

video Fosforescencija

Dijamanta

Cilj mi je prikazati razliku između fluorescencije i fosforescencije. Na videu će biti jasno prikazana emisija svjetlosti i nakon

prestanka osvjetljivanja te ćemo raspraviti što je izvor energije za takvu emisiju svjetlosti.

Ključni pojmovi

KLJUČNI POJAM Detaljan opis kako će se učenici dovesti do razumijevanja ključnog pojma (u opisu navesti nastavne metode, spoznajne postupke, oblike rada, slike, dijagrame, animaciju…)

Inkandescencija Inkandescenciju ću objasniti metodom izlaganja te metodom crtanja na ploči. U

izlaganju ću navesti da je to emisija svijetla koje se događa kao posljedica zagrijavanja predmeta. Prelazak elektrona u više energetsko stanje i povratak u osnovno stanje ću prikazati crtežom na ploči. Kao primjer ću navesti volframovu

žarulju i soli metala koje ću zagrijavati na plameniku.

fluorescencija Fluorescenciju ću objasniti metodom izlaganja te metodom crtanja na ploči. U izlaganju ću navesti da je to emisija svijetla koja se događa kao posljedica

apsorpcije svijetla. Crtežom na ploči ću nacrtati prelazak elektrona u više energetsko stanje i povratak u osnovno stanje. Kao primjer pokazat ću im otopinu fluoresceina.

fosforescencija Fosforescenciju ću objasniti metodom izlaganja te metodom crtanja na ploči. U

izlaganju ću navesti da je to emisija svijetla koja se događa kao posljedica apsorpcije svijetla, ali emisija je odgođena te tvar može svijetliti i nakon što se makne izvor svijetla. Kao primjer prikazat ću na slideu sliku fosforescentnih

naljepnica s kojima su se do sada vjerojatno susretali.

kemiluminiscencija Kemiluminiscenciju ću objasniti metodom izlaganja te metodom crtanja na ploči. U izlaganju ću navesti da je to emisija svijetla koja se događa kao posljedica oslobađanja kemijske energije. Kao primjer pokazat ću im svjetleće

štapiće.

Tijek nastavnog sata Predstavit ću se učenicima i zamoliti ih za suradnju na satu.

6

Započet ću lekciju s pitanjima iz gradiva prošle lekcije. Što je svjetlost? Svjetlost je elektromagnetsko zračenje koje je vidljivo ljudskom oku. Koje valne duljine ima vidljiva svjetlost? Od otprilike 390 nm do

750 nm. Kako se razlikuju svjetlosti različitih boja? Različite boje imaju različite valne duljine. Što daje boju nekom predmetu? To što se svjetlost određenih valnih duljina reflektira (odbija) o njegovu površinu, dok se ostala svjetlost apsorbira. Koju boju mi vidimo? Onu koja se reflektira, primjerice

crvena bilježnica ima površinu koja reflektira crvenu boju, a apsorbira plavu, zelenu i žutu boju. Postoje li boje bez svjetlosti? Ako ugasimo svjetlo hoće li bilježnica i dalje biti crvena? Neće zato što boja nastaje kad svjetlost pada na površinu nekog predmeta, reflektira se te putuje do našeg oka

nakon čega je mi percipiramo.

Većina predmeta je određene boje zbog refleksije svjetlosti određenih valnih duljina. No, osim reflektiranja svjetlosti, tvari mogu i emitirati svjetlost. Za to se prvo mora dogoditi pobuđivanje elektrona. Nacrtat ću na ploči pobuđivanje elektrona i prelazak u višu energetsku razinu. Pri povratku

elektrona u osnovnu energetsku razinu atom emitira svjetlost određenih valnih duljina. Što može uzrokovati pobuđivanje elektrona? Primjerice, što uzrokuje pobuđivanje elektrona u volframovoj niti u žarulji? Odgovor je zagrijavanje niti na visoku temperaturu. Ova pojava se naziva inkandescencija ili

emisija svjetlosti zbog zagrijavanja. Zatim ću pokazati otopinu fluoresceina. Upitat ću ih kako bi opisali boju ove otopine? Nakon što dobijem odgovor da je fluorescentna, upitat ću ih je li boja ove otopine posljedica samo refleksije svjetlosti ili otopina emitira svjetlost. Nakon što ustvrdimo da

otopina emitira svjetlost, upitat ću ih kako je to moguće pošto otopinu nismo zagrijavali, odnosno što uzrokuje pobuđivanje elektrona kod fluorescencije? Odgovor je svjetlost. Dakle, fluorescencija je emisija svjetlosti bez zagrijavanja. Nacrtat ću na ploči shemu pobuđivanja elektrona kod

fluorescencije. Sljedeće ću pokazati kratak video s fosforescentnim mineralom. Pitat ću nekoga da mi opiše emisiju svjetla tvari u videu. Tvar emitira svjetlost i nakon prestanka osvjetljivanja te nakon nekog vremena prestane. Ova pojava se naziva fosforescencija. Što je pobudilo te elektrone? Kao i

kod fluorescencije pobudilo ih je svjetlost, no kod fosforescencije elektroni ostaju dulje vrijeme pobuđeni pa i emisija svijetla traje dulje. Nacrtat ću shemu na ploču. Fosforescentni premaz se stavlja

na naljepnice i na kazaljke ručnih satova (slika na prezentaciji). Sljedeće što ću pokazati je svjetleći štapić. Upitat ću ih kako bi opisali tvar u štapiću? Prema do sada spomenutim emisijama svjetlosti, to bi mogla biti fluorescentna otopina. No, zapravo ovdje se radi o kemiluminiscenciji. To je emisija

svjetla koju uzrokuje kemijska reakcija. Nacrtat ću shemu pobuđivanja elektrona kod kemiluminiscencije na ploču. Nakon nekog vremena svjetleći štapići će prestati svijetliti jer će svi reaktanti prijeći u produkte, te neće biti više kemijske energije koja pobuđuje elektrone. Ovako

svijetle i neke morske životinje (slika na prezentaciji).

Slijedi pokus. Podijelit ću im radne listove i tri nepoznate soli označene brojevima. Zadatak je identificirati soli prema boji plamena. Na prezentaciji će biti prikazani emisijski linijski spektri i slike plamena tih triju soli prema kojima će ih morati identificirati. Ja ću ih pustiti da se sami snalaze te ću

pomagati ako bude nekih nejasnoća. Na kraju eksperimenta ćemo pročitati rješenja zadataka i ponoviti sve što su zaključili pomoću eksperimenta.

Ako ostane vremena ponovit ću lekciju. Zadat ću im domaći rad.

7

Plan učeničkog zapisa

Emocionalna procjena Očekujem od učenika suradnju i zainteresiranost. Bit će uzbuđeni radi izvođenja pokusa. Ja ću ih nastojati kontrolirati tako da budu koncentrirani na rad. Očekujem komešanje zbog izvođenja pokusa. Nadam se da će u uzbuđenju prevladati kvalitetan rad nad dovikivanjem i šalama.

Domaći uradak

Zadatci za domaći rad (na kraju radnog lista) Što se zadatkom želi postići?

1 Opiši svojim riječima što je to linijski spektar. Ponavljanje naučenog o linijskim spektrima.

2 Prikazani su linijski spektri pojedinačnih

elemenata i smjese elemenata. Koji su

elementi prisutni u smjesi?

Primjena naučenog o linijskim spektrima.

8

3 Natrijeve lampe u uličnoj rasvjeti isijavaju

svjetlost žute boje. Označi natrijev linijski

spektar od ponuđenih linijskih spektara.

Označi neonov linijski spektar ako znaš da

neon emitira najintenzivniju svjetlost od

ponuđenih elemenata.

Primjena naučenog o linijskim spektrima.

Literatura

Habuš S., Tomašić V., Opća kemija 1, udžbenik za prvi razred gimnazije, PROFIL, Zagreb, 1996.

http://wikieducator.org/Chemistry/Light_Spectra (Pristupljeno: 15.12.2015.)

http://scifun.chem.wisc.edu/homeexpts/chemilum.html (Pristupljeno: 15.12.2015.)

https://en.wikipedia.org/wiki/Color (Pristupljeno: 15.12.2015.)

Prilozi Radni list

9

OTKRIVANJE SASTAVA SOLI POMOĆU BOJE PLAMENA

Pribor Kemikalije

3 satna stakalca

laboratorijska čaša

platinska igla

Natrijev klorid (NaCl(s)) Stroncijev klorid (SrCl2(s))

Baktrov (II) sulfat (CuSo4(s))

Koncentrirana klorovodična kiselina (HCl (konc.))

Mjere opreza: opasnost od od opeklina

Na satnim stakalcima nalaze se tri soli označene brojevima. Tvoj zadatak je otkriti o kojim se solima

radi.

Prvo uroni platinsku iglu u čašu s kiselinom te zažari iglu u plamenu. Ponavljaj postupak dok se

plamen vise ne boja. To je postupak čišćenja igle.

Uroni iglu u uzorak soli pa je unesi u plamen. Ponovi postupak nekoliko puta za svaki uzorak soli, a

između ponavljanja očisti iglu na prethodno opisan način. Zabilježi opažanja.

Sol broj 1 Sol broj 2 Sol broj 3

Prema emisijskim linijskim spektrima i bojama plamena metala prikazanim na prezentaciji pretpostavi o kojim solima se radi.

Sol broj 1 Sol broj 2 Sol broj 3

Ime i prezime:

Datum:

10

Odgovori na pitanja:

Što je pobudilo elektrone u ovom eksperimentu?________________________.

Kako se naziva ovakva emisija svjetlosti?______________________________.

Dodatni zadatci:

1. Opiši svojim riječima što je to emisijski linijski spektar. ______________________________________________________________________

2. Natrijeve lampe u uličnoj rasvjeti isijavaju svjetlost žute boje. Označi natrijev linijski spektar od ponuđenih linijskih spektara. Označi neonov linijski spektar ako znaš da neon emitira najintenzivniju svjetlost od ponuđenih elemenata.

3. Prikazani su linijski spektri pojedinačnih elemenata i smjese elemenata. Koji su elementi prisutni u smjesi?

11

USPOREDBA FLUORESCENTNIH PROBI U ORAC METODI · 2015-12-22 · fluorescent probe, and a standard or a sample for which the antioxidant capacity needs to be determined. During the

Documents