TUBERCULOSIS BOVINA: DESCRIPCIÓN Y MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Mauricio Andino Molina, Mario Alejandro Moncada | 2013 Escuela de Microbiología, UNAH Revisada por Dra. Reina Laura Rivera, MSc; Dra. Rebeca Rivera, MSc TABLA DE CONTENIDO No. página Tuberculosis bovina 2 Agente etiológico 2 Características epidemiológicas 3 Internacionales 4 Nacionales 6 Diagnóstico de la tuberculosis bovina 6 Cultivo bacteriológico y diagnóstico microbiológico 7 Pruebas inmunológicas (serológicas) 8 o γ Interferón 8 o MAPIA 10 o PPD/TST 11 o Pruebas rápidas (PR-BTB) 12 o Prueba de plataforma dual (DPP) 13 o ELISA 13 o SeraLyte-Mbv 14 o Multiplex chemiluminescence immunoassay (MCI-BTB) 14 o Biología molecular 15 o PCR 15 o Spoligotyping 16 o IMS-Spoligotyping 17 o Fingerprinting 17 Conclusiones 18 Recomendaciones 19 Anexos 21 Bibliografía 23
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TUBERCULOSIS BOVINA:DESCRIPCIÓN Y MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
Mauricio Andino Molina, Mario Alejandro Moncada | 2013Escuela de Microbiología, UNAH
Revisada por Dra. Reina Laura Rivera, MSc; Dra. Rebeca Rivera, MSc
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En un estudio practicado por Monaghan et al. en 1994, se obtuvo una sensibilidad
de 68-96.8% y 96-98.8% de especificidad para la variante TST-CFT, una sensibilidad de 80-
91.0% y 75.5-96.8% de especificidad para la variante TST-CIT y una sensibilidad de 55.1-
93.5% y 88.8-100.0 % de especificidad para la variante TST-CCT.
En los últimos años se ha trabajado en la fabricación de PPD mejorada, utilizando
nuevos péptidos en conjugados y utilizando variantes de hasta 21 péptidos en un solo
producto. En algunos casos la sensibilidad fue incrementada sustancialmente, sin embargo
la especificidad fue ligeramente afectada. (12)
PRUEBAS RÁPIDAS (PR-BTB)
Las pruebas rápidas son utilizadas ampliamente en el mundo diagnóstico como un
método de diagnóstico rápido y económico.
Como se ha discutido en varios estudios, el uso de múltiples antígenos específicos
de Mycobacterium bovis aerosolizados o fijados en plataformas de nitrocelulosa
constituyen la base de las técnicas de inmunocromatografía en el área veterinaria. Este tipo
de prueba ha sido utilizado no solo para bovinos sino para un amplio espectro de animales
que son infectados con Mycobacterium bovis y que constituyen reservorios naturales de
infección tanto para otros animales como para el humano. (12, 20, 25, 28, 29, 31–36)
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Uno de los antígenos mas ampliamente utilizado para la manufactura de pruebas
rápidas de tuberculosis bovina es MPB83, según estudios se encontró una sensibilidad de
60.0% y una especificidad de 96.0% en ganado. (20)
Prueba de Plataforma Dual (DPP)
Esta novedosa prueba se utilizada en múltiples ensayos y ha sido montada para la
detección de VIH 1/ VIH 2 por CHEMBio ™, esto muestra la versatilidad de la misma.
Se ha utilizado un montaje del antígeno recombinante o purificado MPB83 y MPB70
para la detección de anticuerpos específicos en camélidos americanos. En el estudio
realizado DPP mostró una sensibilidad 74.3% y una especificidad de 97.6%. (37) El uso de
esta técnica es prometedora en el campo del diagnostico bovino a gran escala y en estudios
epidemiológicos primarios.
ELISA
ELISA es por excelencia uno de los kits comerciales y también “In House” mas
utilizados alrededor del mundo. Sus aplicaciones son infinitas y se utilizan como métodos de
referencia para el estudio de un sin numero de enfermedades y sus agentes etiológicos. Es
esta técnica la que se utiliza para poder medir la concentración de γ interferón como se
describió anteriormente en el apartado correspondiente. Así mismo el uso de antígenos
variados y en algunos casos combinados como lo son MPB70 y MPB83 hacen de esta
técnica una forma simple y segura de diagnóstico. (20, 38, 39) La sensibilidad media y
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especificidad media con el uso de dichos antígenos es de hasta 63.5% y 88.8%
respectivamente. (20, 39)
SeraLyte-Mbv
Esta es una novedosa técnica de reciente introducción, donde se utilizan perlas de
ferrita con una capa de antígeno MPB83 unida covalentemente al soporte. El conjugado
cuenta de ferrita-antígeno (Conjugado primario) se une específicamente a los anticuerpos
presentes en el suero a examinar en animales potencialmente infectados (Conjugado
secundario). Para correr la prueba se requieren de aproximadamente 2 horas, donde el
conjugado primario y secundario son incubados, luego la mezcla de trabajo es lavada y es
detectado por anticuerpo monoclonales específicos que contienen marcadores cromógenos
(Conjugado terciario). El resultante será leído por quimioluminiscencia. La sensibilidad y
especificidad fueron de 96.0% y 98.0% respectivamente. (40)
Multiplex Chemiluminescence Immunoassay
Esta es una técnica que utiliza la inmuno-impresión por micro-aerosolización de 20
antígenos purificados en pozos de micro placa convencional para Inmunoensayo.
Posteriormente cada uno de los puntos que corresponden a un antígeno en específico es
leído por quimioluminiscencia. Se obtuvo una especificidad de 98.4% y una sensibilidad de
93.1%. (41)
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BIOLOGÍA MOLECULAR
En los últimos años se han producidos notables avances en el diagnostico de bTB
con la herramientas de biología molecular que contribuyen a ampliar las limitaciones de las
técnicas tradicionales ya que los estudios de campo son propensos a subestimar
heredabilidad , debido a la exposición desigual a los patógenos , así como la sensibilidad
incompleta de las pruebas de diagnóstico que se utilizan se discute también la gran cantidad
de datos que ahora indica la existencia de una base genética para la resistencia a la
tuberculosis bovina en el ganado bovino. (2)
Entre las técnicas usadas para el diagnóstico tenemos la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) y la técnica “Direct Variable Repeat Spacer Oligonucleotide Typing”
(Spoligotyping).
PCR
El PCR es una reacción de amplificación genética. En el caso de las mycobacterias,
la extracción es simple si se realiza a partir de cultivos tanto sólidos como líquidos donde
existe una cantidad elevada de ADN. Si se parte de una muestra clínica el rendimiento de la
extracción es menor y deficiente porque la cantidad de ADN es inferior lo que puede
comprometer la sensibilidad.
La técnica de PCR se ha utilizado para complementar estudios filogenéticos y
también para analizar muestras “extrañas”, como es el caso de un estudio publicado en el
que se extrajo ADN de moscas invasivas. El diagnóstico de Mycobacterium bovis y
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Mycobacterium avium subs. paratuberculosis fue lograda por la detección de las
secuencias IS6110 y IS900, de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium
respectivamente. (42)
Se ha determinado por medio de esta técnica que una de las proteínas con mayor
incidencia en los ensayos realizados es la MPB83. (19) Ciertas variaciones en la técnica son
útiles para la obtención de perfiles epidemiológicos completos. La restricción de genes para
su posterior detección muestra buenos resultados y sirve también para poder identificar
infecciones mixtas en ganado. Los tejidos son una buena muestra para esta técnica. (43)
SPOLIGOTYPING
Se evaluó por su capacidad para diferenciar cepas de Mycobacterium
bovis. Este método detecta la presencia o ausencia de los espaciadores del locus de
repetición directa del genoma de M. bovis. Los espaciadores en el locus de repetición
directa se amplifican por PCR y se detectan por la hibridación del producto de PCR marcado
con biotina con una membrana que contiene oligonucleótidos derivados de secuencias
espaciadoras que han sido previamente unidos covalentemente a una membrana. Al final
del protocolo se obtiene un patrón (perfil de Espoligotipo) (44, 45)
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IMS – SPOLIGOTYPING
La técnica de IMS (Immunomagnetic separation) nos permite concentrar de manera
especifica y selectiva bacilos de Mycobacterium bovis en muestras de tejido linfático
(nodos) mediante el uso de perlas micro-aerosolizadas con péptidos específicos.
Los resultados muestran una tasa de recuperación superior cuando se utiliza la técnica de
concentración aunada al spoligotyping mencionado anteriormente. La IMS-Spoligotyping
podría evitar la necesidad de descontaminación química, mediante la captura de forma
selectiva las células de Mycobacterium bovis y separándolas de otras bacterias en las
muestras, mejorando así su especificidad. (45)
FINGERPRINTING
En años recientes se han fabricado sondas de ADN para el estudio filogenético de
diversas formas de vida, incluyendo mycobacterias. El método más popular del DNA
fingerprinting para mycobacterias del complejo M. tuberculosis es el análisis de hibridación
del Southern Blot usando elementos de ADN repetitivos como sondas. El elemento de
inserción que mejores resultados ha dado, ha sido el IS6110, con este elemento se visualiza
mejor la variación de cepas que existen en el bacilo tuberculoso; ya que el polimorfismo del
ADN detectado por la sonda IS6110 es muy alto entre aislados clínicos no relacionados, y la
estabilidad de este elemento en el cromosoma de la mycobacteria, es muy alta. (38)
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CONCLUSIONES
El avance de la tecnología ha permitido la implementación de nuevas técnicas de
diagnostico para la tuberculosis bovina. El uso y la aplicación de pruebas inmunológicas son
los principales objetivos de la investigación global en este tema, mas de siete (7) diferentes
plataformas de diagnóstico rápido y al menos cuatro (4) técnicas novedosas han sido
valoradas, mostrando tasas satisfactorias de sensibilidad y especificidad.
El uso de conjugados poli-antigénicos parecen ser los mejores candidatos para un
diagnostico serológico efectivo. El uso de MPB83 y proteínas recombinantes en plataformas
complejas son aún promisorias pero requieren de una gran inversión para su
implementación.
El uso de inmunoensayos convencionales utilizando pools de antígenos
recombinantes parece ser el mecanismo mas viable para combinar con pruebas tales como
γ Interferón, en la búsqueda de un diagnostico eficaz e individualizado en hatos lecheros y
ganaderos. En España se combina el uso de TST-PPD y la prueba de γ Interferón para
aumentar la sensibilidad y especificidad de los resultados.
Según expertos en Honduras, se utiliza la PPD como mecanismo de diagnostico
primario y el cultivo bacteriológico como mecanismo de diagnostico confirmatorio. Aunque
ambas técnicas proveen respuestas satisfactorias y son recomendadas por la OIE, la
implementación de pruebas serológicas o inmunológicas son necesarias para poder
competir a nivel internacional en cuanto a la exportación de productos lácteos o cárnicos.
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RECOMENDACIONES
Se necesita realizar una recolección de datos estadísticos y técnicos sobre
tuberculosis bovina, su diagnostico, manejo, prevención y control a nivel nacional.
El ensayo de pruebas inmunológicas es una necesidad. El manejo que prescriben
los organismos internacionales en nuestro país son el aislamiento y matanza del animal
infectado. Sin embargo la transmisión de tuberculosis por medio de productos lácteos es
posible y constituye un problema no valorado en los esquemas de control epidemiológico, en
parte por los costos que esta actividad reguladora supondría.
Asimismo se requiere el ensayo de cultivos bacteriológicos, el aislamiento y la
identificación del patógeno, aunando a lo anterior una prueba de susceptibilidad a los
antimicrobianos, que sin lugar a dudas contribuiría enormemente al fortalecimiento de la
investigación y a la salud de nuestros pueblos no solo a nivel nacional sino internacional.
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ANEXOS
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Tabla 1. Características de Cultivo (Mycobacterium bovis)
Medium ATCC 19210
Pinpoint colonies in 2 weeks; gradually enlarged and rounded to about 1 mm in diameter; no pigmentation; colonies matted; with hand lens (3 to 5x), the surface is finely granular; colonies friable; in nonglycerinated medium, the colonies appear earlier and are larger.
Lowenstein - Jensen
Similar to above except growth is slower and colonies smaller; in nonglycerinated medium, the colonies are larger.
PetragnaniPinpoint colonies in 2 to 3 weeks; gradually enlarge to about 1 mm; no pigment; finely granular surface; friable.
Middlebrook 7H10Pinpoint colonies in 1 to 2 weeks; slowly enlarge to 2 to 3 mm; no pigment; appear moist but granular; friable.
Egg-yolk agar
Pinpoint colonies in 1 to 2 weeks; slowly enlarge to 2 to 3 mm; no pigment; flat and slightly elevated surface; granular; friable.
Stone brink
Pinpoint colonies in 1 to 2 weeks; slowly enlarge to 2 to 3 mm; no pigment; flat and slightly elevated surface; granular; friable.
Lebek medium Subsurface growth in 2 to 3 weeks.
Proskauer- Beckliquid medium
Granular deposit in 3 to 5 weeks; not turbid; no pigment; growth enhanced by 2 to 5% serum.
Dubs Tween-80liquid medium
Diffuse growth in 3 to 5 weeks; slight sediment which disperses on shaking; no pellicle; no pigment; maximal growth at about 5 weeks.
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Tabla 2. Respuesta Humoral en Inmunoensayo utilizando MAPIA.
Antígeno * Sensibilidad (%) Especificidad (%)ESAT-6 67.0 98.0CFP-10 56.0 99.0MPB70 44.0 100.0MPB83 89.0 99.0* LA ESPECIE ANALIZADA FUE EL CIERVO.
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