Page 1
Universitas Pakuan, Bogor
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN IDENTIFIKASI SENYAWA KIMIA
HASIL BIOPRODUKSI ISOLAT KAPANG ENDOFIT K.Cl.Sb.A.12 DARI
AKAR TANAMAN KUNYIT (Curcuma Longa L.) ASAL SUKABUMI
Syah Zena Amilia Putri 1), Drs. Husain Nashrianto 1) dan Bustanussalam 2)
Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Pakuan Bogor
ABSTRAK
Antioksidan berfungsi mengatasi atau menetralisir radikal bebas dengan
menghambat atau mencegah terjadinya kerusakan tubuh. Kunyit (Curcuma longa L)
merupakan salah satu tanaman obat yang dapat digunakan sebagai antioksidan.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antioksidan dan mengidentifikasi
senyawa kimia hasil bioproduksi isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari akar tanaman
kunyit (Curcuma longa L.) dengan cara fermentasi kedalam media Potato Sucrose
Broth (PSB) dan Potato Dextrose Broth (PDB). Hasil dari fermentasi diperoleh
biomassa dan filtrat kemudian masing-masing diekstrak dengan etil asetat diuji aktivitas
antioksidannya menggunakan metode peredaman radikal bebas (DPPH) dianalisis
dengan (KLT) kemudian dimurnikan dengan Kromatografi Kolom. Senyawa murni
diidentifikasi struktur kimianya menggunakan spektrofotometri UV-VIS,
Spektrofotometri Inframerah, dan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM).
Hasil penelitian menunjukkan uji aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 dari
ekstrak etil asetat filtrat PDB sebesar 70,0 bpj merupakan ekstrak yang paling aktif
sebagai antioksidan. Hasil kromatografi kolom menunjukkan fraksi II memiliki aktivitas
antioksidan tertinggi nilai % hambat sebesar 31,22 %, kemudian dimurnikan dengan
metode KLT preparatif hasil analisis Pita 1 dari KLT preparatif berbentuk kristal
berwarna putih dengan berat 7,6 mg dapat diperkirakan bahwa isolat X yang terkandung
dalam fraksi II pita 1 adalah 1,3-Benzenediol,5-methyl.
Kata kunci : Isolat K.Cl.Sb.A.12, Potato Sucrose Broth (PSB), Potato Dextrose Broth
(PDB), Antioksidan, DPPH
Page 2
Universitas Pakuan, Bogor
PENDAHULUAN
Reaksi oksidasi terjadi setiap saat,
Ketika kita bernafas pun terjadi reaksi
oksidasi. Reaksi ini membentuk radikal
bebas yang sangat aktif, yang dapat merusak
struktur serta fungsi sel. Namun, reaktivitas
radikal bebas itu dapat dihambat oleh sistem
antioksidan yang melengkapi sistem
kekebalan tubuh (Winarsi, 2007).
Kunyit (Curcuma longa L) merupakan
salah satu tanaman obat yang dapat digunakan
sebagai antioksidan. Kunyit yang tergolong
dalam kelompok jahe-jahean (Zingiberaceae)
telah lama digunakan oleh masyarakat
Indonesia, terutama sebagai bumbu masak dan
jamu (Said, 2007).
Tumbuhan bersimbiosis dengan
mikroorganisme untuk membantu dalam
proses metabolisme dan menghasilkan
senyawa metabolit sekunder berupa senyawa
bioaktif (Simanjuntak dkk, 2002) .
Mikroba endofit adalah kelompok
mikroba yang hidup dalam jaringan tanaman
dimana tipe interaksi antara mikroba endofit
dengan tanaman inangnya, merupakan
hubungan yang saling menguntungkan
(simbiosis mutualisme) (Simanjuntak dkk,
2002) .
Telah dilakukan penelitian sebelumnya
untuk isolasi dan pemurnian kapang endofit
yang terkait dengan tanaman kunyit
(Curcuma longa L.) dari Sukabumi dan
Cibinong diperoleh 44 kapang endofit. Ada
Enam kapang yang menunjukkan aktivitas
antioksidan lebih dari 65% yaitu, K.Cl.Sb.R9
(93,58%), K.Cl.Sb.A11 (81,49%),
K.Cl.Sb.B1 (78,81%), K.Cl.Sb.R11 (71,67
%) dan K.Cl.Sb.A12 (67,76%) dari
Sukabumi dan K.Cl.Cb.U1 (69,27%) dari
Cibinong (Bustanussalam dkk, 2015).
Dalam penelitian ini, dilakukan
bioproduksi senyawa kimia isolat kapang
endofit K.Cl.Sb.A.12 yang berasal dari
bagian akar tanaman kunyit (Curcuma longa
L.) dengan cara fermentasi kedalam media
Potato Sucrose Broth (PSB) dan Potato
Dextrose Broth (PDB).
Mikroba endofit yang berasal dari
bagian akar tanaman kunyit (Curcuma longa
L.) isolat K.Cl.Sb.A.12 yang difermentasikan
dapat menghasilkan senyawa kimia yang
berkhasiat sebagai antioksidan dan dapat
ditentukan struktur kimianya.
BAHAN DAN ALAT
Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari
bagian akar tanaman kunyit (Curcuma longa
L.) yang berasal dari daerah Sukabumi.
Potato Dextrose Agar (PDA), Potato
Dextrose Broth (PDB), Potato Sucrose Broth
(PSB), alkohol 70%, etil asetat, metanol,
kloroform, metanol proanalisis, air suling
(aquades), n-heksan, silika gel 60, celite 545,
serium sulfat dan DPPH (1,1-difenil-2-
pikrilhidrazil).
Alat-alat gelas (beaker gelas, labu
erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, vial,
cawan petri, pipet tetes, pipet skala, corong
pisah), laminar Air Flow (LAF) (H.S 079S),
Page 3
Universitas Pakuan, Bogor
lampu spirtus, kapas, pinset, jarum Ose,
mikropipet, autoklaf, oven, kertas saring,
indikator PH universal, corong buncher,
bejana kromatografi (chamber), timbangan
analitik, penangas air, pengaduk magnetik,
rotary shaker (BIG Bill), pipa kapiler,
sonikator (Branson 1550), rotavapor (Janke
& Kunkel RV-05-ST), lempeng silika gel
GF254, Kolom kromatografi
Spektrofotometer UV-Vis, Spektrofotometer
Fourier Transfrom Infra Red (FTIR),
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-
SM).
METODE PENELITIAN
Penelitian ini bertujuan untuk menguji
aktivitas antioksidan dan mengidentifikasi
senyawa kimia hasil bioproduksi isolat
kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari akar
tanaman kunyit (Curcuma longa L.) asal
Sukabumi yang difermentasikan pada media
Potato Sucrose Broth (PSB) dan Potato
Dextrose Broth (PDB) dengan menggunakan
metode peredaman radikal bebas (Yan and
Chan, 1995) .
1. Kurva Pertumbuhan
1.1 Inokulasi Isolat Kapang Endofit
a) Media Potato Dextrose Agar (PDA)
Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari
bagian akar tanaman kunyit (Curcuma longa
L.) diinokulasikan pada media PDA di dalam
cawan Petri kemudian diinkubasi selama 5-7
hari pada suhu ruang ( 25 ).
b) Media fermentasi Potato Dextrose
Broth (PDB)
Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12
yang telah tumbuh di cawan Petri (working
culture), difermentasikan dengan cara dicetak
dengan sedotan yang steril kemudian diambil
dengan jarum Ose dan dinokulasikan ke
dalam 11 labu Erlenmeyer yang masing
masing berisi 80 mL media cair PDB.
Kemudian diinkubasi pada rotary shaker
dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 20-
25 selama 22 hari.
1.2 Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Setiap dua hari dilakukan pengambilan
sampel dengan cara diambil 1 buah
Erlenmeyer, biomassa hasil fermentasi
dipisahkan dari filtratnya dengan cara
disaring menggunakan kertas saring dan
filtratnya di cek pH dengan menggunakan pH
universal. Kemudian dikeringkan dengan
oven pada suhu 50-60 sampai kering,
Biomassa kering yang didapat kemudian
ditimbang dan bobot yang diperoleh
merupakan data untuk pembuatan kurva
pertumbuhan kapang endofit.
2. Bioproduksi Laboratorium
2.1 Inokulasi Isolat Kapang Endofit
a. Media Potato Dextrose Agar (PDA)
Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dari
bagian akar tanaman kunyit (Curcuma longa
L.) diinokulasikan pada media PDA didalam
cawan Petri kemudian diinkubasi selama 5-7
hari pada suhu ruang ( 25 ).
b. Media fermentasi Potato Dextrose
Broth (PDB) dan Potato Sucrose Broth
(PSB)
Page 4
Universitas Pakuan, Bogor
Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12
yang telah tumbuh di cawan Petri (working
culture), difermentasikan dengan cara dicetak
dengan sedotan yang steril kemudian diambil
dengan jarum Ose dan dinokulasikan ke
dalam 2 labu Erlenmeyer yang masing
masing berisi 500 mL media cair PDB dan 2
labu Erlenmeyer masing masing berisi 500
mL media cair PSB. Kemudian diinkubasi
pada rotary shaker dengan kecepatan 120
rpm pada suhu 20-25 selama 12 hari.
2.2 Ekstraksi hasil fermentasi
Hasil fermentasi dari masing-masing
Erlenmeyer lalu dipisahkan antara filtrat dan
biomassa dengan cara disaring menggunakan
kertas saring dan corong buncher. Filtrat dari
empat Erlenmeyer diekstraksi sebanyak lima
kali dengan 100 mL etil asetat menggunakan
corong pisah, lalu didiamkan hingga terjadi
pemisahan antara fase etil asetat dan air. Fase
etil asetat dikumpulkan. Untuk biomassa
yang terdapat pada kertas saring dikeringkan
dalam oven bersuhu 50-60 hingga kering,
kemudian biomassa yang kering dipotong
kecil dan diekstraksi dengan cara maserasi
menggunakkan 50 mL etil asetat 3x24 jam
fase etil asetat dikumpulkan. Hasil ekstrak
dari filtrat dan biomassa dari masing-masing
fase diuapkan hingga didapat ekstrak kental
filtrat etil asetat PDB, ekstrak kental
biomassa etil asetat PDB, ekstrak kental
filtrat etil asetat PSB, ekstrak kental
biomassa etil asetat PSB.
2.3 Pengujian Aktivitas Antioksidan
antara Ekstrak Filtrat dan Biomassa
Aktivitas Antioksidan ditentukan
dengan metode peredaman radikal bebas
menggunakan DPPH. Nilai persen hambatan
pada filtrat dan biomassa ditentukan (Yan
and Chan, 1995).
2.3.1 Pembuatan larutan 0,4 mM DPPH
Sebanyak 7,9 mg DPPH (BM =
394,32) ditimbang dan dilarutkan dalam 50
mL metanol proanalisis, dihomogenkan,
kemudian ditempatkan dalam botol berwarna
gelap.
2.4.2 Pembuatan larutan blanko
Sejumlah 0,6 mL DPPH 0,4 mM
dimasukkan kedalam tabung reaksi skala,
lalu ditambahkan metanol proanalisis hingga
tanda batas (3 mL) kemudian dihomogenkan.
2.4.3 Pembuatan larutan uji
Sejumlah 2,5 mg ekstrak dari bagian
filtrat dan biomassa ditimbang menggunakan
timbangan analitik, kemudian dilarutkan
dengan metanol proanalisis sampai 5 mL
(500 bpj). Larutan ini merupakan larutan
induk. Kemudian pipet 30 L, 60 L, 150
L, 300 L dan 600 L larutan induk
tersebut kedalam tabung reaksi yang telah
ditera 3 mL untuk mendapatkan konsentrasi
sampel 5 bpj, 10 bpj, 25 bpj, 50 bpj dan 100
bpj. Pembuatan larutan uji dilakukan
sebanyak dua kali (duplo).
2.4.4 Pembuatan larutan kontrol positif
Sejumlah 2,5 mg Vitamin C ditimbang,
lalu dilarutkan dengan metanol proanalisis
Page 5
Universitas Pakuan, Bogor
sampai 5 mL (500 bpj). Larutan ini
merupakan larutan induk. Kemudian dipipet
18 L, 36 L, 54 L, 72 L dan 90 L
larutan induk tersebut kedalam tabung reaksi
yang telah ditera 3 mL untuk mendapatkan
konsentrasi sampel 3 bpj, 6 bpj, 9 bpj, 12 bpj
dan 15 bpj. Pembuatan larutan kontrol positif
dilakukan sebanyak dua kali (duplo).
2.4.5 Uji aktivitas antioksidan
Larutan uji dimasukkan ke dalam
masing-masing tabung reaksi. Lalu
ditambahkan 0,6 mL larutan DPPH 0,4 mM
kemudian ditambah metanol proanalisis
hingga 3 mL, kemudian dihomongenkan.
Larutan blangko, larutan uji, dan
larutan kontrol positif segera diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 37 , kemudian
serapan dibaca pada panjang gelombang 517
nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
2.4.6 Analisis data uji aktivitas
antioksidan
Pada setiap ekstrak filtrat dan biomassa
dilakukan analisis uji aktivitas antioksidan
dengan cara serapan blanko, kontrol positif,
dan larutan uji yang telah diukur pada
Spektrofotometer UV-Vis dicatat kemudian
dicari persen hambatan aktivitas radikal
bebas dengan cara memasukkan hasil serapan
masing-masing sampel pada rumus sebagai
berikut :Hambatan radikal bebas
=
x 100%
Setelah itu, tentukan nilai IC50 dari
setiap ekstrak filtrat dan biomassa dengan
mencari persamaan garis dimana konsentrasi
sebagai sumbu x, dan persen hambat sebagai
sumbu y. Ditentukan ekstrak mana yang
memiliki aktivitas antioksidan tertinggi,
kemudian dilanjutkan pada tahap fraksinansi.
3. Fraksinasi dengan Metode
kromatografi Kolom
Fase etil asetat dari ekstrak yang
terpilih difraksinansi dengan kromatografi
kolom menggunakan fase gerak yang paling
cocok (sesuai hasil dari KLT), fase diam
yang digunakan adalah silika gel 60. Fase
gerak yang digunakan menggunakan sistem
gradien, yaitu kloroform-metanol dengan
perbandingan (15:1), (10:1), (8:1), (6:1),
(4:1), (2:1), (1:1). Fraksi yang memiliki pola
KLT yang sama digabung sehingga diperoleh
fraksi yang lebih sederhana (Harborne,
1987).
3.1 Pengujian Aktivitas Antioksidan Fraksi
Kolom
Uji antioksidan fraksi dari hasil
kromatografi kolom dengan metode
peredaman radikal bebas menggunakan
DPPH (1,1-difenil-2-pikrihidrazil) (Yan and
Chan, 1995).
3.1.1 Pembuatan larutan 0,4 mM DPPH
Sebanyak 7,9 mg DPPH (BM =
394,32) ditimbang dan dilarutkan dalam 50
mL metanol proanalisis, dihomogenkan,
kemudian ditempatkan dalam botol berwarna
gelap.
3.1.2 Pembuatan larutan blanko
Page 6
Universitas Pakuan, Bogor
Sejumlah 0,6 mL DPPH 0,4 mM
dimasukkan kedalam tabung reaksi skala,
lalu ditambahkan metanol proanalisis hingga
atas tanda (3 mL) kemudian dihomogenkan.
3.1.3 Pembuatan larutan uji
Sejumlah 2,5 mg ekstrak dari fraksi
kolom ditimbang menggunakan timbangan
analitik, kemudian dilarutkan dengan
metanol proanalisis sampai 5mL (500 bpj).
Larutan ini merupakan larutan induk.
Kemudian 600 L larutan induk dipipet
kedalam tabung reaksi yang telah ditera 3 mL
untuk mendapatkan konsentrasi sampel 100
bpj. Pembuatan larutan uji dilakukan
sebanyak dua kali (duplo).
3.1.4 Uji aktivitas antioksidan
Larutan uji dimasukan ke dalam
masing-masing tabung reaksi. Lalu
ditambahkan 0,6 mL larutan DPPH 0,4 mM
kemudian ditambah metanol proanalisis
hingga 3 mL, kemudian dihomongenkan.
Larutan blangko dan larutan uji segera
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ,
kemudian serapan dibaca pada panjang
gelombang 517 nm menggunakan
spektrofotometer UV-Vis.
3.1.5 Analisis data uji aktivitas antioksidan
Analisis uji aktivitas antioksidan
dengan cara serapan blanko dan larutan uji
yang telah diukur pada Spektrofotometer
UV-Vis dicatat kemudian dicari persen
hambatan aktivitas radikal bebas dengan cara
memasukkan hasil serapan masing-masing
sampel pada rumus sebagai berikut :
Hambatan radikal bebas
=
x 100%.
4. Kromatografi Lpis Tipis (KLT
Preparatif)
Fraksi paling aktif sebagai senyawa
antioksidan dipilih untuk diidentifikasikan
dilakukan pemurnian terhadap fraksi
menggunakan metode KLT preparatif dengan
cara menotolkan fraksi berupa pita pada
lempeng silika sebagai fase diam kemudian
dielusi dengan menggunakan fase gerak
kloroform-metanol (2:1). Bercak pita yang
muncul dianalisis pada cahaya ruang lalu
dengan sinar UV pada panjanag gelombang
254 nm dan 366 nm. Pita yang muncul
dilakukan pemisahan dengan pengerokan,
hasil pengerokan dilarutkan dengan metanol
pro analisis, lalu dipekatkan. Hasil dari
pemurnian KLT peparatif ini yang akan
ditentukan struktur kimianya (Harborne,
1987).
5. Penentuan Struktur Kimia Senyawa
Aktif (Harborne, 1987)
5.1 Analisis Spektrofotometri UV/Vis
terhadap isolat murni
Isolat murni yang didapat dari hasil
pemurnian kromatografi kolom diidentifikasi
menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada
panjang gelombang 200-400 nm
menggunakan metanol pro analisis sebagai
blanko dan juga digunakan sebagai pelarut.
Analisis ini digunakan untuk mengetahui
Page 7
Universitas Pakuan, Bogor
panjang gelombang maksimum dan gugus
kromofor yang terdapat dalam isolat .
5.2 Analisis Spektrofotometri FTIR terhadap
isolat murni
Isolat murni diidentifikasi
menggunakan spektrometri FTIR pada
bilangan gelombang 600-4000 cm-1
dengan
cara menggerus ekstrak kering dari isolat
bersamaan dengan KBr hingga halus dan
homogen. Setelah diperoleh isolat yang telah
homogen dimasukkan ke dalam
spektrofotometer FTIR untuk menentukan
gugus fungsi yang terdapat dalam isolat
5.3 Analisis dengan Kromatografi Gas-
Spektrometri Massa (KG-SM)
Isolat murni diidentifikasi
menggunakan KG-SM untuk menentukan
bobot molekul senyawa dan fragmentasinya.
Sejumlah isolat murni dilarutkan dalam
metanol pro analisis kemudian diinjeksikan
ke dalam KG-SM lalu diinterpretasikan
spektrum massanya dibandingkan dengan
data library.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Kurva Pertumbuhan
Tujuan dari pembuatan kurva
pertumbuhan ini adalah untuk menentukan
waktu yang diperlukan dalam melakukan
bioproduksi terhadap kapang endofit
K.Cl.Sb.A.12. Lamanya waktu untuk
melakukan bioproduksi ditentukan dengan
menggunakan waktu pada saat terjadinya
fase stasioner pada kapang endofit, karena
pada fase ini senyawa yang dihasilkan
diharapkan dalam jumlah maksimal sebelum
memasuki fase kematian yang akan
menyebabkan terjadinya kematian sel
sehingga senyawa hasil bioproduksi pun akan
berkurang. Kurva pertumbuhan dari isolat
kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 dapat dilihat
dari Gambar 1.
Gambar 1. Kurva pertumbuhan isolat kapang
endofit K.Cl.Sb.A.12
Berdasarkan hasil kurva pertumbuhan
yang diperoleh maka ditentukkan waktu
untuk fermentasi pada tahap bioproduksi
akan dilakukan selama 14 hari, karena pada
hari ke-14 kapang sedang berada dalam
keadaan stasioner dimana senyawa yang
dihasilkan berada dalam keadaan cukup
konstan sehingga diharapkan senyawa yang
dihasilkan oleh kapang cukup banyak.
1.1 Pengukuran pH
Hasil pengukuran pH dari filtrat
fermentasi kapang endofit K.Cl.Sb.A.12
ditunjukan oleh Tabel 1.
-2,22E-16 0,05
0,1 0,15
0,2 0,25
0,3 0,35
0,4 0,45
0,5 0,55
0,6
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Bob
ot
bio
mass
a
ker
ing (
gra
m)
Hari Ke-
Kurva Pertumbuhan
K.Cl.Sb.A.12
Page 8
Universitas Pakuan, Bogor
Tabel 1. Hasil pengukuran pH fermentasi
isolat kapang endofit K.Cl.Sb.A.12
Waktu (Hari) pH
Blanko 4
Hari ke-2 5
Hari ke-4 5
Hari ke-6 5
Hari ke-8 5
Hari ke-10 5
Hari ke-12 6
Hari ke-14 6
Hari ke-16 6
Hari ke-18 6
Hari ke-20 6
Hari ke-22 6
Hasil pengukuran pH menunjukkan
kapang endofit K.Cl.Sb.A.12 tumbuh pada
kisaran pH 4-6, Hal ini dimungkinkan pada
pH 6 kapang sudah tidak berada pada kisaran
pH pertumbuhan optimalnya perubahan pH
ini bisa disebabkan karna akumulasi zat-zat
ekskresi kapang.
2. Bioproduksi Laboratorium
Bioproduksi laboratorium dilakukan
untuk memperoleh ekstrak hasil fermentasi
kapang, baik ekstrak filtrat maupun biomassa
dalam jumlah yang banyak. Bioproduksi
yang dilakukan dengan fermentasi isolat
K.Cl.Sb.A.12 pada 2000 mL media PDB dan
2000 mL media PSB, kemudian diekstraksi
dengan etil asetat. Fase etil asetat yang
diperoleh dikumpulkan dan dikeringkan
hingga diperoleh ekstrak kering. Ekstrak
kering masing-masing fase ditimbang
bobotnya ditunjukan filtrat etil asetat PDB
sebesar 41,8 mg, biomassa etil asetat PDB
sebesar 10,6 mg, filtrat etil asetat PSB 30,3
mg, dan biomassa etil asetat PSB 33,3 mg.
2.1 Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak
filtrat dan ekstrak biomassa menggunakan
DPPH 0,4 mM
Ekstrak etil asetat filtrat dan biomassa
PDB, ekstrak etil asetat filtrat dan biomassa
PSB dilakukan uji aktivitas antioksidannya
menggunakan metode peredaman radikal
bebas DPPH dengan menggunakan kontrol
positif vitamin C.
Pengujian ini bertujuan untuk memilih
salah satu diantara ekstrak tersebut diatas
yang mempunyai aktivitas antioksidan paling
tinggi. Hasil uji aktivitas antioksidan dapat
dilihat Gambar 2
Gambar 2.Hasil uji aktivitas antioksidan
Dari hasil uji aktivitas antioksidan
diketahui bahwa IC50 ekstrak etil asetat filtrat
PDB lebih kecil dibandingkan ekstrak yang
lain dengan nilai IC50 sebesar 70,0 bpj
merupakan ekstrak yang paling aktif sebagai
antioksidan dibandingkan dengan ekstrak
yang lain. Penggunaan vitamin C sebagai
2,07 70,0
2442,68
201,42
679,92
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
IC5
0 (b
pj)
Ekstrak
Vitamin C
Ekstrak Filtrat PDB
Ekstrak Biomassa PDB
Ekstrak Filtrat PSB
Ekstrak Biomassa PDB
Page 9
Universitas Pakuan, Bogor
kontrol positif dilakukan untuk
membandingkan data aktivitas antioksidan
dari ekstrak filtrat dan biomassa karena
vitamin C sudah terbukti memiliki aktivitas
yang sangat aktif sebagai antioksidan dengan
nilai IC50 sebesar 2,07 bpj. Ekstrak filtrat
PDB dipilih untuk dilanjutkan pada tahap
fraksinasi kromatografi kolom.
2.2 Analisis dengan kromatografi lapis
tipis
Berdasarkan hasil uji aktivitas
antioksidan dengan metode peredaman
radikal bebas bahwa ekstrak etil asetat filtrat
PDB memiliki aktivitas antioksidan tertinggi
dibandingkan dengan ekstrak lain. Dilakukan
analisis kromatografi lapis tipis dengan
menggunakan fase gerak n-heksan- etil asetat
(5:1) dan kloroform-metanol (9:1). Analisis
ini bertujuan untuk mengetahui pola bercak
yang terdapat pada ekstrak etil asetat filtrat
PDB dan mencari fase gerak yang sesuai
untuk pemisahan pada kromatografi kolom.
Kromatogram KLT dapat dilihat pada
Gambar 3.
Gambar 3. Kromatogram KLT ekstrak
K.Cl.Sb.A.12
Fase diam : silika gel GF254
Pereaksi semprot : serium sulfat
Keterangan : B = Biomassa
F = Filtrat
Hasil eluasi menunjukkan bahwa eluen
kloroform-metanol (9:1) memberikan pola
pemisahan bercak yang lebih terpisah dan
lebih bisa mengeluasi senyawa sehingga
tidak ada yang tertinggal dititik awal KLT.
3. Fraksinasi dengan kromatografi kolom
Ekstrak etil asetat dari filtrat PDB
selanjutnya difraksinasi dengan metode
kromatografi kolom menggunakan eluen
campuran kloroform-metanol yang telah
diperoleh pada analisis KLT. Fraksinasi ini
bertujuan untuk memisahkan senyawa-
senyawa yang terdapat didalam ekstrak.
Fase gerak yang digunakan adalah
kloroform-metanol dengan perbandingan
(15:1) ~ (1:1). Sedangkan fase diam yang
digunakan adalah silika gel 60, dengan
dimensi kolom 3x40 cm. Hasil fraksinasi
diperoleh 49 fraksi dengan volume masing-
masing 10 mL. Lalu fraksi-fraksi tersebut
dianalisis KLT dengan selang penotolan
setiap 3 fraksi. Hasil kromatogram dapat
dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Kromatogram KLT fraksi hasil
kromatografi kolom
n-heksan–etil
asetat (5:1)
1 4 7 10 13 16 19 22 25 25 28 34 31 37 40 43 46 49
Kloroform-metanol (9:1) Kloroform-metanol (5:1)
Kloroform–
metanol (9:1)
Ekstrak
PDB
Ekstrak
PDB Ekstrak
PSB
Ekstrak
PSB
Page 10
Universitas Pakuan, Bogor
Senyawa yang memiliki pola
kromatogram yang sama kemudian digabung
karena dianggap memiliki kandungan
senyawa yang sama. Setelah dilakukan
penggabungan diperoleah 3 fraksi yang
kemudia dilakukan penotolan kembali
dengan KLT menggunakan fase gerak
kloroform : metanol (5:1) untuk melihat
bercak-bercak yang dihasilkan. Hasil
fraksinasi kromatografi kolom pertama dapt
dilihat pada Gambar 5
(a) (b)
Gambar 5. Kromatogram KLT fraksi
gabungan hasil fraksinasi kromatografi
kolom
Fase gerak : Kloroform-metanol (5:1)
Fase diam : silika gel GF254
Keterangan :(a) setelah disemprot serium
sulfat kemudian dikeringkan dan
dipanaskan diatas pemanas plat
sampai timbul bercak
(b) Sinar UV = 254 nm
Masing-masing fraksi yang diperoleh
kemudian ditimbang. Hasil penimbangan
ketiga fraksi gabungan tersebut dapat dilihat
Tabel 2.
Tabel 2. Hasil fraksi kromatografi kolom
Gabungan
fraksi
Kelompok
fraksi
Bobot
(mg)
1-10 I 30
11-40 II 40
41-49 III 10
Ketiga fraksi tersebut diuji aktivitas
antioksidannya untuk mengetahui fraksi
mana yang memiliki persen hambat
antioksidan yang paling tinggi.
3.1 Uji aktivitas antioksidan dengan metode
peredaman Radikal bebas DPPH terhadap
hasil kelompok fraksinasi kromatografi
kolom
Kelompok fraksi yang telah diperoleh
dari penggabungan fraksi-fraksi hasil
kromatografi kolom diuji aktivitas
antioksidannya mnggunakan metode
peredaman radikal bebas DPPH 0,4mM.
Dalam pengujian ini hanya terbatas pada
perhitungan persen hambat karena
keterbatasan jumlah bahan uji yang ada.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi II
memiliki persen hambat paling besar
daripada fraksi lainnya. Hasil pengujian
aktivitas antioksidan terhadap fraksi
kromatografi kolom dapat dilihat pada Tabel
3.
Tabel 3. Persen hambat kelompok fraksi
kromatografi kolom dengan konsentrasi 100
bpj
Sampel % Hambat
Fraksi I 25,74
Fraksi II 31,22
Fraksi III 23,19
Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak
dari filtrat PDB diperoleh nilai % hambat
69,56% pada konsentrasi 100 bpj .Sementara
setelah difraksinasi persen hambatnya
mengalami penurunan menjadi 31,22% pada
konsentrasi 100 bpj. Hal ini disebabkan di
Page 11
Universitas Pakuan, Bogor
dalam ekstrak terdapat senyawa yang bersifat
SEES (secondary Efficacy Enhancing
Substantance) artinya senyawa yang ada
didalam ekstrak bekerja secara sinergi dan
apabila difraksinansi, ekstrak menjadi
terpisah sehingga kesatuan ekstrak menjadi
berubah dan senyawa yang tadinya bersifat
dapat meningkatkan antioksidan menjadi
hilang (Setianti, 2015).
4. Pemurnian fraksi II dengan KLT
preparatif
Hasil analisis KLT menunjukkan fraksi
II yang memiliki % peredaman radikal bebas
tertinggi. Tetapi fraksi ini mempunyai
beberapa bercak sehingga perlu dilakukan
pemurnian dengan KLT preparatif dengan
menggunakan fase gerak kloroform-metanol
(2:1). Pola kromatogram fraksi II dari hasi
KLT preparatif menunjukkan adanya 1 pita
yang diduga mengandung isolat X. Gambar
KLT preparatif fraksi II dapat dilihat pada
Gambar 5.
Gambar 5. Kromatogram KLT-preparatif
fraksi II dibawah sinar UV = 254 nm
Fase gerak : kloroform-metanol (2:1)
Fase diam : silika gel GF254
Keterangan : setelah dilihat dibawah UV
254, bercak tersebut ditandai dan dikerok.
Pita 1 setelah dikerok dari hasil KLT
prepartif diduga senyawa murni berbentuk
kristal, beratnya 7,6 mg dan berwarna putih.
Kemudian dilakukan dengan KLT kembali
untuk melihat kemurniannya, hasil KLT
dapat dilihat pada Gambar 6. Hasilnya
terlihat ada 1 spot dibawah sinar UV = 254
nm yang artinya senyawa tersebut sudah
murni, sedangkan hasil KLT dengan penanda
gerak DPPH di peroleh spot berwarna kuning
artinya senyawa tersebut memiliki aktivitas
antioksidan.
(a) (b)
Gambar 6. Kromatogram KLT Pita 1 hasil
KLT Preparatif
Fase gerak : Kloroform-metanol (2:1)
Fase diam : silika gel GF254
Keterangan : (a) Disemprot DPPH kemudian
dikeringkan plat sampai timbul
spot
berwarna kuning
(b) Sinar UV 254
5. Identifikasi struktur kimia isolat x
5.1 Spektrofotometri UV-Vis
Pengujian spektrofotometri UV-Vis
yang dilakukan pada panjang gelombang
200-400 nm, menunjukkan bahwa puncak
maksimum yang terdapat pada panjang
gelombang 308 nm dengan nilai serapan
Pita 1
Page 12
Universitas Pakuan, Bogor
0,952. Hasil spektrum beserta serapan dapat
dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Spektrum hasil spektrometri UV-
Vis Isolat X.
5.2 Spektrofotometri FTIR
Spektrum dari FTIR yang digunakan
untuk melihat gugus fungsi dalam senyawa
berdasarkan bilangan gelombang dapat
dilihat pada Gambar 8. Interprestasi yang
dilakukan berdasarkan spektrum FTIR
ditunjukkan dalam Tabel 4.
Gambar 8. Spektrum hasil spektrometrin
FTIR isolat X
Tabel 4. Hasil interpretasi spektra FTIR dari
isolat X
N
o
Frekuens
i
Rentang
frekuens
i (cm-1
) *
Tipe
ikata
n *
Tipe
senyawa
*
1 3585,42 3200-
3600 v
O-H Fenol,
Hidroksil
2 2925,81
2858,31
2859-
2970 v
C-H Alkana
3 1591,16 1500-
1600 v
C=C Cincin
aromatik
4 1463,87
1411,80
1340-
1470 s
C-H Alkana
5 1151,42
1078,13
1050-
1300
C-O
Alkohol,
eter
6 997,13
881,41
690-900 C-H Cincin
Aromatik
Keterangan :
s : strong, m : medium, v : variable, b : broad
: Tabel frekuenasi dan panjang gugus fungsi dari
Principles of Instrumental Analysis Sixth Edition (
Skoog, 2007).
5.3 Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
Analisis KG-SM untuk isolat X
memberikan beberapa puncak kromatogram
yang menunjukkan adanya beberapa senyawa
kimia dalam isolat X. Senyawa kimia yang
tekandung dalam isolat X terutama senyawa
dengan waktu retensi (Rt) 10,338 menit,
sedangkan senyawa yang lebih kecil dengan
waktu retensi (Rt) 25,379. Satu senyawa
utama dengan waktu retensi 10,338 menit
diidentifikasikan sebagai senyawa m/z 124.05
yang memiliki nilai kemiripan dengan
database Willey09th.L diatas 90%,
sedangkan satu senyawa dengan waktu
retensi 25,379 menit diidentifikasikan
sebagai senyawa m/z 678.43 yang memiliki
Page 13
Universitas Pakuan, Bogor
kemiripan diatas 80, dimana semakin tinggi
nilai persen kemiripan dari suatu puncak hal
ini menandakan kemiripan suatu sneyawa
dengan database Willey09th.L.
Kromatogram KG-SM isolat X dapat
dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Kromatogram KG-SM dari Isola
X
Tabel 5. Beberapa kandungan senyawa isolat
X hasil analisis KG-SM
Hasil analisis dengan KG-SM menggunakan
database Willey09th.L didapat kemungkinan
senyawa yang terdapat pada isolat X adalah
senyawa 1,3-Benzenediol,5-methyl karena
memiliki puncak kromatogram yang
maksimum dan tingkat (qual) lebih dari 90%.
Gambar 10. Spektra massa fragmentasi
senyawa isolat X pada waktu retensi 10,338
Berdasarkan hasil interprestasi dari tiga
instrumen yang didapat, dimana pada spektra
UV-Vis terdapat serapan pada panjang
gelombang diatas 200 nm yang menunjukkan
adanya gugus kromofor dan diduga
merupakan suatu ikatan rangkap. Pada
spektra FTIR didapat munculnya fenol,
hidroksil, alkana, cincin aromatik, alkohol,
eter. Pada kromatogram KG-SM didapat
beberapa peak (puncak) dimana suatu
diantaranya memiliki nilai kemiripan (qual)
paling tinggi yaitu 93% dan menurut
Willey09th.L adalah suatu senyawa 1,3-
Benzenediol,5-methyl. Dari semua hasil
analisis yang didapat, disimpulkan bahwa
senyawa isolat X hasil bioproduksi isolat
K.Cl.Sb.A.12 yang difermentasi dalam media
1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0
5 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
5 5 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0
6 5 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0
7 5 0 0 0 0
T im e -->
A b u n d a n c e
T I C : A K A R K U N Y I T . D \ d a t a . m s
1 0 . 3 4 2
1 0 . 7 5 9
1 0 . 9 4 61 2 . 6 8 21 3 . 9 3 0
1 4 . 4 1 3
1 4 . 5 9 61 9 . 6 1 5
2 5 . 3 8 32 5 . 4 5 2
2 5 . 6 2 6
2 5 . 7 3 3
2 5 . 7 9 7
N
o
Waktu
retensi
(menit)
Bobot
moleku
l (m/z)
Qual
(%)
Kemungkinan
senyawa
menurut
database
Willwy09th,L
Perkiraan
Struktur
Molekul
1 10,338 124.05 93 1,3-
Benzenediol,5
-methyl
2 25,379 678.43 83 7,13,19,25-
Tetra-tert-
butyl-
27,28,29,30-
tetrahydroxy-
2,3-bishomo-
3-oxacalix
Page 14
Universitas Pakuan, Bogor
PDB diduga merupakan 1,3-Benzenediol,5-
methyl. Perkiraan struktur dapat dilihat pada
Gambar 11.
Gambar 11. 1,3-Benzenediol,5-methyl
KESIMPULAN
1. Hasil uji aktivitas antioksidan dengan nilai
IC50 dari ekstrak etil asetat filtrat PDB
adalah sebesar 70,0 bpj merupakan
ekstrak yang paling aktif sebagai
antioksidan.
2. Fraksi II memiliki nilai % hambat
tertinggi sebesar 31,22 %.
3. Hasil analisis Pita 1 dari KLT preparatif
berbentuk kristal berwarna putih dengan
berat 7,6 mg dapat diperkirakan bahwa
isolat X yang terkandung dalam fraksi II
pita 1 adalah 1,3-Benzenediol,5-methyl.
DAFTAR PUSTAKA
Bustanussalam , Fauzy R, Eris S, Sylvia J.R.
L, Tiwit W, Harmastini l, Sukiman and
Partomuan S. 2015. Screening for
Endophytic Fungi from Tumeric Plant
(Curcuma Longa L) of Sukabumi and
Cibinong with Potencyas Antioxidant
Compound Producer. Pakistan Journal
of biological Sciences 18 (1):
42-45.
Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia,
Penuntun Cara Modern Menganalisa
Tumbuhan. Terbitan Kedua.
Terjemahan Kokasih Padmawinata dan
Iwang Soediro, Penerbit ITB,
Bandung.
Said Ahmad. 2007. Khasiat dan Manfaat
Kunyit , Sinar Wadja Lestari, Jakarta,
hal 4-11.
Setianti, Priskila. A. 2015. Isolasi dan
identifikasi senyawa antioksidan hasil
bioproduksi kapang endofit
(K.Cl.Sb.R9) dari rimpang kunyit
(Curcuma longa linn.) Asal Sukabumi,
Skripsi Universitas Pancasila, Jakarta,
hal 41.
Simanjuntak P, Parwati T, Bustanussalam,
Titik K. Prana, dan Shibuya H Kurnia .
2002. Produksi Alkaloid Kuinina Oleh
Beberapa Mikroba Endofit Dengan
Penambahan Zat Induser (Studi
Mikroba Endofit Tanaman Cinchona
Sp. (2)) , Majalah Farmasi
Indonesia, Faculty of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, Fukuyama
University, Fukuyama, Japan 13 (1) : 1-6.
Winarsi, Hery. 2007. Antioksidan Alami dan
Radikal Bebas potensi dan
aplikasinya dalam kesehatan, Kanisius,
Yogyakarta, hal 11-20.
Yan, G.C. and H.Y. Chen. 1995. Antioxidant
activity of various tea extracts in
relation to their antimutagenicity.
J.Agric. Food Chem., 43: 27-37