Tierärztliche Hochschule Hannover Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler Spongiformer Enzephalopathien der Ziege INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Susanne Freyse Karlsburg Hannover 2012
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Tierärztliche Hochschule Hannover · Tierärztliche Hochschule Hannover Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler Spongiformer Enzephalopathien der Ziege INAUGURAL
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler
Spongiformer Enzephalopathien der Ziege
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Susanne Freyse
Karlsburg
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin H. Groschup
Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger,
Friedrich-Loeffler-Institut Insel Riems
1. Gutachter: Prof. Dr. Martin H. Groschup
2. Gutachter: Prof. Dr. Martin Ganter
Tag der mündlichen Prüfung: 17. April 2012
Diese Arbeit wurde im Rahmen eines von der Europäischen Union geförderten Forschungs-
projektes durchgeführt.
Meiner lieben Familie
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZU&GSVERZEICH&IS........................................................................................ VII
(vermutlich sporadisch) Transmissible Nerz-Enzephalopathie Infektion Feline Spongiforme Enzephalopathie Infektion Chronische Auszehrungskrankheit der Hirschartigen Infektion Spongiforme Enzephalopathie der exotischen Wildwiederkäuer Infektion
2.2 Stammcharakterisierung der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien
Obwohl die Aminosäuresequenz des pathologischen Prion-Proteins unverändert bleibt, konn-
ten verschiedene TSE-Stämme isoliert werden. Sie unterscheiden sich nach Art der Klinik,
den Inkubationszeiten, der Übertragbarkeit, den neuropathologischen Veränderungen (Läsi-
onsprofil), den Inaktivierungseigenschaften und ihren biochemischen Charakteristika wie PK-
Resistenz und PK-Schnittstelle sowie dem Glykoprofil des PrPSc. Bereits 1961 beschrieben
PATTISON und MILLSON einen durch starken Pruritus („scratching“-Syndrom) und einen
von allgemeiner Depression dominierten („drowsy“-Syndrom) Scrapie-Stamm bei Ziegen.
Auch bei nachfolgenden Passagen dieses Stammes in Ziegen setzten sich die jeweiligen klini-
schen Formen fort. Als Hintergrund wurden zwei unterschiedliche Scrapie-Stämme vermutet.
6 Literaturübersicht
Vergleichbares wurde für die Transmissible Nerz-Enzephalopathie (TME) bei Hamstern be-
schrieben. Der sog. „Hyper“-Stamm führte zu Übererregbarkeit und zerebellärer Ataxie, wäh-
rend der sog. „Drowsy“-Stamm Lethargie und Ataxie verursachte (BESSEN u. MARSH 1992
a, b, 1994).
2.2.1 Die Inkubationszeit und der Einfluss der Speziesbarriere
Wird die TSE von einer Spezies auf eine andere übertragen, so bewirkt die sog. Speziesbarrie-
re anfänglich verlängerte Inkubationszeiten, eine variierende Klinik und histopathologische
Veränderungen sowie eine verminderte Übertragungsrate der TSE bei den Rezipienten
(PATTISON et al. 1965). Die Inkubationszeit ist definiert als Zeitintervall zwischen der In-
fektion und dem Auftreten klinischer Symptome. Sie gilt als Stammcharakteristikum für TSE-
Erkrankungen. Erfolgen mehrere Passagen von TSEn innerhalb einer Spezies bzw. Mauslinie,
so verkürzt sich die Inkubationszeit und die histopathologischen Veränderungen bleiben kon-
stant. Mit der intrazerebralen Übertragung von TSE-Stämmen auf definierte Mauslinien ge-
lang es somit, die Übertragbarkeit, die Inkubationszeit und histopathologischen Läsionsprofile
des Erregers zu bestimmen und diesen näher zu charakterisieren.
Einen wesentlichen Einfluss auf die Übertragbarkeit hat die primäre Aminosäuresequenz des
Prion-Proteins der unterschiedlichen Spezies, denn eine Übertragung gelingt umso leichter, je
ähnlicher sich die Primärsequenzen sind (PRUSINER et al. 1990; BÜELER et al. 1994). Al-
lerdings erklärt dies nicht, warum einige der TSEn (z. Bsp. BSE) auf mehrere Spezies über-
tragbar sind. Weitere Einflussfaktoren können daher nicht ausgeschlossen werden
(COLLINGE et al. 1999; HILL u. COLLINGE 2004). Durch die Verwendung von transgenen
Mäusen, welche z. Bsp. das ovine (CROZET et al. 2001; VILOTTE et al. 2001), das bovine
(SCOTT et al. 1997; BUSCHMANN et al. 2000) oder das murine PrPc überexprimieren
(FISCHER et al. 1996), konnten die Speziesbarriere und die Inkubationszeiten stark reduziert
werden. Der Mausbioassay dient bis heute als sensitivster Test in der TSE-Diagnostik.
2.2.2 Die Bedeutung proteinbiochemischer Parameter
Zur Charakterisierung von TSE-Stämmen mittels proteinbiochemischer Methoden wird das
Glykosylierungsverhältnis, die molekulare Masse, die Immunoreaktivität sowie die PK-
Stabilität des PrPSc bestimmt. Anhand dieser Parameter kann einerseits eine Diskriminierung
der BSE-Stämme von den Scrapie-Stämmen vorgenommen werden, und andererseits die Cha-
Literaturübersicht 7
rakterisierung der einzelnen Scrapie-Stämme erfolgen, weshalb diese Methodik eine Alterna-
tive zu den sehr zeitaufwendigen Mausbioassays darstellt. Die Methodik basiert auf der par-
tiellen Resistenz des PrPSc gegen den Verdau durch die PK. Während PrPc durch PK ausge-
hend vom N-terminalen Ende vollständig verdaut wird, werden von der pathologischen Form
62 Aminosäuren (AS) N-terminal abgetrennt und es verbleibt ein PK-resistentes „Core“-
Fragment von 141 AS (OESCH et al. 1985). Durch den PK-Verdau verschiebt sich die mole-
kulare Masse des PrPSc im Immunoblot von 33-35 kDa auf 27-30 kDa.
2.2.2.1 Das Glykosylierungsverhältnis und die molekulare Masse
Die Bestimmung des Anteils der di-, mono- und unglykosylierten Form des PrPSc am Gesamt-
signal (Glykosylierungsverhältnis) erfolgt nach Auftrennung des PK-verdauten Gehirnmateri-
als in der Gelelektrophorese (SDS-Gel) und der Darstellung der PrPSc-Fragmente im Immu-
noblot. KASCSAK et al. beschrieben erstmals 1985 deutliche Unterschiede im Glykosylie-
rungsverhältnis muriner Scrapie-Stämme. Bei Kuru, dem GSS-Syndrom und iatrogener bzw.
sporadischer CJK dominiert die monoglykosylierte Form, bei vCJK und Rinder-BSE die
diglykosylierte Form (COLLINGE et al. 1996; SOMERVILLE et al. 1997; KUCZIUS et al.
1998). Vergleichbar zu Rinder-BSE dominierte bei oviner BSE ebenfalls die diglykosylierte
Form (STACK et al. 2002; NONNO et al. 2003; LEZMI et al. 2004; THURING et al. 2004;
GRETZSCHEL et al. 2005), was einen deutlichen Unterschied zu den meisten Scrapie-
Stämmen darstellte. Trotzdem ist anhand des Glykosylierungsmusters die Diskriminierung
der BSE v. a. von natürlich vorkommenden Scrapie-Stämmen nicht immer eindeutig möglich,
da auch letztere eine dominierende diglykosylierte Form des PrPSc aufweisen können
(BARON et al. 1999). Weitere Unterschiede fanden sich nach dem PK-Verdau für die mole-
kulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc von TSE-Stämmen, denn diese war für
Scrapie vorwiegend größer als für BSE (HILL et al. 1998; BARON et al. 2000; STACK et al.
2002). Neben dem TSE-Stamm und den Wirtseigenschaften üben der Genotyp des Empfän-
gertiers (SOMERVILLE et al. 1999), die Gewebeart der untersuchten Probe (RUBENSTEIN
et al. 1991), und bei ZNS-Proben der genaue Entnahmeort in den verschiedenen Gehirnregio-
nen (SOMERVILLE et al. 1999, 2005) einen Einfluss auf das Glykoprofil aus. Darüber hin-
aus stellte sich das Glykosylierungsmuster in Abhängigkeit von den verwendeten Antikörpern
different dar (GROSCHUP et al. 2000; SWEENEY et al. 2000), weshalb auch methodisch
bedingte Effekte bei der Auswertung zu berücksichtigen sind.
8 Literaturübersicht
2.2.2.2 Die Immunoreaktivität des pathologischen Prion-Proteins
Da das PrPSc der verschiedenen TSE-Stämme unterschiedliche Schnittstellen für die PK be-
sitzt, ergibt sich für die zur Detektion verwendeten Antikörper ein unterschiedlicher Grad der
Bindung an die Proteolyseprodukte (s. Abb. 2, S. 9). Diese Besonderheit wurde im sog. FLI-
Test zur Diskriminierung von Scrapie und BSE bei kleinen Wiederkäuern genutzt
(GRETZSCHEL et al. 2005). Die Detektion von PrPSc in Schaf- und Rindermaterial erfolgt
dabei mit dem monoklonalen Antikörper (MAK) P4, welcher N-terminal im Bereich der PK-
Schnittstelle das PrPSc bindet, sowie mit dem MAK L42, welcher im PrPSc weiter C-terminal
bindet. Das PrPSc aus mit Scrapie infizierten Schafen wird nach dem PK-Verdau durch beide
Antikörper detektiert, während das Epitop des MAK P4 auf dem PrPSc aus mit BSE infizier-
ten Schafen und Rindern durch den PK-Verdau fast vollständig zerstört wird und daher durch
diesen Antikörper nur noch schwach oder gar nicht mehr zu detektieren ist. Die Bestimmung
des Quotienten aus der Intensität des MAK P4- und des MAK L42-Signals liefert schließlich
den entscheidenden Parameter des FLI-Tests zur Diskriminierung von Scrapie und BSE bei
kleinen Wiederkäuern (GRETZSCHEL et al. 2005). Vergleichbare Bindungseigenschaften
wie der MAK L42 zeigte auch der MAK 6H4, welcher von STACK et al. (2002) eingesetzt
wurde.
2.2.2.3 Die Proteinase K-Stabilität des pathologischen Prion-Proteins
Die Stabilität gegenüber dem PK-Verdau ist, wenn auch nur eingeschränkt, ein weiteres Cha-
rakteristikum von PrPSc zur Differenzierung von TSE-Stämmen, da diese teilweise sehr deut-
lich variieren kann. So zeigte beispielsweise bei Schafen das PrPSc atypischer Scrapiefälle
eine geringere PK-Stabilität als das PrPSc klassischer Scrapiefälle (BUSCHMANN et al. 2004
a), und auch das PrPSc der Rinder-BSE wies eine vergleichsweise geringere PK-Resistenz auf
(KUCZIUS u. GROSCHUP 1999; SWEENEY et al. 2000). Neben originärem Gehirnmaterial
der jeweiligen Donorspezies wurde auch Maus-passagiertes Gehirnmaterial mittels PK ver-
daut, wobei ein geringer Einfluss der Mauslinie auf die PK-Stabilität nicht auszuschließen
war (KUCZIUS u. GROSCHUP 1999). Für experimentelle Scrapie-Stämme von Hamster und
Maus, deren Differenzierung anhand des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen
Masse des PrPSc nicht gelang, konnte somit eine Unterscheidung anhand der PK-Stabilität
erfolgen (SAFAR et al. 1998; KUCZIUS u. GROSCHUP 1999).
Literaturübersicht 9
Proteinase K
MAK P4 MAK L42
Scrapie-PrPSc
BSE-PrPSc
AS 96 -97
AS 81-89
89-104 shp* 145-163 shp*
145-163 shp*
Abb. 2 Schematische Darstellung des PrPSc von Scrapie und BSE mit den unterschiedlichen Protei-nase K-Schnittstellen (Pfeile). Der MAK L42 detektiert beide Proteine, während der MAK P4 nur Scrapie nicht aber BSE detektieren kann, da er weiter aminoterminal bindet. AS = Aminosäure, BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, MAK = monoklonaler Antikör-per, *Epitope der Antikörper, shp = sheep
2.3 Scrapie bei Schaf und Ziege
Scrapie wurde im Jahr 1732 in Großbritannien bei Schafen und im Jahr 1942 bei Ziegen erst-
malig beschrieben (MC GOWAN et al. 1922; CHELLE et al. 1942). Scrapie ist damit die am
längsten bekannte Erkrankung der TSEn. Sie tritt, mit Ausnahme von Australien und Neusee-
land, weltweit bei Schafen und Ziegen auf und wurde nach einem klinischen Hauptsymptom
„to scrape“ (kratzen) benannt.
2.3.1 Das klinische Bild
Klinisch kann beim Schaf zum einen die pruritische Form, welche durch einen ausgeprägten
Juckreiz und massiven Wollverlust gekennzeichnet ist, auftreten, und zum anderen die paraly-
tische Form, welcher die pruritische Komponente fehlt. Neben einem hypermetrischen Gang,
der zu dem Namen „Traberkrankheit“ führte, sind Kachexie und deutliche Verhaltensände-
rungen zu beobachten. Nach einer Klinikdauer von ca. drei bis vier Monaten kommt es
schließlich zum Tod der Schafe (CAPUCCHIO et al. 2001).
Bei Ziegen sind die Symptome häufig weniger stark ausgeprägt. Wie bei den Schafen sind
v. a. die drei- bzw. vierjährigen Tiere von der Erkrankung betroffen (PARRY 1983; WOOD
et al. 1992). Am häufigsten treten bei klinisch auffälligen Tieren Hyperästhesien, Ataxien und
Pruritus auf, weniger häufig dagegen wurden u. a. Konditionsverlust bei erhaltener Fresslust,
Speicheln und Schwermelken beobachtet (HOURRIGAN et al. 1969; WOOD et al. 1992). Im
Gegensatz zu Schafen zeigen erkrankte Ziegen häufig ein aggressives Verhalten und beißen
10 Literaturübersicht
sich selbst oder ihre Artgenossen (CAPPUCHIO et al. 2001).
2.3.2 Der Einfluss des Genotyps des Prion-Gens
Die Sequenz des PRNP von Schaf und Ziege erreicht eine Homologie von mehr als 99 Pro-
zent (%) und ist stark konserviert (GOLDMANN et al. 1996; BILLINIS et al. 2002). Abwei-
chend vom am häufigsten vorkommenden Genotyp, dem sog. Wildtyp-Genotyp, wurden so-
wohl bei Schafen als auch bei Ziegen zahlreiche Polymorphismen im PRNP beschrieben,
welche einen entscheidenden Einfluss auf die Inkubationszeit und Pathogenese von TSE-
Erkrankungen bei diesen Tierarten haben und zur Ausbildung von Resistenzen führen können.
Die Polymorphismen im PRNP bewirken vermutlich sterische Konformationsänderungen im
Prion-Proteinmolekül, was wiederum die Neigung zur Umfaltung in die pathologische Form
beeinflusst (COHEN et al. 1994; HUANG et al. 1994; PRUSINER et al. 1997). Die wichtig-
sten Polymorphismen beider Tierarten sind in Tab. 2 (S. 11) zusammengefasst.
2.3.2.1 Das Prion-Gen des Schafs
Den größten Einfluss auf die Empfänglichkeit von Schafen für Scrapie besitzen die Poly-
morphismen der Kodons 136, 154 und 171 (HUNTER et al. 1996). Auf dem Kodon 136 kann
dabei für Valin (V) oder Alanin (A), auf dem Kodon 154 für Arginin (R) oder Histidin (H)
und auf dem Kodon 171 für R, Glutamin (Q) oder H kodiert werden (GOLDMANN et al.
1990, 1991; BELT et al. 1995). Die Genotypen der Schafe lassen sich nach ihrem Resistenz-
potential in fünf Genotypklassen einteilen. Die Genotypen werden dabei durch die Abkürzung
der kodierten Aminosäuren für die Kodons 136, 154 und 171 angegeben, die Allele werden
durch einen Schrägstrich getrennt. Die Einteilung der Schafgenotypen erfolgt in Klassen zwi-
schen der Genotypklasse 1 (A136R154R171/ARR), welcher die gegenüber einer Scrapie-
Infektion genetisch resistentesten Tiere zugeordnet sind und der Genotypklasse 5
(A136H154Q171/VRQ, A136R154H171/VRQ, A136R154Q171/VRQ oder V136R154Q171/VRQ), welcher
die hochempfänglichen Tiere angehören, die möglichst nicht zur Zucht verwendet werden
sollten. Vor dem Hintergrund dieser Erkenntnisse versucht man mit Hilfe von Zuchtpro-
grammen (u. a. in England, den Niederlanden, Deutschland u. Frankreich) die Häufigkeit des
V136R154Q171-Allels in den europäischen Schafherden zu verringern und die des A136R154R171-
Allels zu erhöhen, um die genetische Resistenz der Herden gegenüber klassischer Scrapie zu
erhöhen und somit Scrapie in den Herden zu dezimieren bzw. ganz auszulöschen.
Literaturübersicht 11
Tab. 2 Wichtige Polymorphismen auf dem Prion-Gen (PRNP) von Schaf und Ziege. Für die Spezies Ziege sind bekannte Effekte der Polymorphismen aufgeführt.
Trotz der großen genetischen Homologie des PRNP kleiner Wiederkäuer, unterscheiden sich
die Polymorphismen, die speziell bei der TSE-Resistenz der Ziege eine Rolle spielen, teilwei-
se deutlich von denen der Schafe (s. Tab. 2). Für das PRNP der Ziege wurden bisher 42 Po-
lymorphismen beschrieben, wovon neun als sog. stille Mutationen vorliegen (VACCARI et
al. 2009). Im Gegensatz zum Schaf sind bei Ziegen für das Kodon 136 (GOLDMANN et al.
1996) keine Polymorphismen bekannt und ein Q/R-Polymorphismus des Kodon 171 wurde
bisher nur in einer griechischen Ziege beschrieben (BOUZALAS et al. 2010). Die wichtigsten
Polymorphismen befinden sich auf den Kodons 142, 146, 154, 211 und 222. Für Ziegen, die
auf dem Kodon 142 für Methionin (Met) anstatt für Isoleucin (I) kodierten, wurde eine ver-
längerte Inkubationszeit der Scrapie-Erkrankung beschrieben, wobei sowohl die homozygoten
als auch heterozygoten Ziegen empfänglich für Scrapie blieben. Ein vergleichbarer Einfluss
dieses Polymorphismus zeigte sich auch bei mit BSE-infizierten Ziegen (GOLDMANN et al.
1996). Der AS-Austausch von Arginin zu Histidin am Kodon 154, welcher bei Schafen für
einen moderaten Schutz sorgt, führt bei Ziegen zu verlängerten Inkubationszeiten und partiell
12 Literaturübersicht
protektiven Effekten gegenüber Scrapie (BILLINIS et al. 2002; VACCARI et al. 2006;
PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007). Der Asparagin (N)/Serin (S)- bzw. Asparaginsäure
(D)- Polymorphismus auf Position 146 konnte in Europa bisher nur bei Ziegen auf Zypern
beschrieben werden. Die Aminosäuren Serin oder Asparaginsäure bewirken hier eine deutlich
erhöhte Resistenz gegenüber Scrapie in heterozygoter Ausprägung und die Polymorphismen
in homozygoter Ausprägung wurden bisher nur bei gesunden Tieren gefunden
(PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007, 2010). Für den R/Q-Polymorphismus am Kodon
211 konnten BARILLET et al. (2009) erstmals zeigen, dass heterozygote Ziegen eine größere
Resistenz gegen Scrapie besitzen. In Italien sind Arginin und Lysin am Kodon 222 sehr stark
in der Ziegenpopulation verbreitet. Keines der heterozygoten R/K-Tiere war an Scrapie er-
krankt, was ebenfalls auf eine erhöhte Resistenz hindeutet (ACUTIS et al. 2004; VACCARI
et al. 2006). Allerdings wurden in Frankreich Scrapie-positive heterozygote Tiere dieses Ge-
notyps beschrieben, was eine vollständige Resistenz dieses Genotyps ausschließt (BARILLET
et al. 2009). Weitere Polymorphismen wie der AS-Austausch von Serin nach Prolin am Ko-
don 240 konnten bisher nur bei der Ziege beschrieben werden. Die Rolle des Kodons 240 für
die TSE-Empfänglichkeit der Ziege scheint jedoch unbedeutend, denn GOLDMANN et al.
(1996) und PAPASAVVA-STYLIANOU et al. (2007) konnten diesen AS-Austausch nicht
mit der Verlängerung der Inkubationszeit von Scrapie assoziieren. Die Bedeutung der Er-
kenntnis von BARILLET et al. (2009), dass eine erhöhte Resistenz der heterozygot am Ko-
don 142 (Met/I) kodierenden Ziegen ausschließlich in Verbindung mit homozygoter Ausprä-
gung des Prolin am Kodon 240 zu finden war, bleibt dagegen noch zu klären.
2.3.3 Übertragungswege der Scrapie bei Schaf und Ziege
Scrapie ist infektiös und kontagiös. Die Übertragung von Scrapie auf Schaf und Ziege erfolgt
unter natürlichen Voraussetzungen auf dem oralen Weg. Experimentell sind u. a. auch die
intrazerebrale und die intraperitoneale Infektion möglich. Adulte Schafe infizieren sich auf
dem natürlichen Weg v. a. durch die Aufnahme (oral) der infektiösen Nachgeburt, welche die
Weiden kontaminiert, oder durch den direkten Kontakt zu infizierten Tieren (PATTISON
1972, 1974; HADLOW et al. 1982; HOURRIGAN u. KLINGSPORN 1996; RYDER et al.
2004). Bedingt durch eine hohe Stabilität des PrPSc in der Umwelt ist ein Ansteckungsrisiko
über Jahre gegeben (BROWN u. GAJDUSEK 1991; WIGGINS 2009).
Literaturübersicht 13
Die maternale Übertragung von Scrapie auf die Lämmer konnte schon sehr früh belegt wer-
den (PATTISON 1972, 1974). Ob es sich bei dieser vertikalen Übertragung aber um eine in-
trauterine oder perinatale Infektion der Lämmer handelt, ist bis heute ungeklärt. Im fetalen
Trophoblasten der Plazenta Scrapie-positiver Schafe konnte PrPSc bereits nachgewiesen wer-
den (RACE et al. 1998; ANDREOLETTI et al. 2002), wobei sich die PrPSc–Ablagerungen
ausschließlich in den Plazenten von Lämmern eines empfänglichen Genotyps befanden, was
darauf hindeutet, dass die Genotypen der Nachkommen Einfluss auf den Übertragungserfolg
von Scrapie haben (ANDREOLETTI et al. 2002; TUO et al. 2002; ALVERSON et al. 2006;
LACROUX et al. 2007). Allerdings konnte PrPSc bislang weder im Fetus selbst noch im Ute-
rus der Muttertiere nachgewiesen werden (FOOTE et al. 1993; TUO et al. 2002; WANG et
al. 2001), weshalb die Ansteckung der Lämmer im perinatalen Zeitraum wahrscheinlicher
erscheint (ANDREOLETTI et al. 2002).
Eine weitere Ansteckungsquelle im peripartalen Zeitraum stellt die Milch der Schafe dar. So
gelang der PrPSc-Nachweis bereits in der Milch subklinischer Tiere (KONOLD et al. 2008 b;
LACROUX et al. 2008; MADDISON et al. 2009), und die Übertragung von Scrapie auf
Schaflämmer mit der Milch konnte ebenfalls gezeigt werden (KONOLD et al. 2008 b). PrPSc–
Ablagerungen waren sowohl im Euter als auch in den Lymphonodi mammarii detektierbar
(LIGIOS et al. 2005; LACROUX et al. 2008). HUNTER et al. (2002) gelang es, Scrapie mit-
tels Blut auf Schafe zu übertragen. LIGIOS et al. (2005) und SISÓ et al. (2006) wiesen PrPSc
in der Niere von Schafen nach und VASCELLARI et al. (2007) und MADDISON et al.
(2010) gelang der PrPSc-Nachweis in der Speicheldrüse und in Sekreten der Maulhöhle von
Schafen. Weiterhin konnten KARIV-INBAL et al. (2006) PrPSc im Urin von experimentell
infizierten Hamstern nachweisen.
Ziegen infizieren sich vorrangig über den direkten Kontakt zu Schafen (HOURRIGAN et al.
1969) oder durch die Nutzung von zuvor durch Schafe beweidete Flächen. Eine entscheiden-
de Rolle spielt dabei vermutlich die Kontamination der Umwelt durch infektiöse Nachge-
burtsanteile (Plazenta). Auch wenn PrPSc bereits in der Mamma von Ziegen nachgewiesen
werden konnte (GONZÁLEZ et al. 2010 a), was für eine Übertragung von Scrapie mit der
Milch spricht, gelang der PrPSc-Nachweis bisher weder in den Nieren noch in den Speichel-
drüsen von Ziegen.
14 Literaturübersicht
2.3.4 Die Pathogenese der Scrapie
Auf welchem Weg das PrPSc ins Gehirn gelangt, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Nach
der oralen Aufnahme erfolgt zumeist die Akkumulation des PrPSc im darmassoziierten
lymphatischen Gewebe (gut associated lymphoid tissue, GALT). Danach kommt es zur Aus-
breitung im nicht darmassoziierten lymphatischen Gewebe und im peripheren Nervensystem
(PNS), bis PrPSc schließlich auch im zentralen Nervensystem (ZNS) nachweisbar ist. Es wird
vermutet, dass die Verbreitung des PrPSc dabei sowohl auf dem lymphatischen und hämato-
genen als auch auf dem neuronalen Weg erfolgt.
2.3.4.1 Die Pathogenese der Scrapie im Schaf
Beim Schaf akkumuliert das PrPSc im Verlauf der Pathogenese zuerst in der Tonsille und den
Peyer` Platten (PP) des Darms, wobei die PP des Ileums als erstes betroffen waren und daher
auch als primäre Eintrittspforte für Scrapie diskutiert wurden (ANDREOLETTI et al. 2002;
RYDER et al. 2009). Nachfolgend kann sich Scrapie innerhalb von drei bis sechs Monaten
auf das gesamte GALT des Magen-Darm-Trakts (MDT) ausbreiten und akkumuliert schließ-
lich in den tributären Gebieten des GALT wie dem Lymphonodus retropharyngealis medialis
(Ln. retroph.) und den Lymphonodi (Lnn.) mesenteriales (RYDER et al. 2009) sowie in einem
Großteil weiterer peripherer Lymphknoten und der Milz (JEFFREY et al. 2001 b; VAN
KEULEN et al. 2002). Ob die Beteiligung des GALT an der Pathogenese allerdings grund-
sätzlich notwendig ist, bleibt zu bezweifeln, da bei klinisch an Scrapie erkrankten Schafen
zwar Ablagerungen im ZNS detektiert werden konnten, das LRS dieser Tiere aber nicht be-
troffen war (VAN KEULEN et al. 1996; ANDREOLETTI et al. 2000; JEFFREY et al. 2002).
Nach der Akkumulation und Replikation im LRS konnte PrPSc auch im enterischen Nerven-
system (ENS) nachgewiesen werden, wobei ausgehend vom ENS des Ileums und Duodenums
schließlich auch weiter kranial bzw. kaudal im Magen-Darm-Trakt gelegene Anteile des ENS
PrPSc-positiv getestet wurden (VAN KEULEN et al. 1999, 2000; ANDREOLETTI et al.
2000). Es wird daher zum einen vermutet, dass Nervenfasern, welche die Follikel innervieren,
das PrPSc auf neuronalem Weg zum ENS und schließlich weiter ins ZNS transportieren
(BEEKES u. MCBRIDE 2000; RACE et al. 2000). Zum anderen wird der direkte Transport
des PrPSc über Nervenendigungen der Tunica mucosa ins ENS diskutiert (HEGGEBØ et al.
2003; JEFFREY et al. 2006 a). Anschließend könnte Scrapie über den #ervus (N.) vagus als
Literaturübersicht 15
parasympathischen Nerven und/oder den sympathischen #. splanchnicus ins Rückenmark
aufsteigen, was den Nachweis von PrPSc im #ucleus (Ncl.) parasympathicus nervi vagi
(DMNV) sowie im Ganglion (Ggl.) coeliacum (es enthält sympathische und parasympathi-
sche Faseranteile) und in den sympathischen Wurzelzellen der intermediolateralen Säule des
Rückenmarks erklären würde (VAN KEULEN et al. 2000). Neben der neuronalen Ausbrei-
tung ist zusätzlich die Ausbreitung auf dem hämatogenen Wege nicht auszuschließen. Für
diesen alternativen Weg spricht einerseits der Nachweis von PrPSc-Ablagerungen in lymphati-
schen Geweben, welche nicht zum tributären Gebiet des Eintrittsortes von PrPSc gehören, und
in der Milz, die keine afferenten Lymphe erhält, sowie andererseits der Nachweis der Über-
tragbarkeit von Scrapie durch das Blut infizierter Schafe (VAN KEULEN et al. 2000;
HUNTER et al. 2002; RYDER et al. 2009).
2.3.4.2 Die Pathogenese der Scrapie in der Ziege
Über die Pathogenese von Scrapie bei Ziegen ist bisher nur vergleichsweise wenig bekannt. In
den 60-iger Jahren zeigten PATTISON u. MILLSON (1960, 1962) in Übertragungsversuchen
dass eine Vielzahl von Gewebeproben, u. a. auch die Milz, das Pankreas und die Leber von
intrazerebral mit Scrapie infizierten Ziegen nach der intrazerebralen Inokulation in caprine
Rezipienten infektiös waren. Nach der intraperitonealen Inokulation von Ziegen konnte Infek-
tiosität zuerst im LRS, später im MDT und schließlich im Rückenmark und im Hirnstamm
nachgewiesen werden (HADLOW et al. 1974). In aktuelleren Untersuchungen ließ dann der
Nachweis von PrPSc im lymphatischen und neuronalen Gewebe des MDT sowie im darm-
unabhängigen LRS und dem ZNS der Ziegen Ähnlichkeiten zur Pathogenese von Scrapie bei
Schafen erkennen. Es gelang, wenn auch nur vereinzelt, der Nachweis von PrPSc in den PP
des Ileums und Jejunums sowie zusätzlich im ENS von Ziegen. Eine breite Beteiligung des
LRS konnte ebenfalls nachgewiesen werden, wobei vorrangig die Tonsille und der Ln.
retroph. betroffen waren. Mit zunehmender Ausbreitung des PrPSc im LRS wurde auffallend
häufig auch das lymphatische Gewebe des Rektums PrPSc-positiv getestet (VALDEZ et al.
2003; GONZÁLEZ et al. 2009, 2010 a).
2.3.5 Möglichkeiten der prämortalen Diagnostik von Scrapie bei Schaf und Ziege
Die prämortale Diagnostik ermöglicht die Detektion und Tilgung präklinischer Tiere. Eine
Methode der prämortalen Detektion von TSEn stellt die Untersuchung von Bioptaten lympha-
16 Literaturübersicht
tischer Gewebe wie der Tonsille (SCHREUDER et al. 1996, 1998; Jeffrey et al. 2001 b), des
3. Augenlids (O´ROURKE et al. 1998, 2000; THURING et al. 2000) oder aus dem Rektum
(GONZÁLEZ et al. 2005) dar, welche mittels immunhistochemischer Methoden oder im
Westernblot untersucht werden. Aussagekräftig für die diagnostische Fragestellung sind dabei
jedoch lediglich positive Ergebnisse. So konnte Scrapie beispielsweise bei 97 % von klinisch
auffälligen Schafen mittels Rektalbiopsie festgestellt werden. Von präklinischen Tieren konn-
ten außerdem 86 % als PrPSc-positiv ermittelt werden, wobei die positive Diagnostik teilweise
bereits nach etwa der Hälfte der Inkubationszeit gelang (GONZÁLEZ et al. 2006, 2008).
Vergleichbare Ergebnisse konnten auch mit der Untersuchung von Tonsillenbioptaten erzielt
werden (SCHREUDER et al. 1996, 1998).
Bei Ziegen akkumuliert PrPSc ebenfalls frühzeitig in der Tonsille, dem Ln. retroph. sowie dem
lymphatischen Gewebeanteil der rektoanalen Mukosa (RAMALT), wobei letzterer weniger
häufig betroffen war. Dabei stieg mit der Zahl betroffener Gewebe des LRS auch die Wahr-
scheinlichkeit des Nachweises von PrPSc-Ablagerungen im Rektum. Bisher gelang der PrPSc–
Nachweis in Rektumbioptaten und rektalen Sektionsproben von Ziegen aber äußerst unregel-
mäßig und, verglichen mit den Ergebnissen bei Schafen, mit geringerer Erfolgsrate
(GONZÁLEZ et al. 2009).
Eine alternative Untersuchungsmethode könnte die Methode der zellfreien Konversion, die
protein misfolding cyclic amplification (PMCA)-Methode darstellen, welche sich zunutze
macht, dass geringe und vormals nicht detektierbare PrPSc–Mengen die Umfaltung von appli-
ziertem PrPc katalysieren. Der Anteil des PrPSc nimmt dabei zu und wird u. a. mittels Immu-
noblot detektiert (KOCISKO et al. 1994; SABORIO et al. 2001). Nach ersten erfolgreichen
Analysen mit Blut, Urin oder Liquor cerebrospinalis von erkrankten Hamstern (CASTILLA
et al. 2005; SAÁ et al. 2006; ATARASHI et al. 2007, 2008), wiesen THORNE u. TERRY
(2008) PrPSc erstmals auch im Blut erkrankter Schafe nach. Dabei kam es aber zu spontanen
Umfaltungen des PrPc der Negativkontrolle, weshalb die PMCA methodisch als noch nicht
ausgereift gilt und noch weiterer Optimierung bedarf.
2.4 Die Histopathologie von Scrapie
Bei an TSE erkrankten Tieren weisen die Gehirne makroskopisch keine Veränderungen auf
(MARSH u. KIMBERLIN 1975). In der Histopathologie zeigen sich jedoch in meist bilateral
Literaturübersicht 17
symmetrischer Ausprägung die drei wesentlichen pathomorphologischen Merkmale vakuoläre
Veränderungen, neuronale Degeneration und Gliose (v. a. Astrozytose). Bei den vakuolären
Veränderungen wird zwischen der vakuolären Degeneration der grauen Substanz und den
einzelnen oder multiplen Vakuolisierungen in den Perikarya der Neuronen unterschieden
(s. Abb. 3). Alle pathomorphologischen Veränderungen zusammen ergeben schließlich das
pathognomonische Bild. Bei klassischer Scrapie sind histopathologische Veränderungen v. a.
im #cl. parasympathicus n. vagi (DMNV) der Medulla oblongata zu finden, weshalb die
Diagnostik vorrangig auf diesen Bereich des ZNS zielt (WOOD et al. 1997).
Abb. 3 Spongiforme Veränderungen des Neuropils und Vakuolisierung einer Nervenzelle (Pfeil) im Obex einer an Scrapie erkrankten Ziege, H.-E.-Färbung, 10-er Objektiv, Balken = 40 µm.
Die neuropathologischen Veränderungen können in ihrem Ausprägungsgrad und der neuro-
anatomischen Verteilung je nach Scrapie-Stamm oder, wie bei Schafen, auch in Abhängigkeit
vom Genotyp und anderen individuellen Faktoren variieren (WOOD et al. 1997; ZLOTNIK
1958; LIGIOS et al. 2002; BEGARA-MCGORUM et al. 2002). Im Mausmodell dagegen
ergeben sich nach der Passagierung von Scrapie-positivem Material und der semiquantitativen
Bewertung der vakuolären Veränderungen in den verschiedenen Hirnregionen der Mäusege-
hirne stammspezifische Läsionsprofile, anhand derer unter Berücksichtigung der Inkubations-
zeiten die Differenzierung von TSE-Stämmen möglich ist (FRASER u. DICKINSON 1968).
Das Läsionsprofil wird dabei u. a. vom Mausstamm und vom Genotyp des Donors beeinflusst
(FRASER 1976).
2.5 Scrapie in der Immunhistochemie
Immunhistochemisch können PrPSc–Ablagerungen in den betroffenen Zellen und Geweben
der verschiedenen Organe detektiert werden. Anhand ihrer Reaktionsmuster (profiling) und
18 Literaturübersicht
ihrer Detektierbarkeit durch verschiedene Antikörper (epitope mapping) lassen sich die PrPSc–
Ablagerungen u. a. im ZNS näher charakterisieren. So konnten für Scrapie zahlreiche Reakti-
onsmuster der PrPSc-Ablagerungen beschrieben werden (MILLER et al. 1993; VAN
KEULEN et al. 1995; FOSTER et al. 1996; HARDT et al. 2000; RYDER et al. 2001), wel-
che GONZÁLEZ et al. (2002, 2003) zu einem Profil (profiling) zusammen gefasst haben, in
dem extrazelluläre (Neuropil-, Gliazell-, Ependymzell- oder Endothelzell-assoziiert) und in-
trazelluläre Verteilungsmuster von PrPSc (intraneuronal, intraastrozytär und intramikroglial)
Berücksichtigung fanden. Bei Schafen zeigten sich typische Reaktionsmuster unabhängig von
der Rasse und dem Genotyp der Tiere, waren aber weitgehend vom TSE-Stamm abhängig
(JEFFREY et al. 2001 a; GONZÁLEZ et al. 2002, 2003, 2010 b). Intraneuronale PrPSc-
Ablagerungen korrelierten am häufigsten mit dem Auftreten von klinischen Symptomen
(GONZÁLEZ et al. 2002, 2003). Mit an unterschiedliche AS-Sequenzen des Prion-Proteins
bindenden Antikörpern war es außerdem möglich, verschiedene TSE-Stämme zu detektieren
und auf diese Art voneinander zu differenzieren. Bei diesem sog. epitope mapping wurde ext-
razelluläres PrPSc, welches als vollständiges Protein vorlag (JEFFREY et al. 1998), durch
andere Antikörper detektiert als beispielsweise intrazelluläres PrPSc, welches je nach TSE-
Stamm und zellabhängig unterschiedlich stark einer partiellen Proteolyse ausgesetzt war. Auf
diese Art war es möglich, natürliche ovine Scrapie-Fälle von oviner BSE und dem experimen-
tellen mauspassagierten Scrapie-Stamm SSBP/1 zu unterscheiden (JEFFREY et al. 2001 a,
2003; MARTIN et al. 2005). Bei Ziegen zeigten dagegen BSE, SSBP/1 und CH1641 überra-
schend ähnliche Phänotypien. Natürlich vorkommende caprine Scrapie-Fälle wiesen eine gro-
ße Variabilität auf, weshalb auch bei Ziegen, ähnlich wie bei Schafen, die Existenz einer
Vielzahl von Scrapie-Stämmen vermutet wird (JEFFREY et al. 2006 b).
2.6 Atypische Scrapie bei Schaf und Ziege
Atypische Scrapie wurde erstmals 1998 in norwegischen Schafen nachgewiesen
(BENESTAD et al. 2003) und unterschied sich neben veränderten biochemischen und patho-
genetischen Eigenschaften von klassischer Scrapie v. a. darin, dass mit Tieren zwischen drei
bis zu sechs Jahren ältere und nur einzelne Tiere einer Herde betroffen waren. Atypische
Scrapie konnte bei Schafen bereits in einigen Ländern der Europäischen Union
(EUROPÄISCHE UNION 2008), in der Schweiz (SEUBERLICH et al. 2007) und auf den
Falklandinseln (EPSTEIN et al. 2005) nachgewiesen werden. Bei Ziegen sind u. a. Fälle in
Literaturübersicht 19
Frankreich, Spanien, in der Schweiz und Italien bestätigt worden (EUROPÄISCHE UNION
2008). Die Inzidenz von atypischer Scrapie ist deutlich geringer als die der klassischen Form
(BENESTAD et al. 2003; GAVIER-WIDEN et al. 2004; SOFIANIDIS et al. 2008) und kli-
nisch sind v. a. Ataxien, Kachexie, Schreckhaftigkeit und ein stark reduziertes Allgemeinbe-
finden zu beobachten (BENESTAD et al. 2003, 2008; ONNASCH et al. 2004; EPSTEIN et
al. 2005; KONOLD et al. 2007). Diese Scrapie-Form wurde auffälligerweise vorrangig in für
klassische Scrapie resistenten Schafen des A136R154R171-Genotyps nachgewiesen
(BUSCHMANN et al. 2004 b; LE DUR et al. 2005; DE BOSSCHERE et al. 2007) sowie bei
Ziegen, welche auf dem Kodon 154 für Histidin kodierten und daher als resistenter gegenüber
klassischer Scrapie eingestuft wurden (BILLINIS et al. 2002; VACCARI et al. 2006;
PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007; COLUSSI et al. 2008).
Das PrPSc atypischer Scrapie-Fälle ist wesentlich empfindlicher gegen den PK-Verdau als das
PrPSc der klassischen Form (BUSCHMANN et al. 2004 b). Der Verdau erfolgt sowohl am N-
terminalen, als auch am C-terminalen Ende (KLINGEBORN et al. 2006), was sich im
Westernblot durch ein undeutliches Bandenmuster der di-, mono- und ungykosylierten PrPSc-
Banden zwischen 30 und 18 kDa (HAYASHI et al. 2005) sowie durch zusätzliche Banden bei
11-12 kDa (BENESTAD et al. 2003; GRETZSCHEL et al. 2006; ARSAC et al. 2007) oder
sieben bis acht kDa (KLINGEBORN et al. 2006; NENTWIG et al. 2007) zeigt. Immunhisto-
chemisch sind die PrPSc-Ablagerungen der atypischen Form, im Gegensatz zu denen der klas-
sischen Scrapie, nicht im DMNV des Obex zu finden (BENESTAD et al. 2008). Vielmehr
sind vorrangig die Cortices des Zerebellums und des Zerebrums betroffen, während PrPSc-
Ablagerungen in der Obexregion, wenn überhaupt, vorwiegend in der weißen Substanz und
dem #cl. tractus spinalis nervi trigemini nachweisbar sind (BENESTAD et al. 2003, 2008;
ORGE et al. 2004; NENTWIG et al. 2007; SEUBERLICH et al. 2007). Im LRS wurde PrPSc
bisher nicht nachgewiesen, was einen weiteren Unterschied zur klassischen Scrapie darstellt,
und zusätzlich die prämortale Diagnostik anhand von Biopsien des lymphoretikulären Gewe-
bes verhindert. Es wird vermutet, dass diese atypische Form ohne Beteiligung des LRS ent-
weder direkt ins Gehirn gelangt, oder die Folge einer spontan auftretenden TSE-Erkrankung
ist (BENESTAD et al. 2003, 2008; BUSCHMANN et al. 2004 b; SEUBERLICH et al. 2007).
20 Literaturübersicht
2.7 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder
BSE wurde erstmals 1986 bei englischen Rindern beschrieben, welche durch Hyperästhesien,
Koordinationsstörungen im Gangbild bis hin zu zunehmend aggressivem Verhalten oder
Ängstlichkeit klinisch auffällig wurden (WELLS et al. 1987). Der für Scrapie typische Pruri-
tus konnte an BSE-kranken Rindern dagegen nicht beobachtet werden. Die Ursache für BSE
fand man in der Verfütterung von ungenügend vorbehandelten tierischen Eiweißen an Rinder
(WILESMITH et al. 1991). BSE stellt eine Zoonose dar und verursacht beim Menschen die
Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (BRUCE et al. 1997).
In experimentellen Pathogenesestudien zeigten die Rinder nach oraler Infektion und nach In-
kubationszeiten von ca. 24 Monaten erste PrPSc–Ablagerungen im ZNS (HOFFMANN et al.
2007). Eine Rolle für die frühe Phase der Pathogenese könnten dabei die PP des Ileums spie-
len, welche bereits vier Monate post inoculationem positiv getestet werden konnten
(HOFFMANN et al. 2011), aber auch in den PP des Jejunums wurde eine geringe Infektiosi-
tät nachgewiesen. Im Gegensatz zur Scrapie-Erkrankung der kleinen Wiederkäuer ist bei Rin-
dern das LRS, abgesehen von den PP des Magen-Darm-Trakts, kaum betroffen. Lediglich in
der Tonsille konnte in der frühen Phase der Pathogenese Infektiosität nachgewiesen werden
(WELLS et al. 2005; ESPINOSA et al. 2007). Der Pathogeneseweg von BSE beim Rind be-
schränkt sich somit im Wesentlichen auf neuronales Gewebe (BUSCHMANN u.
GROSCHUP 2005 a). Ausgehend von den PP des Darms wird dabei zum einen der direkte
Weg des PrPSc über sympathische und parasympathische Fasern in den Hirnstamm, und zum
anderen über postganglionäre sympathische Fasern und das Rückenmark ins Gehirn diskutiert
(HOFFMANN et al. 2007; BALKEMA-BUSCHMANN et al. 2011; KAATZ et al. 2011).
2.7.1 Die Histopathologie der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie der Rinder
Bei der bovinen BSE sind in ähnlicher Weise wie bei klassischer Scrapie einzelne oder mul-
tiple Vakuolisierungen der neuronalen Perikarya und spongiforme Veränderungen im Neuro-
pil der grauen Substanz ausgeprägt, wobei letztere häufiger zu sehen sind (WELLS et al.
1989). Eine reaktive Aktivierung der Gliazellen tritt ebenfalls auf, wobei v. a. die Astrozyten
betroffen sind (WELLS et al. 1987). Im Unterschied zu Scrapie sind die vakuolären Verände-
rungen am intensivsten im #cl. tractus solitarii und #cl. tractus spinalis n. trigemini der
Obexregion (Stammhirn) ausgeprägt, der DMNV ist vergleichsweise weniger stark betroffen
Literaturübersicht 21
(WELLS et al. 1989). Das Läsionsprofil von BSE beim Rind ist, wie durch die Untersuchung
von hunderten BSE-Fällen festgestellt wurde, unabhängig von der Rasse des Rindes, der Ap-
plikationsart und Dosierung der infektiösen Substanz oder vom PRNP-Genotyp und weitge-
hend einheitlich (SIMMONS et al. 1996). In diesem Punkt unterscheidet sich die BSE des
Rindes deutlich von Scrapie und scheint lediglich einem einzigen Stamm anzugehören.
2.8 Die atypische Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder
Lange Zeit wurde BSE einem einzigen stabilen Stamm zugeordnet, da es seine konstanten
Eigenschaften auch nach der Übertragung auf andere Spezies beibehielt (COLLINGE et al.
1996; BRUCE et al. 1997; HILL et al. 1997; STACK et al. 2002). Im Jahr 2004 traten jedoch
sog. atypische BSE-Fälle bei italienischen und französischen Rindern auf. Die proteinbio-
chemischen Eigenschaften des PrPSc dieser BSE-Fälle unterschieden sich stark von dem der
klassischen BSE-Form (BIACABE et al. 2004; CASALONE et al. 2004). Bei einer der atypi-
schen BSE-Formen dominierte nach dem PK-Verdau die monoglykosylierte Form des PrPSc
im Glykosylierungsmuster und die molekulare Masse der unglykosylierten Form war wesent-
lich kleiner als bei klassischer BSE beschrieben. Dieser Typ wurde als L-Typ („low“) be-
zeichnet. Vergleichbar mit der sporadischen CJK des Menschen, zeigten Rinder, die am L-
Typ erkrankten, Plaques im ZNS und das PrPSc dieser Form der atypischen BSE wies ähnli-
che biochemische Eigenschaften auf wie das PrPSc der sporadischen CJK. Ein Zusammenhang
zwischen beiden Erkrankungen blieb aber ungeklärt (CASALONE et al. 2004). Eine zweite
atypische BSE-Form zeigte das Glykosylierungsmuster von klassischer BSE mit einer über-
repräsentierten diglykosylierten Form des PrPSc und wies eine wesentlich größere molekulare
Masse der unglykosylierten Form auf als klassische BSE, weshalb dieser Typ als H-Typ
(„high“) bezeichnet wurde. Das histopathologische Bild der atypischen BSE wich ebenso vom
bekannten Muster der klassischen BSE ab wie die Verteilung von immunhistochemisch nach-
gewiesenen PrPSc–Ablagerungen. So war der Hirnstamm (inkl. DMNV) auffallend wenig
betroffen. Atypische BSE wurde bisher v. a. bei älteren Rindern u. a. in Frankreich, Italien,
Deutschland und Polen nachgewiesen (BIACABE et al. 2004; CASALONE et al. 2004;
POLAK et al. 2004; BUSCHMANN et al. 2006).
2.9 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie bei Schaf und Ziege
Nach dem Auftreten von klassischer BSE in Rindern gelang recht früh die experimentelle
22 Literaturübersicht
Übertragung von BSE auf Schaf und Ziege (FOSTER et al. 1993), weshalb das Vorkommen
natürlicher BSE-Fälle bei diesen Tierarten schon zu diesem Zeitpunkt vorhersehbar war. Im
Jahr 2005 wurde schließlich durch ELOIT et al. der erste natürlich vorkommenden BSE-Fall
in einer französischen Ziege beschrieben, und im Rahmen retrospektiver Untersuchungen
älterer TSE-Fälle konnte eine zweite Ziege aus Schottland BSE-positiv getestet werden
(EUROPEAN FOOD SAFETY AGENCY 2009). Bei Schafen konnte bis heute kein natürlich
vorkommender BSE-Fall bestätigt werden.
Nach experimenteller Infektion von Schafen mit BSE zeigten diese nach Inkubationszeiten,
die zwischen ca. 500 und 2000 Tagen betragen konnten, Pruritus und u. a. Tremor sowie Ata-
xien mit einem stark progressiven Verlauf, was zu einem sich verschlechternden Allgemein-
zustand und zu einem mitunter raschen Versterben der Tiere über Nacht führte (FOSTER et
al. 2001; JEFFREY et al. 2001 c; BELLWORTHY et al. 2005 b; KONOLD et al. 2008 a).
Die Krankheitsdauer variierte stark zwischen einem und 94 Tagen (HOUSTON et al. 2003).
Wie bereits für Scrapie beschrieben, konnte auch bei der BSE-Infektion ein Einfluss des
PRNP-Genotyps festgestellt werden. So ist der A136R154R171-Genotyp auch bei BSE mit er-
höhter Resistenz assoziiert (BAYLIS et al. 2002; HOUSTON et al. 2003). Nach oraler Infek-
tion konnte PrPSc, abgesehen von den PP des Magen-Darm-Trakts, u. a. in der Milz und in
zahlreichen Lymphknoten wie dem Ln. retroph. und in der Tonsille nachgewiesen werden,
was dem Verteilungsbild von Scrapie beim Schaf entspricht (BELLWORTHY et al. 2005 b;
VAN KEULEN et al. 2008). Die Übertragung auf Schaflämmer gelang nach oraler Inokulati-
on der Muttertiere und unter weitgehend natürlicher Haltung der Tiere. Es bleibt aber abzu-
klären, auf welchem Weg dabei die Ansteckung erfolgte (BELLWORTHY et al. 2005 a). Die
Übertragung von BSE durch Blut infizierter Schafe konnte zudem durch HOUSTON et al.
(2000) und HUNTER et al. (2002) gezeigt werden.
Ziegen, welche bei experimentellen Untersuchungen oral mit BSE infiziert wurden, erkrank-
ten nach Inkubationszeiten zwischen 941 und 1501 Tagen (FOSTER et al. 1993) und zeigten
eine Krankheitsdauer von sechs Tagen bis zu drei Wochen (FOSTER et al. 2001). Nach intra-
zerebraler oder subkutaner Infektion wurde eine Krankheitsdauer von sieben bis zu 60 Tagen
beschrieben. Klinisch wiesen diese Ziegen vorwiegend Ataxien, Lethargie und zunehmenden
Gewichtsverlust auf sowie einen vergleichsweise gering ausgeprägten Pruritus. Die vertikale
Übertragung von BSE war weder durch Embryotransfer, noch durch den Paarungsakt auf das
Literaturübersicht 23
männliche Tier oder intrauterin auf die Lämmer möglich (FOSTER et al. 1993, 1999, 2001).
2.10 Die Diagnostik von Boviner Spongiformer Enzephalopathie und Scrapie
Die Diagnostik von BSE und Scrapie erfolgt in der Europäischen Union (EU) auf Grundlage
der Verordnung (EG) 999/2001. Nach einer Häufung von BSE-Fällen bei Rindern im Verei-
nigten Königreich in den Jahren 1992/93 erreichten die Fallzahlen in den Jahren 2001/02 in
Deutschland und in den anderen EU-Mitgliedsstaaten einen Höhepunkt. Die im Rahmen der
Verordnung (EG) 999/2001 ergriffenen Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE, die vorrangig
das Verbot der Verfütterung tierischen Eiweißes an Säugetiere, die Definition und Entfernung
spezifizierter Risikomaterialien sowie großflächige BSE-Schnelltestuntersuchungen beinhal-
teten, ließen in den darauf folgenden Jahren die Anzahl von BSE-Fällen kontinuierlich sinken,
so dass seit Anfang 2009 in Deutschland und 14 weiteren EU-Mitgliedsstaaten das Testalter
für Schlachtrinder und Risikotiere (gefallenen und not- bzw. krank geschlachtete Rinder) von
30 Monaten auf 48 Monate angehoben werden konnte. Aktuell sanken die BSE-Fallzahlen in
Deutschland auf zwei BSE-Fälle im Jahr 2009, und im Jahr 2010 konnte kein einziger Fall
nachgewiesen werden. Eine weitere Anhebung des Testalters für Schlachtrinder, die in aus-
gewählten EU-Ländern geboren worden sind, auf 72 Monate erfolgte schließlich im Juli 2011
(BSE-Untersuchungsverordnung 2002). Von Schafen und Ziegen müssen seit 2002 in den
EU-Mitgliedsstaate alle über 18 Monate alten Tiere stichprobenartig mittels TSE-Schnelltest
untersucht werden, um die Inzidenzen von TSE-Erkrankungen bei kleinen Wiederkäuern ab-
schätzen zu können. Für die Untersuchung auf das PrPSc der BSE bzw. Scrapie mittels
Schnelltests, wird aus dem Bereich des Obex und zusätzlich für die Detektion etwaiger atypi-
scher Fälle aus dem Zerebellum entnommenes Probenmaterial verwendet (GROSCHUP u.
STOLZE 2002; BUSCHMANN et al. 2004 c; BUSCHMANN u. GROSCHUP 2005 b). Für
die Schnelltestung in den staatlichen und privaten Labors sind dafür zur Zeit (Stand Januar
2011) für BSE neun bzw. für Scrapie drei Schnelltests zugelassen (Verordnung (EU)
956/2010), deren reaktive Ergebnisse zur abschließenden Bestätigung an das Nationale Refe-
renzlabor (NRL) für Transmissible Spongiforme Enzephalopathien am Friedrich-Loeffler-
Institut (FLI) auf der Insel Riems gesendet werden. Dort erfolgt die weitere diagnostische
Abklärung mittels von der Office International des Epizooties (O.I.E.) zugelassener Bestäti-
gungstests (ANONYM 2009, 2010). Als bestätigende Methoden gelten histopathologische
und immunhistochemische Untersuchungen, der Immunoblot, der Nachweis charakteristi-
24 Literaturübersicht
scher Fibrillen mittels Elektronenmikroskopie sowie für BSE ein weiterer TSE-Schnelltest.
Werden TSE-Fälle von Schafen und Ziegen bestätigt, so muss zum einen von allen positiv
getesteten Schafen der Genotyp des Prion-Proteins bestimmt werden, und zum anderen seit
Januar 2005 bei allen klassischen TSE-Fällen ein differentialdiagnostischer Test zur Unter-
scheidung von BSE und Scrapie durchgeführt werden (Verordnung (EG) 36/2005).
In Deutschland findet sich eine vergleichsweise geringe Scrapie-Inzidenz bei Schafen, auch
wenn die Zahl der Scrapie-Fälle und v. a. der atypischen Scrapie-Fälle mit der Intensivierung
der Überwachung ab 2002 deutlich angestiegen sind. Es konnte in der BRD bis zum heutigen
Tage kein Scrapie-Fall bei einer Ziege nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu stellt das
Vorkommen von Scrapie bei Ziegen in anderen europäischen Ländern ein wesentlich größeres
Problem dar (s. Abb. 4).
Abb. 4 Scrapiefälle (cases) bei Ziegen von 2002 bis 2007 in den 27 Mitgliedstaaten der Europäi-schen Union sowie Island, der Schweiz und Norwegen (Zitat aus VACCARI et al. 2009).
Literaturübersicht 25
2.11 Zusammenfassende Darstellung
In Tab. 3 sind die wichtigsten Informationen des Literaturteils zu den TSEn von Rind, Schaf
und Ziege in Kurzform aufgelistet.
Tab. 3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien von Schaf, Ziege und Rind mit Angaben zur Klinik, Pathogenese und zu den betroffenen Gebieten im zentralen Nervensystem
LRS = Lymphoretikuläres System, GALT = gut-associated lymphatic tissue, ENS/PNS = enterisches/peripheres Nervensystem, ZNS = zentrales Nervensystem, Ncl. tr. sp. n. trig. = Nucleus tractus spinalis nervi trigemini, Ncl. tr. sol. = Nucleus tractus solitarii, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, o. A. = ohne Angabe 1 ANONYM 2009, 2010 9 GONZÁLEZ et al. 2009, 2010 a 17 ONNASCH et al. 2004 2 BELLWORTHY et al. 2005 b 10 HOURRIGAN et al. 1969 18 SEUBERLICH et al. 2007 3 BENESTAD et al. 2003 11 HOUSTON et
al. 2000 19 VALDEZ et al. 2003
4 CAPUCCHIO et al. 2001 12 HUNTER et al. 2002 20 VAN KEULEN et al. 2008 5 FOSTER et al. 1993 13 JEFFREY et al. 2001 c 21 WELLS et al. 1987 6 FOSTER et al. 2001 14 KONOLD et al. 2007 22 WOOD et al. 1992 7 GOLDMANN et al. 1994 15 KONOLD et al. 2008 a 8 GOLDMANN et al. 1996 16 NENTWIG et al. 2007
23 ANDREOLETTI et al. 2000, VAN KEULEN et al. 2000, 2002, RYDER et al. 2009 24 ANDREOLETTI et al. 2002, TUO et al. 2002 25 BIACABE et al. 2004, CASALONE et al. 2004 26 DICKINSON u. OUTRAM et al. 1988, GOLDMANN et al. 1991, BELT et al. 1995 27 LACROUX et al. 2008, MADDISON et al. 2009 28 WELLS et al. 2005, ESPINOSA et al. 2007, HOFFMANN et al. 2007, 2011
26 Tiere, Material und Methoden
3 Tiere, Material und Methoden
3.1 Tiere
Für diese Arbeit wurden zum einen Damaskusziegen aus Zypern im Rahmen des europäi-
schen Scrapie-Tilgungsprogramms zur Charakterisierung europäischer Scrapiefälle und zum
anderen Ziegen einer Alpine-Saanen-Mischrasse in einer BSE-Pathogenesestudie im Rahmen
des EU-Projektes GoatBSE (FOOD-CT-2006-36353) untersucht.
3.1.1 Damaskusziegen aus Zypern
Alle untersuchten Ziegen der lokalen Damaskus-Rasse wurden im griechischen Teil Zyperns
im Rahmen des europäischen Scrapie-Tilgungsprogramms (VO (EG) 999/2001, VO (EG)
1041/2006) aus 20 Herden des Distrikts Nicosia selektiert und zur Sektion in die Pathologie
des Institute of Veterinary Services (IVS) des Ministry of Agriculture, #atural Resources and
Environment in Nicosia, Zypern gebracht. Die Arbeiten im IVS wurden von Penelope Papa-
savva-Stylianou, Pavlos Toumazos und ihren Mitarbeitern unterstützt. Die Selektion der zu
sezierenden Tiere aus den Herden erfolgte durch den Bestandstierarzt oder durch Mitarbeiter
des IVS anhand Scrapie-typischer, klinischer Merkmale wie Alopezie, Kachexie oder Ata-
xien. Die 42 sezierten Ziegen und deren anamnestischen Daten inkl. erster Schnelltestbefunde
und Angaben zum PRNP-Genotyp sind in den Tabellen Tab. 4 (S. 27) und Tab. 5 (S. 28) auf-
geführt. Alle beprobten Ziegen waren weiblichen Geschlechts und wurden entweder mit
Schafen zusammen gehalten oder standen auf Weiden, welche zuvor zur Haltung von Schafen
genutzt wurden.
3.1.1.1 Voruntersuchungen
Von allen 42 Tieren wurde anhand einer frischen Hirnstammprobe im Labor des IVS in Niko-
sia, Zypern ein BioRad TeSeE-Schnelltest, den Herstellerangaben in der Gebrauchsinformati-
on folgend, durchgeführt, um den Scrapie-Status jedes einzelnen Tieres festzustellen. Anhand
der Testergebnisse wurden 25 der sezierten Ziegen als PrPSc-reaktiv und die restlichen 17
Ziegen als PrPSc-negativ befundet. Durch Cynthia H. Panagiotidis wurden an der Aristoteles
Universität in Thessaloniki, Griechenland die Kodons 142, 146, 151, 154, 211, und 222 des
Prion-Gens jeder Ziege mittels cycle-sequencing-Verfahren, wie bei ACUTIS et al. (2006)
beschrieben, genotypisiert. Eine zusätzliche Genotypisierung einzelner Kodons erfolgte später
Tiere, Material und Methoden 27
durch die Firma Agrobiogen GmbH in Hilgertshausen mittels Pyrosequenzierung. Der über-
wiegende Teil der untersuchten Ziegen wies den sog. Wildtyp-Genotyp
I142N146R151R154R211Q222 (n=36) auf. Davon abweichend wurden bei sechs Tieren Poly-
morphismen auf den Kodons 142 (homozygot Methionin, n=1), 146 (heterozygot Asparagin-
und 154 (heterozygot Histidin, n=1) sequenziert. Das Ergebnis der Genotypisierung des
PRNP aller untersuchten Ziegen ist ebenfalls in Tab. 4 und Tab. 5 (S. 28) aufgeführt.
Tab. 4 Übersicht der 25 im BioRad-Schnelltest PrPSc-reaktiv getesteten Damaskusziegen inklusive anamnestischer Daten und des Prion-Gen-Genotyps
Kodon &ummer
Schnelltest- Ergebnisse
Alter (Jahre)
Herde Ort 142 146 151 154 211 222
ZYP 3 reaktiv (1,892) 4 B Koutrafas I N R R R Q
ZYP 8 reaktiv (1,675) 4 C Yeri I N R R R Q
ZYP 9 reaktiv (1,579) 4 D Psimolofou I N R R R Q
ZYP 10 reaktiv (1,985) 3 E Dali I N R R R Q
ZYP 11 reaktiv (1,856) 4 F Deftera I N R R R Q
ZYP 12 reaktiv (2,193) 3 G Ayios Ioannis I N R R R Q
ZYP 13 reaktiv (1,992) 4 G Ayios Ioannis I N R R R Q
ZYP 14 reaktiv (1,871) 4 F Deftera I N R R R Q
ZYP 16 reaktiv (2,204) 4 H Lympia I N R R R Q
ZYP 17 reaktiv (2,107) 4 H Lympia I N R R R Q
ZYP 19 reaktiv (1,831) 4 H Lympia I N R R R Q
ZYP 20 reaktiv (1,961) 3 I Lympia I N R R R Q
ZYP 21 reaktiv (1,511) 5 J Lakatamia I N R R R Q
ZYP 22 reaktiv (1,151) 5 J Lakatamia I N R R R Q
ZYP 25 reaktiv (1,227) 3 K Mathiatis I N R R R Q
ZYP 26 reaktiv (1,731) 4 L Dali I N R R R Q
ZYP 27 reaktiv (1,141) 3 M Ayios Ioannis I N R R R Q
ZYP 29 reaktiv (1,921) 4 M Ayios Ioannis I N R R R Q
ZYP 30 reaktiv (1,246) 6 M Ayios Ioannis I N R R R Q
ZYP 31 reaktiv (1,255) 4 N Latsia I N R R R Q
ZYP 33 reaktiv (1,784) 2 O Deftera I N R R R Q
ZYP 34 reaktiv (1,376) 2 P Deftera I N R R R Q
ZYP 35 reaktiv (1,452) 4 P Deftera I N R R R Q
ZYP 40 reaktiv (1,069) 4 R Lympia I N R R/H R Q
ZYP 41 reaktiv (1,674) 4 O Deftera I N R R R Q BioRad-Schnelltest: Cut-Off = 0,213; H = Histidin, I = Isoleucin, N = Asparagin, Q = Glutamin, R = Arginin
28 Tiere, Material und Methoden
Tab. 5 Übersicht der 17 im BioRad-Schnelltest PrPSc-negativ getesteten Damaskusziegen inklusive anamnestischer Daten und des Prion-Gen-Genotyps
Kodon &ummer
Schnelltest- Ergebnisse
Alter (Jahre)
Herde Ort 142 146 151 154 211 222
ZYP 2 negativ (0,017) 7 A Kokkinotrimithia I N/S R R R Q
ZYP 4 negativ (0,049) 7 A Kokkinotrimithia I S R R R Q
ZYP 6 negativ (0,014) 7 A Kokkinotrimithia I N R R R Q
ZYP 18 negativ (0,016) 4 H Lympia I N R R R Q
ZYP 23 negativ (0,011) 6 K Mathiatis I N R R R Q
ZYP 24 negativ (0,012) 2 K Mathiatis I N R R R Q
ZYP 28 negativ (0,010) 2 M Ayios Ioannis I N/D R R R Q
ZYP 32 negativ (0,018) 4 O Deftera I N R R R Q
ZYP 36 negativ (0,010) 3 Q Aglangia M N R R R Q
ZYP 37 negativ (0,010) 3 Q Aglangia I N R R R Q
ZYP 38 negativ (0,010) 3 Q Aglangia I N R R R Q
ZYP 39 negativ (0,007) 4 Q Aglangia I N/D R/H R R Q
ZYP 42 negativ (0,007) 2 S Lympia I N R R R Q
ZYP 43 negativ (0,008) 3 S Lympia I N R R R Q
ZYP 44 negativ (0,008) 4 S Lympia I N R R R Q
ZYP 45 negativ (0,010) 5 T Lympia I N R R R Q
ZYP 46 negativ (0,010) 4 T Lympia I N R R R Q BioRad-Schnelltest: Cut-Off = 0,213; D = Asparaginsäure, H = Histidin, I = Isoleucin, M = Methionin, N = Asparagin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin
3.1.2 Ziegen der BSE-Pathogenesestudie
Im Rahmen der „BSE-Pathogenesestudie der Ziege“ (Tierversuchsvorhaben des Landes
Mecklenburg-Vorpommern mit der Registriernummer: LVL M-V/TSD/7221.3-2.5-001/05)
wurden 39 Ziegen einer Alpine-Saanen-Mischrasse Anfang August des Jahres 2007 im BSE-
Stall des Friedrich-Loeffler-Instituts (FLI), Insel Riems in den Versuch genommen. Eine Ü-
bersicht ausgewählter anamnestischer Daten aller 39 Ziegen findet sich in Tab. 6 (S. 29). Die
Tiere wurden zwischen dem 04.01. und dem 14.02.2007 im L` Institut #ational de la Recher-
che Agronomique (L`INRA), Toulouse in Frankreich geboren. Die Kodons 142, 154, 211, 222
und 240 aller Ziegen wurden durch LABOGENA (Jouy-en-Josas, Frankreich) mittels
SNaPshot®-Technik sequenziert. Für die Versuchsherde wurden anschließend 27 kastrierte
Bocklämmer sowie 12 weibliche Ziegenlämmer ausgewählt, die drei verschiedene PRNP-
Genotypen aufwiesen, um mögliche genetische Einflüsse auf die Empfänglichkeit für BSE
untersuchen zu können.
Tiere, Material und Methoden 29
Tab. 6 Anamnestische Daten aller Ziegen der BSE-Pathogenesestudie geordnet nach Genotypen
Labornummer PR&P-Genotyp
(Kodon 142, 154, 211, 222 und 240) Geburtsdatum Geschlecht
PRNP = Prion-Gen, I = Isoleucin, K = Lysin, P = Prolin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, grau markiert = Kontrolltiere
Vereinfacht wird der Genotyp nachfolgend anhand der Aminosäuren angeben, welche durch
die Kodons 142, 211 und 222 kodiert werden. Mit fünfzehn Ziegen (n=15) kodieren die meis-
30 Tiere, Material und Methoden
ten Ziegen der Versuchsherde auf den Kodons 142, 211 bzw. 222 homozygot für die Amino-
säuren Isoleucin (I), Arginin (R) und Glutamin (Q) (I142R211Q222/IRQ). Dieser Genotyp wird
aufgrund seines häufigen Auftretens in der weltweiten Ziegenpopulation auch als so genann-
ter „Wildtyp“ bezeichnet und besitzt vermutlich die größte Empfänglichkeit für BSE. Die
beiden anderen Genotypen, von denen der eine heterozygot für Glutamin und Arginin am
Kodon 211 (I142Q211Q222/IRQ) und der andere für Glutamin und Lysin (K) auf dem Kodon
222 kodiert (I142R211K222/IRQ), besitzen dagegen vermutlich eine größere Resistenz. Von letz-
teren Genotypen wurden je zwölf Ziegen in die Herde aufgenommen.
3.2 Versuchsablauf
3.2.1 Sektion der Damaskusziegen aus Zypern
Die Ziegen wurden tierschutzgerecht narkotisiert und mit T61 euthanasiert. In der sich an-
schließenden Sektion unter S2-Bedingungen wurden von jedem Tier 56 Proben TSE-steril
entnommen (s. Tab. 26-Tab. 28, S. 135-137). Die Entnahme der Proben des Kopfbereichs
inklusive der Proben des zentralen Nervensystems (ZNS), der Magen-Darm-Trakt (MDT)-
Proben und der Proben des verbleibenden Tierkörpers fand während der Sektion jeweils
räumlich getrennt voneinander statt, um eine TSE-sterile Probenentnahme (ohne Kreuzkon-
taminationen) zu gewährleisten. Zusätzlich wurde bei der Probenentnahme selbst für jede
Probe ein Einmalbesteck verwendet, sowie ein regelmäßiger Wechsel der Einmalhandschuhe
vorgenommen. Konserviert wurde schließlich von paarig vorliegenden Proben jeweils die
Probe einer Körperseite in Formalin bzw. die der anderen Körperseite als Tiefgefrierprobe zur
Lagerung bei -70 °C. Unpaarig vorliegende Proben wurden halbiert und die beiden Hälften
jeweils auf gleiche Art konserviert.
3.2.2 Untersuchungen an Proben der Damaskusziegen
Von dem während der Sektion der Damaskusziegen gewonnenen Probenmaterial wurde eine
Auswahl an Proben des ZNS (Hirnstamm, Obexregion), des lymphoretikulären Systems
(Tonsille, Ln. retroph., 3. Augenlid, Milz), des Magen-Darm-Trakts (Rektum) und Proben zur
Überprüfung möglicher Übertragungswege (Euter, Niere, Uterus, Plazenta) im BioRad-
Schnelltest (IVS Nicosia, Zypern), in der Immunhistochemie und bzw. oder mittels protein-
biochemischer Methoden (FLI-Immunoblot, Langzeit-PK–Verdau) untersucht. Eine Übersicht
Tiere, Material und Methoden 31
der angewendeten Methoden findet sich in Abb. 5, eine Übersicht der untersuchten Proben
gibt Tab. 7 (S. 32).
42 Damaskusziegen
Obex
positiv (n = 25) negativ (n = 17)
1. Tonsille
2. Ln. retropharyngealis medialis
3. 3. Augenlid
4. Milz
5. Rektum
BioRad- Schnelltest
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Bei einem positiven Befund in 1.-5.
6. Euter
7. Niere
8. Uterus
9. Plazenta
Immunhistochemie
Western Immunoblot
(FLI- Test)
Stammhirn
Proteinase K- Resistenz
(48h-Langzeitverdau)
Stammhirn
(ausgewählte Tiere, n = 5)
Abb. 5 Schematische Darstellung der an den Proben der Damaskusziegen vorgenommenen Untersu-chungen (h = Stunden, n = Anzahl der Tiere, Ln. = Lymphonodus).
3.2.3 Die BSE-Pathogenesestudie
Der Ablauf der BSE-Pathogenesestudie ist in der Abb. 6 (S. 33) anhand eines Zeitstrahls dar-
gestellt. Die im Verlauf vorgenommenen Probenentnahmen, Sektionen und Zuchtereignisse
sind dort entsprechend mit Monat und Jahr vermerkt. Nähere Erläuterungen, die verschiede-
nen Zeitpunkte betreffend, folgen in den Kapiteln (Kap.) 3.2.3.1-3.2.3.10 (S. 34-40).
32 Tiere, Material und Methoden
Tab. 7 Übersicht über die immunhistochemisch, histopathologisch und im FLI-Test untersuchten Proben der im BioRad-Schnelltest PrPSc-reaktiv (A) und PrPSc-negativ (B) getesteten Da-maskusziegen aus Zypern
ZYP 28 x x x x x x n.u. n.u. n.u. n.u. n.d. ZYP 32, 36-39
x x x x x x n.u. n.u. n.u. n.u. n.d.
ZYP 42-46
x x x x x x n.u. n.u. n.u. n.u. n.d.
Ln. retroph. = Lymphonodus retropharyngealis medialis, Tons. = Tonsille, Plaz. = Plazenta, HE = Hematoxylin-Eosin-Färbung, x = untersucht, k. P. = kein Probenmaterial, n. u./n. d. = nicht unter-sucht/nicht durchgeführt
Tiere, M
aterial und Methoden
33
Abb. 6 Zeitlicher Ablauf der BSE-Pathogenesestudie.
Sektionen, &otsektionen (kurze und lange rote Balken)
Mon. p. i. = Monate post inoculationem
n = Anzahl Tiere
34 Tiere, Material und Methoden
3.2.3.1 Tierhaltung
Die Ziegenherde des BSE-Pathogeneseversuchs wurde in den Stallungen des FLI Insel Riems
unter L3**-Bedingungen gehalten. Der Stall bot neben einem separaten Fütterungsbereich mit
Fressgattern einen Auslaufbereich und separierbare Schlafboxen. Die Aufstallung erfolgte
einstreulos, um die veterinärhygienischen Bestimmungen zur Dekontamination und Entsor-
gung zu gewährleisten. Der Fütterungsbereich und die Liegeboxen waren mittels Fußboden-
heizung, die Liegeboxen optional auch durch Deckenstrahler, beheizbar. Der Stallbereich war
klimatisch nicht von der Außenwelt abgetrennt. Temperatur, Licht sowie Belüftung entspra-
chen somit weitgehend den klimatischen externen Bedingungen. Bei extremer Witterung
konnte die Temperatur durch Deckenlüfter bzw. durch die Heizvorrichtungen dem Optimalbe-
reich der Tiere angepasst werden. Die Tiere wurden mit Heu und Heucobs gefüttert. Zeitweise
wurde Quetschhafer sowie Blattgrün diverser Laubbäume bedarfsabhängig zugefüttert. Mit
jeder Tagesration erhielten die Ziegen eine auf die Gesamtration abgestimmte Mineralfutter-
mischung. Trinkwasser und Salzlecksteine für kleine Wiederkäuer standen ad libitum zur
Verfügung.
3.2.3.2 Inokulat
Das Gehirnmaterial zur Herstellung des Inokulats wurde vom Institute for Animal Health
(IAH) in Edinburgh, Großbritannien zur Verfügung gestellt. Es stammt aus einem Gehirnpool
von drei, intrazerebral mit Rinder-BSE infizierten Ziegen des I142R211Q222/IRQ-Genotyps
(FOSTER et al. 1993, GOLDMANN et al. 1996). Aus diesem Ziegenhirnmaterial wurde am
FLI Insel Riems ein 20 %-iges Gehirnhomogenat hergestellt. Dazu wurde das Gehirnmaterial
unter TSE-sterilen Bedingungen abgewogen und mit dem entsprechenden Volumen steriler,
isotoner Kochsalzlösung in einem Douncer zu einem homogenen Inokulat verarbeitet. Die
Lagerung des Inokulats bis zum Tag der Inokulation erfolgte bei -20 °C.
3.2.3.3 Inokulation
Am 07.08.2007, die Ziegen waren zu diesem Zeitpunkt zwischen sechs bis sieben Monaten
alt, wurden 37 von 39 Ziegen mit je 1 gr. BSE-positiven caprinen Gehirnmaterials pro Tier
oral inokuliert. Das Inokulat wurde hierzu nach dem Auftauen durch mehrmaliges Aufziehen
in einer 20 ml-Spritze erneut durchmengt. Die Applikation von 5 ml des 20 %-igen Inokulats
pro Ziege erfolgte mittels einer 10 ml-Spritze seitlich über das Diastema in den hinteren Ra-
Tiere, Material und Methoden 35
chenbereich. Mit den nachfolgenden Schluckbewegungen der Ziege war der Inokulationsvor-
gang jeweils abgeschlossen. Während des Inokulationsvorgangs und für weitere drei Tage
(Zeit einer vollständigen Darmpassage) erfolgte die Haltung der Ziegen auf Stroh, um die
Kontamination der Stallungen durch ausgeschiedenes und gegebenenfalls noch infektiöses
Inokulat so weit wie möglich einzuschränken. Anschließend wurde die Einstreu entfernt,
fachgerecht entsorgt und eine Desinfektion des Stallbereichs mit 2-molarer (M) Natronlauge
(NaOH) mit mindestens einer Stunde Einwirkzeit vorgenommen, welche nach zwei Wochen
ein weiteres Mal wiederholt wurde.
3.2.3.4 Kontrolltiere
Als Negativkontrollen dienten zwei kastrierte Böcke aus der Herde, welche den PRNP-
Genotyp I142R211Q222/IRQ aufwiesen (s. Tab. 6, S. 29). Die Böcke wurden zufällig aus den 15
Tieren des Wildtyp-Genotyps ausgewählt und dienten als Kontrolle zur Überprüfung des ho-
rizontalen Übertragungsweges. Sie wurden in der Zeit zwischen der Inokulation und den dar-
auf folgenden, wiederholten Stalldekontaminationen räumlich getrennt von dem Rest der
Herde gehalten und erst danach wieder in die Herde reintegriert.
3.2.3.5 Entnahme von Tonsillen- und Rektumbioptaten
Im Rahmen der Pathogenesestudie wurden 9, 12 sowie 20 Monate post inoculationem (Mon.
p. i.) jeweils allen Ziegen, welche sich zu diesen Zeitpunkten aktuell in der Herde befanden,
Tonsillen- und Rektumbioptate entnommen. Die Durchführung der Bioptatentnahme an Ton-
sillen, wurde bei einem Besuch (2007) in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen
Hochschule Hannover unter der Aufsicht von Professor Martin Ganter an Schafen trainiert
und dann im FLI, Insel Riems bei den Ziegen in gleicher Art und Weise angewendet. Die
Entnahme der Rektumbiopsien orientierte sich an den Angaben von GONZÁLEZ et al.
(2008). Bei jeder Biopsie wurden die Ziegen intravenös (i. v.) mit 10-15 mg/kg Ketamin-
hydrochlorid und intramuskulär (i. m.) mit 0,1-0,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid narkotisiert.
Mit einem Maulgatter erfolgte dann die Öffnung der Maulhöhle, um die Tonsillen zugänglich
zu machen. Mit dem auf dem Laryngoskopgriff (Lichtquelle) montierten Einmalgebrauchs-
spatel konnte der kaudale Rachen ausgeleuchtet werden und zuerst der Entnahmebereich des
Tonsillenbioptats mit ca. 5 mg/kg 2 %-igem Lidocainhydrochlorid oberflächlich anästhesiert
werden. Die Entnahme eines circa 2 mm breiten, 3 mm langen und 2 mm hohen Bioptats er-
36 Tiere, Material und Methoden
folgte schließlich mit einer Biopsiezange. Anschließend wurde zur Entnahme des Rektalbiop-
tats der Anus mittels eines Rektalspekulums zum einmaligen Gebrauch, welches unter Zuhil-
fenahme von Gleitgel eingeführt wurde, gespreizt. Nach der oberflächlichen Lokalanästhesie
der Entnahmestelle (s. o.) wurde die Rektalschleimhaut mit einer chirurgischen Pinzette an-
gehoben und ein ca. 5 mm breites, 8 mm langes und 3 mm hohes Bioptat ca. 1 cm kranial des
mukokutanen Übergangs mit einem Scherenschlag entnommen. Die Fixierung aller Bioptate
erfolgte umgehend nach der Entnahme in Formalin (4 %-iges neutral buffered formalin
(NBF)).
3.2.3.6 Entnahme von Blutproben
Im Rahmen der laufenden Probennahmen wurden alle vier Monate zu den Zeitpunkten 4, 8,
12, 16, 20 und 24 Mon. p. i. allen Ziegen, welche sich zu dem Entnahmezeitpunkt noch in der
Herde befanden, 200 ml Citratblut sowie 10 ml Blut zur Serumgewinnung entnommen. Die
Proben wurden nach einem etablierten Protokoll in Thrombozyten, Plasma, Erythrozyten,
Leukozyten (s. Kap. 9.5.1, S. 138) und Serum (s. Kap. 9.5.2, S. 139) fraktioniert und an-
schließend bei -70 °C konserviert. Die Untersuchung der Blutproben war nicht Gegenstand
dieser Arbeit.
3.2.3.7 &achzucht
Für die Zucht wurde im September 2008 ein hornloser, Weiße Deutsche Edelziegenbock des
Genotyps I142R211Q222 (homozygot) mit je einer Ziege der drei Genotypen (ZG 01, ZG 12 und
ZG 25) zusammen eingestallt und getrennt von der restlichen Herde gehalten. Im März des
folgenden Jahres haben die drei Muttertiere auf natürlichem Weg abgelammt und ihre Läm-
mer bis zum Absetzen im Juli 2009 gesäugt. Bei der Geburt wurden die Kotelydonen der Pla-
zenta, der Nabelstrang und die restlichen Kotelydonen-freien Fruchthüllen (Allantochorion
und Amnion) beprobt. Nach Möglichkeit wurde dabei ein Teil von jeder Probe bei -70 °C tief
gefroren und ein weiterer Teil in Formalin fixiert (s. Tab. 8, S. 37). Die Untersuchung der
Proben von Plazenta und Nabelstrang erfolgte immunhistochemisch, um die vertikale Über-
tragung von BSE bei Ziegen zu überprüfen.
Während der Laktationsphase wurde die Milch als Kolostrum täglich bzw. als Milchprobe bis
zur 20-igsten Woche post partum (p. part.) einmal wöchentlich beprobt und als Vollmilch,
bzw. nach einem etablierten Protokoll fraktioniert in Rahm, Milchzellen und entrahmte Milch
Tiere, Material und Methoden 37
bei -70 °C tief gefroren. Die Untersuchung der Milchproben war nicht Gegenstand dieser Ar-
beit. Der Ziegenbock wurde kurz vor dem Ablammen und die Muttertiere wurden nach dem
Absetzen der Lämmer in die Herde reintegriert. Die weitere Haltung der Lämmer erfolgte in
einer separaten Gruppe getrennt von der Herde. Sowohl der Bock, als auch die Lämmer wur-
den in die laufenden Probenentnahmen von Blut und Biopsien (s. Kap. 3.2.3.5-3.2.3.6, S. 35-
36) mit einbezogen.
Tab. 8 Übersicht zu den Formalin- und Tiefgefrierproben der Nachgeburten von den Muttertieren der drei Genotypen
Vatertier (Genotyp)
Muttertier (Genotyp)
Anzahl Lämmer
Plazenta (Kotelydonen)
Nabelstrang Fruchthüllen
ZG 01 (I142R211Q222/IRQ)
2 -70 °C/NBF NBF -70 °C
ZG 12 (I142Q211Q222/IRQ)
3* -70 °C/NBF -70 °C/NBF -70 °C ZG 40
(I142R211Q222/IRQ)
ZG 25 (I142R211K222/IRQ)
3 -70 °C/NBF k. P. -70 °C
*ein totgeborenes Lamm, Genotyp = Aminosäuren der Kodons 142, 211 und 222, I = Isoleucin, K = Lysin, Q = Glutamin, R = Arginin, k. P. = kein Probenmaterial, -70 °C/NBF = Konservierung bei -70 °C bzw. in 4 %-igem ungepufferten Formalin
3.2.3.8 Sektion
Die Ziegen wurden, wie in Tab. 9 (S. 38) dargestellt, zu den verschiedenen Zeitpunkten se-
ziert, wobei jedem weiblichen Tier insgesamt 136 und jedem männlichen Tier 135 Proben aus
den Bereichen des Kopfes (inklusive Gehirn), des Rückenmarks, des Magen-Darm-Trakts und
des Tierkörpers entnommen wurden (s. Tab. 26-Tab. 28, S. 135-137). Die zu sezierenden Tie-
re wurden dazu tierschutzgerecht mittels Injektionsnarkose mit 10-15 mg/kg Ketamin-
hydrochlorid und 0,1-0,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid i. v. anästhesiert und anschließend mit
T61 (4-6 ml pro 50 kg Körpergewicht) euthanasiert. Die sich anschließende Sektion fand un-
ter L3**-Bedingungen statt. Zur Gewährleistung der TSE-sterilen Entnahme aller Proben,
wurden die Ziegen eines Genotyps an einem Tag und nacheinander in der Sektionshalle se-
ziert. Pro Sektionstag konnten maximal drei Ziegen aufgearbeitet werden. Für jedes Tier stan-
den am Sektionstag separate Besteckkästen zur Verfügung. Nach der Dekontamination mit
2 M NaOH und im Autoklaven bei 136 °C und 3 bar Dampfdruck für 4 h wurden diese bei
nachfolgenden Sektionen nur für Ziegen des gleichen Genotyps verwendet. Im Bestecksatz
waren die Instrumente für die Entnahme der Kopfproben, der Proben des zentralen Nerven-
38 Tiere, Material und Methoden
systems (ZNS), der Körperproben sowie für die Entnahme der Magen-Darm-Trakt-Proben
gesondert gekennzeichnet, so dass es zu keiner Kreuzkontamination durch die Bestecksätze
zwischen den verschiedenen Organsystemen kommen konnte. Des Weiteren wurde die Ent-
nahme der Kopf- und ZNS-Proben, der Magen-Darm-Trakt-Proben und der Tierkörperproben
auf jeweils räumlich voneinander getrennten Sektionstischen vorgenommen.
Tab. 9 Sektionszeitpunkte der Ziegen aus der BSE-Pathogenesestudie (geordnet nach Genotypen)
Monate p. i. Datum I142R211K222/IRQ I142Q211Q222/IRQ I142R211Q222/IRQ
ZG 16 (184 T. p. i.) -- --
ZG 23 (184 T. p. i.) -- -- 07.02.2008
ZG 37 (184 T. p. i.) -- --
-- ZG 04 (189 T. p. i.) --
-- ZG 06 (189 T. p. i.) -- 12.02.2008
-- ZG 36 (189 T. p. i.) --
-- -- ZG 26 (191 T. p. i.)
-- -- ZG 32 (191 T. p. i.)
6 Monate p. i.
14.02.2008
-- -- ZG 35 (191 T. p. i.)
9 Monate p. i. 11.05.2008 -- ZG 21 (278 T. p. i.) --
-- ZG22 (364 T. p. i.) -- 05.08.2008
-- ZG31 (364 T. p. i.) --
ZG 02 (366 T. p. i.) -- --
ZG 08 (366 T. p. i.) -- -- 07.08.2008
ZG 09 (366 T. p. i.) -- --
-- -- ZG 19 (371 T. p. i.)
-- -- ZG 24 (371 T. p. i.)
12 Monate p. i.
12.08.2008
-- -- ZG 30 (371 T. p. i.)
14 Monate p. i. 27.10.2008 -- -- ZG 271 (447 T. p. i.)
14.08.2009 ZG 10 (738 T. p. i.) -- --
19.08.2009 -- ZG 13 (743 T. p. i.) ZG 33 (743 T. p. i.) 24 Monate p. i.
29.08.2009 -- -- ZG 01* (753 T. p. i.)
-- -- ZG 34* (765 T. p. i.) 10.09.2009
-- -- ZG 38* (765 T. p. i.) 25 Monate p. i.
30.09.2009 -- -- ZG 39 (785 T. p. i.)
*Das Tier musste aufgrund von tierschutzrelevanten, klinischen Anzeichen seziert werden. 1Das Tier musste außerplanmäßig aufgrund anderweitiger Erkrankungen notseziert werden. (T.) p. i. = (Tage) post inoculationem, I = Isoleucin, K = Lysin, Q = Glutamin, R = Arginin, grau markiert = Kontrolltier
Von jedem Tier wurden, soweit sie bilateral vorhanden waren, die Proben von der linken
Tiere, Material und Methoden 39
Körperseite für die Tiefgefrierlagerung bei -70 °C entnommen und die Proben der rechten
Körperseite in Formalin (4 %-iges NBF) konserviert. Unpaariges Probenmaterial wurde nach
der Entnahme halbiert und je zur Hälfte tief gefroren bzw. in Formalin (4 %-iges NBF) kon-
serviert. Die Formalinproben wurden mit Hilfe des Sektionsbestecks entnommen. Die Ent-
nahme der einzelnen Tiefgefrierproben erfolgte unter Verwendung von Einmalskalpellen und
Einmalpinzetten sowie unter Verwendung von verschließbaren Petrischalen für den einmali-
gen Gebrauch. Während der Sektion wurden, soweit zur Einhaltung der TSE-Sterilität not-
wendig, regelmäßig die Einmalhandschuhe und weitere Gebrauchsmaterialien gewechselt.
Wurden an einem Tag mehrere Ziegen seziert, so erfolgte, nach Abschluss der Sektion einer
Ziege und vor Beginn der Sektion der folgenden Ziege, eine Zwischenreinigung der Oberflä-
chen der Tische mit heißem Leitungswasser und die Abdeckung der Oberflächen mit frischer
Einmalfolie. Für das folgende Tier wurden dann separate Besteckkästen und Probenentnah-
meutensilien verwendet. Nach Beendigung eines Sektionstags wurde die gesamte Sektions-
halle, nach einer ersten gründlichen Reinigung mit heißem Leitungswasser, mit 2 M NaOH
für eine Stunde dekontaminiert und die Besteckkästen inkl. aller Instrumente wurden nach der
einstündigen Dekontamination mit 2 M NaOH zusätzlich noch bei 136 °C und 3 bar Dampf-
druck für 4 h autoklaviert.
3.2.3.9 Untersuchung des in den Sektionen entnommenen Probenmaterials
Von dem in den Sektionen gewonnenen Probenmaterial wurden der Obex und das Rücken-
mark des siebten Thorakalwirbels aus dem Probenmaterial des zentralen, und das Ganglion
(Ggl.) coeliacum aus dem Probenmaterial des peripheren Nervensystems, für die weiteren
Untersuchungen ausgewählt. Bei der Probe des Ggl. coeliacum konnte aufgrund der anatomi-
schen Nähe beider Ganglien nicht zwischen dem Ggl. coeliacum und dem Ggl. mesentericum
craniale unterschieden werden. Letzteres wurde somit immer in die Auswertung mit einbezo-
gen und ist nicht gesondert aufgeführt. Als repräsentative Proben des lymphoretikulären Sys-
tems dienten der Ln. retropharyngealis medialis, die Tonsille und von den früh sezierten Tie-
ren auch die kaudalen Lnn. jejunales. Von den Proben des Magen-Darm-Trakts wurden die
ilealen Peyer` Platten sowie der Ileozäkaleingang ausgewählt. Die ausgewählten Proben (s.
Abb. 7, S. 40) wurden immunhistochemisch auf PrPSc-Ablagerungen sowie auf histopatholo-
gische Veränderungen untersucht.
40 Tiere, Material und Methoden
Obex
Th7
Ggl. coeliacum
IleozäkaleingangIleale Peyer` Platte
Tonsille
Ln. retroph. med.
Lnn. jejunales
Abb. 7 Schematische Darstellung der Entnahmeorte von Proben des zentralen (orange) und periphe-ren Nervensystems (blau), des lymphoretikulären Systems (gelb) und des Magen-Darm-Trakts (grün) für die immunhistochemische/histopathologische Untersuchung, Ln./Lnn. = Lymphonodus/i, retroph. med. = retropharyngealis medialis, Ggl. = Ganglion, Th7 = Rük-kenmark auf Höhe des siebten Thorakalwirbels
3.2.3.10 Schnelltestdiagnostik
Die Untersuchung aller sezierter Ziegen aus dem BSE-Pathogeneseversuch im IDEXX Herd
Chek-Schnelltest wurde im Rahmen der laufenden TSE-Diagnostik am Institut für Neue und
Neuartige Tierseuchenerreger des Friedrich-Loeffler-Instituts, Insel Riems gemäß den Her-
stellerangaben durchgeführt. Die Absicherung der Schnelltest-Ergebnisse erfolgte dabei stets
durch die Untersuchung der Proben in der Immunhistochemie sowie im Immunoblot nach
Aufkonzentrierung des PrPSc mittels Phosphorwolframsäurefällung (s. Kap. 3.3, S. 40 und
Kap. 3.4, S. 44).
3.3 Histologische Methoden
3.3.1 Herstellung der histologischen Präparate
Die bei den Sektionen entnommenen Gewebeproben wurden für mindestens zwei Wochen in
einer 4 %-igen, neutral gepufferten Formalinlösung (NBF) fixiert. Um die Untersuchung einer
Tiere, Material und Methoden 41
größtmöglichen Probenmenge zu gewährleisten, wurde nach dem Zuschneiden der Proben die
maximal mögliche Menge an Probengewebe in die Einbettkassetten gefüllt. Zur Dekontami-
nierung der Gewebeoberflächen wurden die Einbettkassetten für eine Stunde in 98 %-iger
Ameisensäure belassen und anschließend für 40 min unter fließendem kaltem Leitungswasser
neutralisiert. Danach erfolgte die Einbettung der Proben im Gewebeinfiltrationsautomaten
(ASP 300, Fa. Leica) nach dem Standardprotokoll (s. Kap. 9.2.1, S. 133) über Nacht und in
Paraffinblöckchen. Von den zu untersuchenden Blöckchen wurden schließlich an einem Rota-
tionsmikrotom 3 µm dicke Schnitte angefertigt, die in einem Wasserbad auf Objektträger ge-
zogen wurden und nach der Glättung in einem ca. 45-50 °C warmen Streckbad für zwei Tage
bei 60 °C in einem Wärmeschrank an die Objektträgeroberfläche antrockneten. Für Schnitte
zur Hämatoxylin-Eosin (H.-E.)-Färbung wurden Superfrost-Objektträger verwendet. Die
Schnitte, die für immunhistochemische Färbungen vorgesehen waren, wurden auf haftungsbe-
ständigere Superfrost Plus-Objektträger gezogen, um der stärkeren mechanischen Beanspru-
chung des Gewebes bei diesem Verfahren gerecht zu werden.
3.3.1.1 Die serielle Schnitttechnik
Von den Blöckchen aller untersuchten Proben wurden standardmäßig mittels serieller Schnitt-
technik die Gewebeschnitte von drei Ebenen gewonnen und anschließend entsprechend ge-
färbt. Das Verfahren ist schematisch in Abb. 8 (S. 42) dargestellt und zeigt, dass nach dem
Schneiden von fünf 3 µm-Schnitten der ersten Ebene, die nächsten zehn 3 µm-Schnitte ver-
worfen wurden, um dann in der zweiten Ebene erneut fünf 3 µm-Schnitte auf die Objektträger
zu ziehen. Schließlich wurden nach den nächsten zehn verworfenen 3 µm-Schnitten die letz-
ten fünf 3 µm-Schnitte der dritten Ebene gewonnen. Somit konnten in einem Abstand von 30
µm drei Zellebenen im Probengewebe untersucht werden. Bei den Bioptaten (geringe Proben-
dicke) wurden die Blöckchen lediglich in einer Ebene geschnitten. Bei ausgesuchten Proben
wurde für eine intensivere Suche nach PrPSc die Ebenenanzahl nach gleichem Muster von drei
auf fünf angehoben. Von den fünf gewonnenen Schnitten pro Ebene wurden vier für die im-
munhistochemischen Färbungen und ein Schnitt für die H.-E.-Färbung verwendet.
42 Tiere, Material und Methoden
Schnitte der Ebene I (5 Schnitte zu je 3 µm)
Schnitte der Ebene II (5 Schnitte zu je 3 µm)
Schnitte der Ebene III (5 Schnitte zu je 3 µm)
Abschnitt wird verworfen (ca. 30 µm)
Abschnitt wird verworfen (ca. 30 µm)
Paraffin-Gewebeblock
Schnitte der Ebene I (5 Schnitte zu je 3 µm)
Schnitte der Ebene II (5 Schnitte zu je 3 µm)
Schnitte der Ebene III (5 Schnitte zu je 3 µm)
Abschnitt wird verworfen (ca. 30 µm)
Abschnitt wird verworfen (ca. 30 µm)
Paraffin-Gewebeblock
Abb. 8 Schema zur seriellen Schnitttechnik der Proben für die histologische Untersuchung
3.3.2 Lichtmikroskopische Untersuchung
Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte an einem Standardmikroskop unter Verwen-
dung von 2,5-er, 10-er, 20-er und 40-er Objektiven.
3.3.3 Auswertung der mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitte
Die H.-E.-Schnitte (ROMEIS 1989) aller Proben wurden auf pathomorphologische Verände-
rungen untersucht. In der Obexregion wurden dabei in den unterschiedlichen Kerngebieten
nur kreisrunde optisch vollständig leere Räume als pathomorphologisch relevant bewertet,
wenn diese Veränderung mehr als nur einmal im entsprechenden Kerngebiet auftrat. Einzeln
auftretende kleine Vakuolen sowie nicht kreisrunde oder nicht vollständig optisch leere Va-
kuolen wurden als Artefakte infolge der Gewebepräparation gewertet. Für die Bewertung der
Kerngebiete wurde jeweils ein Gesichtsfeld, mit dem 10-er Objektiv des Lichtmikroskops
betrachtet, herangezogen. Bis zu fünf Vakuolen im Gesichtsfeld wurden als geringgradig, fünf
bis 10 Vakuolen als mittelgradig und mehr als 10 Vakuolen als hochgradig histopathologisch
verändert bewertet (s. Tab. 23, S. 134). Aus den Ergebnissen der einzelnen Kerngebiete wur-
de dann der Grad der spongiformen Enzephalopathie für die gesamte Obexregion ermittelt,
wobei der vorherrschende Grad morphologischer Veränderungen berücksichtigt wurde, wel-
cher in den meisten Kerngebieten festgestellt wurde.
Tiere, Material und Methoden 43
3.3.4 Immunhistochemische Methoden
3.3.4.1 Immunhistochemische Färbungen
In den immunhistochemischen Untersuchungen wurden als Antikörper der MAK L42 (Epi-
top: 145-163 shp), der MAK 6C2 (Epitop: 114-120 bov; Jan Langeveld, Central Veterinary
Institute Wageningen UR in Lelystad, Niederlande) und der MAK F99 (Epitop: 220-225 shp)
verwendet (s. Tab. 21, S. 132). Die Verdünnung der Antikörper erfolgte Antikörper-spezifisch
(s. Tab. 21, S. 132) in 10 %-igem Ziegenserum-Tris-buffered-saline (TBS) mit 0,03 % Natri-
umazid, und für jeden Antikörper wurde nach der Entparaffinisierung und Rehydrierung der
Schnitte (s. Kap. 9.2.1, S. 133) die entsprechende Vorbehandlung des Gewebes zur Demas-
kierung der Epitope vorgenommen (s. Tab. 22, S. 133). Nach der Vorbehandlung mit Amei-
sensäure wurden die Schnitte für 5 min unter fließendem Wasser gespült und schließlich in
frisch mit Wasserstoffperoxid (3 %-ig) versetztem Methanol 30 min inkubiert. Nach diesem
und jedem weiteren Schritt der Vorbehandlung wurden die Schnitte dreimal in TBS gespült
und anschließend von der Küvette in ein Cover-Plate-System überführt, um dann 150 µl des
ersten Antikörpers aufzutragen. Nach 2 h Inkubationszeit wurden die Schnitte dreimal mit
TBS gespült und 100 µl des zweiten Antikörpers (Dako EnVision+System-HRP) wurden auf-
getragen, worauf eine 30-minütige Inkubationszeit folgte. Vor der 10-minütigen Inkubation
der Schnitte in der jeweils frisch mit Wasserstoffperoxid versetzten DAB-Lösung (30 %-ig),
wurden die Schnitte dreimal in TBS gespült und von den Cover Plates zurück in die Küvetten
überführt. Anschließend erfolgte die dreimalige Waschung der Schnitte in TBS, sowie einmal
kurz in A. bidest, und dann die Färbung für 10 min in Hämatoxylin. Unter fließendem, kaltem
Leitungswasser inkubierten die Schnitte schließlich für 15 min. Danach wurden sie entwässert
(s. Kap. 9.2.1, S. 133) und mit Entellan® im Eindeckelautomat eingedeckelt. Für jeden Schnitt
in der immunhistologischen Färbung wurde ein weiterer Schnitt der gleichen Schnittebene als
Negativkontrolle mitgeführt, welcher in der immunhistologischen Färbung anstatt mit dem
verdünnten Erstantikörper nur mit einer entsprechenden Menge an 10 %-igem Ziegenserum-
TBS mit 0,03 % Natriumazid inkubiert wurde. Als Positivreferenz diente bei jeder immunhis-
tologischen Färbung ein PrPSc–positiver Schnitt von Schaf- oder Ziegenhirn.
3.3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Präparate
Bei der Auswertung der immunhistologischen Präparate wurden das Vorkommen, die Lokali-
44 Tiere, Material und Methoden
sation und der Grad der PrPSc–Ablagerungen beurteilt. Soweit es möglich und für die Auswer-
tung erforderlich war, wurden die auszuwertenden Anteile des Gewebes im Schnitt ausge-
zählt. Wies ein Präparat positive Befunde auf, so wurde für das lymphoretikuläre Gewebe und
das Gewebe des enterischen Nervensystems der Anteil betroffener Follikel bzw. Ganglien an
der Gesamtzahl im Schnitt untersuchter Follikel bzw. Ganglien geschätzt (s. Tab. 24, S. 134).
Für die Auswertung der Schnitte der Obexregion wurde der Anteil des PrPSc-positiven Gewe-
bes für die gesamte Obexregion und in den verschiedenen Kerngebieten geschätzt (Tab. 25,
S. 134). Die von PrPSc–Ablagerungen betroffenen Zellen wurden nach Möglichkeit in allen
untersuchten Gewebeanteilen bestimmt. Das PrPSc stellte sich als dunkelbraunes feinkörnig
bis grobscholliges Reaktionsprodukt dar und war im Kontrollschnitt nicht nachweisbar. Es
wurde als positiv bewertet. Dagegen wurde Hämosiderin, ein eisenhaltiges Pigment, welches
sich auch im Kontrollschnitt als hellbraunes, grobkörniges Material nachweisen ließ und ho-
mogen hellbraune Färbungen, v. a. in Randbereichen und in Bereichen von Schnittartefakten,
als negativ bewertet. Ebenfalls als negativ bewertet wurden dunkelbraune bis hellbraune,
teilweise feinkörnig bis grobkörnige Färbungen v. a. von Epithelzellen der unterschiedlichen
Gewebe, welche ebenfalls in der Negativkontrolle angefärbt waren.
3.4 Proteinbiochemische Methoden
3.4.1 Herstellung von Gehirnhomogenaten
Zur Herstellung der 10 %-igen Gehirnhomogenate bei Ziege, Schaf und Rind wurden 180 mg
Gehirnmaterial aus dem Bereich der Obexregion oder alternativ aus dem Bereich der Medulla
cranialis, der Medulla caudalis, des Thalamus und des Zerebellum, in einem Ribolyser-
Röhrchen, welches mit vier Ribolyser-Stahlkugeln bestückt wurde, abgewogen und mit dem
neunfachen Volumen (w/v) an Sucrose-DOC-NP40-Lysispuffer versetzt. In einem Ribolyser
wurde das Gewebe in einen 45-sec-Zyklus bei 6500 rpm homogenisiert. Danach wurde das
Homogenat für 5 Minuten bei 17000 g zentrifugiert, um den Zelldetritus zu sedimentieren.
Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und, sofern er nicht direkt weiter bearbeitet
wurde, bei -20 °C gelagert.
3.4.2 Fällung mit Phosphorwolframsäure
Die Fällung mit Phosphorwolframsäure (PTA-Fällung) ermöglicht die spezifische Anreiche-
Tiere, Material und Methoden 45
rung von PrPSc. Phosphorwolframsäure bildet bei neutralem pH-Wert und in Gegenwart von
Magnesiumionen spezifische Aggregate mit dem pathologischen Prion-Protein, nicht aber mit
der physiologischen Form. Die Aggregate des PrPSc sammeln sich durch das Zentrifugieren
v. a. im Pellet, womit eine Anreicherung des PrPSc aus den Gehirnhomogenaten erreicht wird.
Von den Gehirnhomogenaten wurden im Standardprotokoll 100 µl des 10 %-igen Homoge-
nats mit 0,5 µl Benzonase (Endkonzentration 50 Units/ml) und 1,0 µl Magnesiumchlorid
(Endkonzentration 1 mM) versetzt und bei 37 °C für 30 min schüttelnd inkubiert. Anschlie-
ßend wurden die Proben mit Proteinase K bei einer Endkonzentration von 50 µg/ml und bei
55 °C eine Stunde unter Schütteln verdaut. Der PK-Verdau wurde dann durch die Zugabe von
2 µl Pefabloc® irreversibel geblockt und die Proben danach bei 95 °C für 5 min schüttelnd
denaturiert. Nachfolgend wurden die Proben mit 100 µl PBS mit 4 % Sarkosyl versetzt und
für 30 min bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Nach Zugabe von 16 µl der PTA-Stammlösung
(Endkonzentration 0,3 % PTA) erfolgte die Inkubation der Probe unter Schütteln bei 37 °C
für 1 h und anschließend wurde diese bei 17000 g für 30 min zentrifugiert. Der Überstand
wurde vorsichtig abgenommen und das Pellet vollständig in 30 µl Gel-Beladungspuffer
(2xCVL-Puffer) aufgenommen. Abweichend vom Standardprotokoll wurde bei Proben mit
starkem Signal im Westernblot das Ausgangsvolumen des Homogenats bedarfsabhängig in
Mengen zwischen 30 und 75 µl, bei Proben mit schwächerem Signal in Mengen von bis zu
200 µl eingesetzt.
3.4.3 Methanolfällung
Bei qualitativ schlechterem Probenmaterial oder beim Einsatz sehr großer Gehirnhomogenat-
volumina wurde zur Verbesserung des Laufbildes das mit der oben beschriebenen Methode
der PTA-Fällung gefällte PrPSc vor der Aufnahme in 2xCVL-Puffer zuerst in 45 µl Lysispuf-
fer aufgenommen und mit 5.0 µl Thyroglobulin versetzt und kurz gevortext. Nach Zugabe
von 500 µl Methanol (99,8 %-ig) folgte eine einstündige Lagerung bei –20 °C und anschlie-
ßend wurde das PrPSc erneut für 30 min bei 17000 g abzentrifugiert, um dann nach Abnahme
des Überstands das Pellet für 20 min im Schüttler bei 37°C zu trocknen. Nach dem Trocknen
erfolgte schließlich die Aufnahme in die entsprechende Menge 2xCVL-Puffer.
Für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde das Mi-
ni-Protean II System der Firma BioRad verwendet. Es wurden 16 %-ige Polyacrylamid-
Minigele von 0,75 mm Dicke eingesetzt. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese bei
95 °C für 5 min denaturiert. Bei Gelen, die zur Ermittlung der molekularen Masse dienen soll-
ten, wurde zweimal randständig 7 µl des Histidin-markierten FLI-Markers aufgetragen
(GROSCHUP et al. 2001). Die Proteinauftrennung erfolgte im Sammelgel bei 100 Volt (V)
und im Trenngel bei 200 V.
3.4.5 Westernblot und Immunochemie
Nach dem Auftrennen der Proteine in der SDS-Gelelektrophorese wurden diese mittels
Westernblot in einer Semi-Dry-Blotting-Apparatur auf eine PVDF-Membran übertragen. Da-
zu wurde die PVDF-Membran vollständig in Methanol gebadet und anschließend mit den
sechs Lagen Whatman-Chromatographiepapier und dem Minigel in Blottingpuffer ge-
schwenkt. Auf drei Lagen Whatman-Chromatographiepapier wurde im Semi-Dry-Blotgerät
die PVDF-Membran gelegt, auf diese das Minigel und zuoberst erneut drei Lagen Whatman-
Chromatographiepapier. Anschließend wurden die Proteine bei einer Spannung von 15 V und
einer Stromstärke von 0,3 Ampère (A) pro Minigel über 45 min geblottet. Nach dem Blotten
wurde die PVDF-Membran zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen in 10 ml 5 %-iger
Magermilch für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die hier verwendeten primä-
ren Antikörper, wie der monoklonale Antikörper (MAK) P4 (89-104 shp) und der MAK L42
(145-163 shp), wurden in 5 %-iger Magermilch 1:2000 verdünnt, und die Membran wurde
darin 1 h inkubiert. Für die Detektion des Histidin-markierten FLI-Markers bei der Entwick-
lung der Blots mit dem MAK L42 wurde als primärer Antikörper zusätzlich ein anti-Histidin-
Antikörper in einer Verdünnung von 1:4000 verwendet. Nach dreimaligem Waschen der
Blots mit PBS-Tween für jeweils 10 min, erfolgte die einstündige Inkubation der Membran
mit dem an alkalische Phosphatase gekoppelten Sekundärantikörper (s. Kap. 9.1.1.1, S. 132),
welcher in PBS-Tween 1:2000 verdünnt wurde. Nachfolgend wurde erneut dreimal mit PBS-
Tween für jeweils 10 min gewaschen, um dann die Membran für zweimal je 2 min in Assay-
puffer zu inkubieren. Danach erfolgte die Entwicklung jeder Membran mit ca. 1,5 ml CDP-
Star für 5 min. Anschließend wurden die gut abgetropften Membranen in eine Klarsichtfolie
Tiere, Material und Methoden 47
verpackt, um sie im VersaDoc Imaging System für 120 sec einzuscannen.
3.4.5.1 Bestimmung des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen Masse
Zur Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse wurden nach dem PK-Verdau die Anteile
des mono-, di- und unglykosylierten PrPSc am Gesamtsignal berechnet. Hierzu und zur Be-
stimmung der molekularen Masse der einzelnen Formen wurde die Quantity One Software
nach Messung im VersaDoc Imaging System verwendet. Die Grundeinstellungen am Versa-
Doc Imaging System wurden den Herstellerangaben im VersaDoc-Manual entnommen und
waren für die Messungen und Auswertungen aller Blots identisch. Vorraussetzung für die
Auswertung der Signale war, dass deren Signalstärken im linearen Messbereich des VersaDoc
Imaging System zwischen 60 000 und 200 000 counts lagen. Hierzu wurden vor den eigentli-
chen Messungen die erforderlichen Signalstärken in einem Probelauf bestimmt. Der FLI-
Marker mit Markern der Größen 23,0 kDa, 21,5 kDa, 20,3 kDa, 19,2 kDa, 18,0 kDa. 17,1 kDa
und 16,2 k Da (GROSCHUP et al. 2001) wurde für die Bestimmung der molekularen Masse
als Standardmarker festgelegt. Das Gehirnmaterial der in Tab. 4 (S. 27) aufgelisteten Scrapie-
positiv getesteten Zypernziegen, Gehirnmaterial von capriner BSE aus der Pathogenesestudie,
einer ovinen und einer bovinen BSE-Probe sowie die positive Scrapie-Probe eines Schafs
wurden zur Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse nach der PTA-Fällung auf vier ver-
schiedene Gele aufgetragen, welche dann nach dem Blotten mit dem MAK L42 entwickelt
wurden. Aus den Messungen dieser vier Gele wurden der Mittelwert und die Standardabwei-
chung (Microsoft Office Excel) für die Glykosylierungsverhältnisse und die molekularen
Massen ermittelt.
Die Stammhirnproben der Ziegen aus der BSE-Pathogenesestudie wurden zur Bestätigung der
Schnelltestdiagnostik nach der PTA-Fällung zunächst nur auf ein Gel aufgetragen, welches
nach dem Blotten mit dem MAK L42 entwickelt wurde. Bei einem positiven Befund, wurde
dann mit diesen Proben, wie bereits für die Zypernziegen beschrieben (s. o.), verfahren, und
es erfolgte anhand von in der Regel vier Gelläufen die Ermittlung der Glykosylierungs-
verhältnisse und der molekularen Massen.
3.4.5.2 Bestimmung der Antikörperbindungsverhältnisse
Für die in Kapitel 3.4.5.1 (s. o.) bearbeiteten Proben wurde zur Differenzierung zwischen
Scrapie und BSE außerdem das Antikörperbindungsverhältnis ermittelt. Das dabei zugrunde
48 Tiere, Material und Methoden
liegende Prinzip basiert darauf, dass das PrPSc einer BSE-Probe von der PK weiter N-terminal
geschnitten wird als das PrPSc einer Scrapie-Probe. Während Antikörper wie der MAK L42
ihre Bindungsstelle ausreichend weit C-terminal in der „core“-Region haben (Epitop 145-163
shp), um sowohl BSE als auch Scrapie zu detektieren, kann der MAK P4 (Epitop 93-99 shp),
lediglich Scrapie erkennen, da seine Bindungsstelle bei BSE im Strukturbereich vor der
Schnittstelle der PK liegt (s. Abb. 2, S. 9). Die untersuchten Proben wurden nach der PTA-
Fällung in identischen Volumina auf vier Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.
Nach dem Blotten wurden je zwei Gele mit dem MAK L42 bzw. mit dem MAK P4 entwi-
ckelt. Zur Bestimmung der Signalstärken der Probe im Westernblot am VersaDoc Imaging
System wurde in einem Scanvorgang je eine der mit MAK L42 und MAK P4 entwickelten
Blot-Membranen gemessen. Mit Hilfe der Quantity One Software erfolgte dann die Auswer-
tung und anschließend konnte aus den erhobenen Daten das Verhältnis der Signalstärke im
Westernblot vom MAK P4 zum MAK L42 aus dem gleichen Scanvorgang berechnet werden.
Als positive Referenzen wurden auf jedes Gel ein klassisches Scrapie-Isolat vom Schaf und
ein BSE-Isolat vom Rind aufgetragen. Randständig wurde beiderseits der FLI-Marker stan-
dardmäßig aufgetragen.
3.4.5.3 Der diskriminatorische FLI-Immunoblot
Der FLI-Immunoblot (FLI-Test) stellt eine Methode zur biochemischen Charakterisierung des
pathologischen Prion-Proteins von TSE-Erkrankungen unter Berücksichtigung des Glykosy-
lierungsverhältnisses und der molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc (s. Kap. 3.4.5.1,
S. 47) sowie des MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnisses (s. Kap. 3.4.5.2,
S. 47) dar und ermöglicht es, anhand dieser Parameter Scrapie von der BSE der kleinen Wie-
derkäuer zu unterscheiden (GRETZSCHEL et al. 2005). Dem FLI-Test nach wird ein Isolat
nur dann als BSE-ähnlich eingestuft, wenn der prozentuale Anteil der diglykosylierten Form
des PrPSc am Gesamtsignal (MAK L42) größer 50 % ist, die molekulare Masse des unglyko-
sylierten PrPSc um mehr als 0,5 kDa geringer ist als die der internen Scrapie-Referenz und das
MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis geringer als 0,4 ausfällt (s. Tab. 10, S.
49).
Mittels FLI-Test wurden die 25 in den Voruntersuchungen Scrapie-positiv getesteten Isolate
der Ziegen aus Zypern, ein ovines Scrapie-Isolat (Stdl. 171), vier caprine Isolate der BSE-
Tiere, Material und Methoden 49
Pathogenesestudie (ZG 01, ZG 33, ZG 34, ZG 38), ein ovines (468) sowie ein bovines BSE-
Isolat (R 8/09) untersucht.
Tab. 10 Parameter für die Einstufung eines TSE-Isolats als BSE-ähnlich im FLI-Test
Ergebnis Parameter Wert
Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc am Gesamtsignal > 50 %
MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis < 0,4 BSE-ähnlich Differenz molekularer Massen der unglykosylierten Form des PrPSc zur unglykosylierten Form des PrPSc der internen Scrapie-Referenz
∆ > 0,5 kDa
MAK = monoklonaler Antikörper
3.4.6 Langzeit-Proteinase K-Resistenz von PrPSc
Für klassisches ovines Scrapie- und bovines BSE-Material konnte bei der Inkubation von
Hirnmaterial eine geringere Resistenz des BSE-Materials gegen den Langzeit-Verdau mit PK
festgestellt werden (SWEENEY et al. 2000). Das für diese Untersuchung verwendete Pro-
benmaterial wurde aus der Obexregion des Stammhirns entnommen. Aus dem Material wur-
de, wie unter Kap. 3.4.1 (S. 44) beschrieben, ein 10 %-iges Gehirnhomogenat in Sucrose-
DOC-NP40-Lysispuffer unter Zugabe von PBS (Endkonzentration 20 mM PBS) hergestellt.
Nach dem Abzentrifugieren des Homogenats wurde der flüssige Überstand für 2-4 Ansätze je
Probe verwendet. Zu 600 µl des 10 %-igen Gehirnhomogenats pro Standardansatz wurde die-
ser nach Zugabe von Magnesiumchlorid (Endkonzentration 1 mM) und Benzonase (Endkon-
zentration 50 Units/ml) mit PK (Endkonzentration 100 µg/ml) unter Schütteln bei 55 °C ver-
daut. Nach 1 h, 6 h, 24 h und 48 h Inkubation wurden jedem Ansatz standardmäßig 150 µl
Probe entnommen und mittels einer PTA-Fällung (Protokoll s. Kap. 3.4.2, S. 44, ohne den
Denaturierungsschritt bei 95°C für 5 min) weiter aufkonzentriert. Das Pellet aus der PTA-
Fällung wurde in 45 µl 2xCVL aufgenommen und bei -20 °C gelagert. Auf jedes der bestück-
ten Gele pro Ansatz konnte dann nach der 5-minütigen Denaturierung bei 95 °C für jeden
Zeitwert ein identisches Volumen der Probe in 2xCVL (ca. 15-30 µl) aufgetragen werden. Als
positive Referenz diente auf jedem Gel ein klassisches Scrapie-Isolat. Nach SDS-Page und
Westernblot wurde die Signalstärke des PrPSc nach einer, sechs, 24 und 48 h mit der Quantity
One Software am VersaDoc-Messgerät ermittelt. Unter Festsetzung des Einstundenwertes als
100 % konnten unter Verwendung einer Excel-Kalkulationstabelle der prozentuale Anteil des
50 Tiere, Material und Methoden
noch vorhandenen PrPSc nach 6, 24 und 48 h berechnet werden. Abweichend vom Standard-
protokoll wurde bei Proben mit schwachem Signal im Westernblot das Ausgangsvolumen des
Homogenats bedarfsabhängig bis auf 800 µl erhöht. Pro Zeitpunkt wurde der Ausgangsmenge
entsprechend dann bis zu 200 µl Homogenat zur anschließenden PTA-Fällung entnommen.
3.5 Kontrollen und Referenzmaterial
Das für die immunhistochemischen Färbungen und proteinbiochemischen Untersuchungen
verwendete Material der Positivreferenzen stammte von Fällen, welche in der Routinedia-
gnostik des Nationalen Referenzlabors (NRL) für Transmissible Spongiforme Enzephalo-
pathien des Friedrich-Loeffler-Instituts Insel Riems als Scrapie bzw. BSE positiv befundet
worden waren, bzw. von experimentell gewonnenem Positivmaterial. In der Immunhistoche-
mie wurde dabei positives Stammhirnmaterial von Schaf und Ziege verwendet, in der Prote-
inbiochemie positives Gehirnmaterial von Schaf, Ziege und Rind. Einen Überblick über die
wichtigsten Referenzproben zeigt Tab. 11. Das Material der Kontrollen stammte von Fällen,
welche in der Routinediagnostik des Nationalen Referenzlabors (NRL) für Transmissible
Spongiforme Enzephalopathien des Friedrich-Loeffler-Instituts Insel Riems ein PrPSc-
negatives Ergebnis aufwiesen.
Tab. 11 Übersicht der wichtigsten positiven Referenzen (Hirnstammmaterial) für die proteinbioche-mischen Untersuchungen
Stdl. 171 ovine Scrapie Schaf Stendal, BRD, Routinediagnostik *Isolat aus oraler BSE-Pathogenesestudie, BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, BRD = Bun-desrepublik Deutschland, FLI = Friedrich-Loeffler-Institut, INRA = Institut National de la Recherche Agronomique
3.6 Statistische Analyse
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Exakten Fisher-Test unter Berücksichtigung
einer maximalen Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % (α = 5 %), d. h., untersuchte Zusammen-
hänge mit Testergebnissen (p) kleiner 0,05 (p < 0,05) wurden als statistisch signifikant gewer-
tet. Die statistischen Berechnungen erfolgten in R, Version 2.8.1 (2008).
Ergebnisse 51
4 Ergebnisse
4.1 Caprine Isolate der Ziegen aus Zypern
4.1.1 Ergebnisse der Voruntersuchungen
Die Ziegen wurden in den Herden auf Zypern nach klinischen Anzeichen wie Alopezie, Ka-
chexie oder Ataxien für die Sektion ausgesucht. Von den 42 klinisch auffälligen Tieren wie-
sen in der Schnelltestdiagnostik im Rahmen der Voruntersuchungen 25 Ziegen einen PrPSc–
reaktiven (59,5 %) und 17 einen PrPSc-negativen Befund (40,5 %) auf. Die wesentlichen Er-
gebnisse aus den Voruntersuchungen an den Damaskusziegen aus Zypern sind in Tab. 4
(S. 27) und Tab. 5 (S. 28) dargestellt. Dabei wurde gesondert auf das Alter, den Genotyp
(Kodon 142, 146, 151, 154, 211, und 222) und auf das Ergebnis des BioRad-Schnelltests so-
wie, soweit erforderlich, auf die Herkunft der Ziegen eingegangen.
4.1.1.1 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-reaktivem Schnelltestbefund
Der BioRad-Schnelltest an 42 weiblichen Damaskusziegen aus Zypern ergab für 25 Ziegen
mit Ergebniswerten zwischen 1,069 bis 2,204 einen PrPSc-reaktiven Befund (Cut-Off 0,213).
Von diesen Ziegen waren 15 Ziegen (60 %) vier Jahre alt, fünf Ziegen (20 %) drei Jahre alt,
zwei Ziegen zweijährig (4 %) und die restlichen drei Ziegen fünf bis sechs Jahre alt (16 %)
(s. Abb. 9, S. 52).
Abgesehen von einem einzelnen Tier (ZYP 40) der Herde R, welches einen R/H-
Polymorphismus auf dem Kodon 154 zeigte (I142N146R151R/H154R211Q222), wiesen alle anderen
als PrPSc-reaktiv getesteten Ziegen den Wildtyp-Genotyp I142N146R151R154R211Q222 auf
(s. Tab. 12, S. 52).
4.1.1.2 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-negativem Schnelltestbefund
Siebzehn Ziegen wiesen, mit Ergebniswerten zwischen 0,007 bis 0,049 im BioRad-
Schnelltest, einen PrPSc-negativen Befund (Cut-Off 0,213) auf. Zwar war auch hier mit fünf
Ziegen (28 %) die Mehrzahl der Tiere vier Jahre alt, vier Tiere waren aber dreijährig (24 %)
und je ein Tier (6 %) fünf- bzw. sechsjährig. Mit je drei Zwei- und Siebenjährigen (je 18 %)
gab es viele relativ junge bzw. wesentlich ältere Tiere (s. Abb. 9, S. 52).
Die Ziegen mit PrPSc-negativem Befund wiesen wesentlich häufiger Polymorphismen des
52 Ergebnisse
PRNP auf als die Ziegen mit PrPSc-reaktivem Befund. Von 17 Tieren zeigten fünf mindestens
einen und eines dieser Tiere sogar zwei Polymorphismen. Am Kodon 142 kodierte die Ziege
ZYP 36 homozygot für Methionin. Polymorphismen am Kodon 146, welche bisher v. a. bei
zypriotischen Ziegen berichtet wurden (PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007), traten bei
vier Ziegen auf. Davon kodierten zwei Ziegen heterozygot für Asparagin und Asparaginsäure
(ZYP 28, 39) bzw. Serin (ZYP 2) und ein Tier homozygot für Serin (ZYP 4) auf diesem Ko-
don.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
2 3 4 5 ≥ 6
Alter (in Jahren)
Anz
ahl T
iere
reaktiv
negativ
Abb. 9 Altersstruktur der Damaskusziegen aus Zypern mit PrPSc-reaktivem (n = 25 Tiere) bzw.
PrPSc-negativem Befund (n = 17 Tiere) im BioRad-Schnelltest
Tab. 12 Anamnestische Daten der Damaskusziegen aus Zypern inklusive der Polymorphismen des Prion-Gens sowie Informationen zu den Herdenmitgliedern
Herdenmitglieder Schnell-test:
positiv Tier Kodon
Polymor-phismus
Alter (Jahre)
Ort/Herde Tiere (gesamt)
Schnelltest positiv: ja/nein
ja ZYP 40 154 R/H 4 Lympia/R n=1 1/0
ZYP 2 N/S 7
ZYP 4 S/S 7 Kokkinotrimithia/A n=3 0/3
ZYP 28 2 Ayios Ioannis/M n=4 3/1 ZYP 39
146
N/D 4
ZYP 39 151 R/H 4
nein
ZYP 36 142 M/M 3
Aglangia/Q n=4 0/4
AS = Aminosäure, D = Asparaginsäure, H =Histidin, M = Methionin, N = Asparagin, R = Arginin, S = Serin, n = Anzahl Tiere
Ergebnisse 53
Die Ziege ZYP 39 wies zusätzlich am Kodon 151 einen zweiten Polymorphismus (R/H) auf.
Die Ziege ZYP 28 wies von vier untersuchten Ziegen der Herde M als einzige einen Poly-
morphismus (N/D146) auf und zeigte einen PrPSc-negativen Befund im Schnelltest (s. Tab. 12,
S. 52).
4.1.2 Biochemische Charakterisierung (FLI-Test) der caprinen Isolate aus Zypern
Im FLI-Test wurde Stammhirnmaterial der 25 im Schnelltest positiv getesteten Ziegen und im
Vergleich dazu ein caprines BSE-Isolat (ZG 01, eigene BSE-Pathogenesestudie), ein ovines
BSE-Isolat (468) und ein bovines BSE-Isolat (R 8/09) sowie ein ovines klassisches Scrapie-
Isolat (Stdl. 171) untersucht (s. Tab. 11, S. 50). Die Ergebnisse zu den Glykosylierungs-
verhältnissen, zur molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc und dem MAK
P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis aller Proben sind in der Tab. 29 (S. 140) im An-
hang aufgeführt. Auf diese wird in den folgenden Abschnitten näher eingegangen.
4.1.2.1 Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse
Die Glykosylierungsverhältnisse aller untersuchten Proben sind in der Abb. 10 (S. 54) in ei-
nem Dreiecksdiagramm (Triangular diagram plotting spreadsheet, TRI-PLOT) dargestellt.
Der Anteil der diglykosylierten Form am Gesamtsignal des PrPSc war bei allen caprinen Scra-
pie-Proben und dem ovinen Scrapie-Isolat deutlich geringer als bei den BSE-Isolaten von
Ziege, Rind und Schaf. Auffälligerweise wiesen acht der 25 Proben einen Anteil von mehr als
50 % des Gesamtsignals für die diglykosylierte Form des PrPSc auf.
Das Verhältnis des diglykosylierten PrPSc zum monoglykosylierten PrPSc betrug bei boviner
BSE 61:25 %, bei oviner BSE 59:26 % und bei capriner BSE 62:25 %. Bei dem untersuchten
ovinen Scrapie-Isolat lag das Verhältnis des Signalanteils der diglykosylierten zur monogly-
kosylierten PrPSc-Bande am Gesamtsignal bei 46:30 %. Die 25 caprinen Scrapie-Isolate wie-
sen für die diglykosylierte Form des PrPSc einen Anteil zwischen 43 und 52 % auf, der Anteil
der monoglykosylierten Form des PrPSc lag dagegen zwischen 26 und 32 %.
4.1.2.2 Bestimmung der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc
Die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc, welche als Mittelwert aus 4 bis 5
Gelläufen ermittelt wurde, betrug für bovines BSE 18,5 kDa, für ovines BSE 18,7 kDa und
für caprines BSE 18,8 kDa. Für das klassische ovine Scrapie-Isolat betrug sie 19,2 kDa und
54 Ergebnisse
lag, wie die 25 caprinen Zypernisolate auch, für jeden einzelnen Blot deutlich über der mole-
kularen Masse der internen bovinen BSE-Referenz. Beim Vergleich der Mittelwerte der mo-
lekularen Massen der unglykosylierten Form des PrPSc aus allen Gelläufen konnten dagegen
nicht alle caprinen Scrapie-Isolate eindeutig vom bovinen, ovinen oder caprinen BSE-Isolat
differenziert werden. Für die caprinen Scrapie-Isolate lagen die molekularen Massen zwi-
schen 18,0 und 19,4 kDa.
unglykosyliertes PrPSc (%)
60 40 2080 0
20 80
20
40
0
40
100
60
60
80
monoglykosyliertes PrP Sc (%
)digl
ykos
ylie
rtes P
rPSc
(%)
60 40 2080
Abb. 10 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der 25 caprinen Isolate aus Zypern ( ), des caprinen (ZG 01- ), des ovinen (486 - ) und des bovinen BSE-Isolats (R 8/07 – ) sowie des ovinen Scrapie-Isolats (Stdl. 171 - ) in einem Dreiecksdiagramm. Auf der linken Achse ist der Anteil des diglykosylierten PrPSc, auf der rechten Achse der An-teil des monoglykosylierten PrPSc und auf der unteren Achse der Anteil des unglykosylierten PrPSc am Gesamtsignal im Westernblot dargestellt. Die Scrapie-Isolate positionieren sich klar distanziert von den BSE-Isolaten, deren diglykosylierte Form des PrPSc mehr als 50 % des Gesamtsignals ausmacht.
Die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc des bovinen (18,5 kDa) bzw. des
ovinen BSE-Isolats (18,7 kDa) war somit geringer als die des caprinen BSE-Isolats (18,8
kDa). Acht caprine Scrapie-Isolate zeigten ebenfalls eine geringere molekulare Masse des
unglykosylierten PrPSc (18,0 bis 18,7 kDa) im Vergleich zum caprinen BSE-Isolat und vier
Ergebnisse 55
Isolate aus Zypern wiesen eine vergleichbare molekulare Masse auf (18,8 kDa). Das ovine
Scrapie-Isolat (19,2 kDa) sowie 12 caprine Scrapie-Isolate zeigten mit Werten bis zu 19,4
kDa eine größere molekulare Masse des unglykosylierten PrPSc als das caprine BSE-Isolat.
Bei der Bildung der Differenz zwischen der molekularen Masse (MM) der unglykosylierten
Form des PrPSc der untersuchten Isolate und der molekularen Masse der unglykosylierten
Form der jeweiligen internen Scrapie-Referenz (MMProbe-MMScrapiereferenz) ergaben sich für die
verschiedenen BSE-Isolate Differenzwerte von -0,67 bis -0,56 kDa. Somit waren ausschließ-
lich die molekularen Massen des unglykosylierten PrPSc der BSE-Isolate mehr als 0,5 kDa
kleiner als die molekularen Masse der internen Scrapie-Referenz, was nach GRETZSCHEL et
al. (2005) als BSE-ähnliches Charakteristikum zu werten ist. Die Differenzwerte für die un-
tersuchten Scrapie-Isolate von Schaf und Ziege lagen zwischen -0,1 bis 0,49 kDa. Die mole-
kularen Massen des unglykosylierten PrPSc dieser Isolate waren somit nicht um mehr als
0,5 kDa kleiner als die der internen Scrapie-Referenz. Die Isolate sind folglich als Scrapie-
ähnlich einzustufen (s. Abb. 11, S. 56 u. Tab. 29, S. 140).
4.1.2.3 Bestimmung des Antikörperbindungsverhältnisses
Der Quotient aus der Signalintensität des MAK P4 und des MAK L42 (Antikörperbindungs-
verhältnis) lag für das bovine BSE-Isolat am niedrigsten bei 0,03 und für das ovine sowie das
caprine BSE-Isolat bei 0,16. Demnach wurden alle drei BSE-Isolate wesentlich schlechter
durch den MAK P4 detektiert als durch den MAK L42. Der Wert für das Antikörperbin-
dungsverhältnis des ovinen Scrapie-Isolats in Höhe von 1,43 war dagegen deutlich höher,
wobei 12 caprine Zypernisolate ebenfalls einen Wert größer 1,0 aufwiesen, bei einem Maxi-
malwert von bis zu 1,76. Dreizehn der caprinen Zypernisolate wiesen einen Wert kleiner 1
auf, wobei kein Wert unter 0,69 lag (s. Abb. 11, S. 56 u. Tab. 29, S. 140).
Abb. 11 Vergleich des Quotienten der Signalintensiät des P4 und des L42-Signals (Mittelwerte aus 2 Gelläufen) und des Differenzwer-tes der molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc der Proben zur molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc der inter-nen Scrapie-Referenzen (Mittelwerte aus 4 Gelläufen; ZYP 22 und ZYP 25 aus 5 Gelläufen) von je einem caprinen (ZG 01), ovinen (468) und bovinen BSE-Isolat (R 8/09), einem ovinen Scrapie-Isolat (Stdl. 171) und von caprinen Isolaten aus Zypern (ZYP)
Differenzwerte aus den Messwerten der molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc der jeweiligen Probe und der internen Scrapie-Referenz (in kDa)
Ergebnisse 57
4.1.2.4 Differenzierung zwischen Scrapie und Boviner spongiformer Enzephalopathie mittels FLI-Test
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die untersuchten bovinen, ovinen und caprinen BSE-
Isolate (R 8/09, 468 und ZG 01) dem FLI-Test-Kriterien von BSE entsprachen. Im Gegensatz
dazu wiesen aber die 25 Isolate der Zypernziegen und das ovine Scrapie-Isolat eindeutig
Scrapie-ähnliche Eigenschaften auf. Zwar zeigten acht der 25 Hirnstammproben einen Anteil
des diglykosylierten PrPSc von mehr als 50 %, das MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungs-
verhältnis und die Differenz der molekularen Massen des unglykosylierten PrPSc zu der mole-
kularen Masse der internen Scrapie-Referenz sprachen aber eindeutig für ein Scrapie-
ähnliches Isolat, weshalb diese acht Isolate ebenfalls als Scrapie-ähnlich eingestuft wurden.
Die acht im Glykosylierungsmuster abweichenden Scrapie-Isolate, besaßen alle denselben
Wildtyp-PRNP-Genotyp (homozygot I142N146R151R154R211Q222) und gehörten zu Herden, die
in großer räumlicher Nähe zueinander weideten. Es gab aber in den Herden der Tiere mit den
beschriebenen Abweichungen im Glykosylierungsmuster auch Ziegen, welche keine derarti-
gen Abweichungen aufwiesen (s. Tab. 13 u. Abb. 12, S. 58), und auch Ziegen aus nahe gele-
genen Herden desselben Ortes (z. Bsp. Herde F und P, s. Abb. 12, S. 58) zeigten keine Ab-
weichungen im Glykosylierungsmuster der Scrapie-Isolate.
Tab. 13 Scrapie-Isolate der Damaskusziegen aus Zypern mit einem Anteil des diglykosylierten PrPSc am Gesamtsignal von mehr als 50 % im Immunoblot (FLI-Test) und ergänzende Angaben
Labor-nummer
Anteil diglykosyliertes PrPSc (%)
PR&P-Genotyp 142, 146, 211
Ort Herde Herden-
mitglieder
ZYP 13 50,1 (±1,4) INR/INR Ayios Ioannis G ZYP 12*
I = Isoleucin, N = Asparagin, R = Arginin, (±) = Standardabweichung, *Obexregion TSE-positiv
58 Ergebnisse
Abb. 12 Standorte der Herden (A-Q) der Zypernziegen (ZYP) zueinander. Die Distanz zwischen den
Herden der Ziegen, die im Glykosylierungsmuster einen Anteil des diglykolysierten PrPSc am Gesamtsignal > 50 % (*) aufwiesen, betrug weniger als 30 km.
A - Kokkinotrimitias E, L - Dali J - Lakatamia B - Koutrafas F, O*, P - Deftera *ZYP 33 K - Mathiatis *ZYP 25 C - Yeri G*, M* - Ayios Ioannis *ZYP 13, 27, 29, 30 N - Latsia D - Psimilofou H*, I, R, S, T - Lympia *ZYP 17, 19 Q – Aglanglia
4.1.3 Bestimmung der Langzeit-Proteinase K-Resistenz
Die Langzeit-PK-Resistenz wurde für die in Tab. 14 (S. 59) aufgeführten Proben bestimmt.
Das ovine und caprine BSE-Isolat dienten dabei als BSE-Referenz der kleinen Wiederkäuer.
Von den caprinen Scrapie-Isolaten wurden vier Isolate ausgewählt, welche im FLI-Test durch
einen Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc am Gesamtsignal von mehr als 50 % auffäl-
lig geworden waren. Das Isolat einer weiteren Ziege (ZYP 21) erwies sich anhand von drei
eindeutig Scrapie-ähnlichen Parametern als repräsentativ für den Großteil der caprinen Scra-
pie-Isolate. Die Auswahl sowohl von BSE-Proben als auch aus den Scrapie-Isolaten sollte
mögliche stammspezifische Unterschiede in der PK-Resistenz aufzeigen. Die caprinen Scra-
pie-Isolate zeigten über den Verlauf des PK-Langzeitverdaus eine tendenziell geringere Resis-
tenz als die caprine oder auch die ovine BSE. Ausgewählte Blots dazu zeigt Abb. 13 (S. 59).
In Abb. 14 (S. 60) ist der Verlauf des Langzeit-PK-Verdaus graphisch dargestellt. Von den
Ergebnisse 59
beiden BSE-Isolaten zu den Zeitpunkten 6 h, 24 h und 48 h waren noch ca. 75-79 %, 53-63 %
bzw. 33-39 % des PrPSc unverdaut. Die caprine BSE verhielt sich dabei etwas resistenter ge-
gen den Protease-Verdau. Bei den caprinen Scrapie-Isolaten lagen nur noch 61-72 %,
33-42 % bzw. 20-28 % des PrPSc-Materials unverdaut zu den definierten Zeitpunkten vor (s.
Tab. 30, S. 141).
Tab. 14 Übersicht der im Langzeit-Proteinase K-Resistenztest untersuchten Proben
*klassische Scrapie, Hirnstamm = Anteile der Pons, der Medulla oblongata und der Obexregion, BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, BRD = Bundesrepublik Deutschland
caprine BSE (ZG 01)
1 h 6 h 24 h 48 h 1 h 6 h 24 h 48 h
ovine BSE (486)
1 h 6 h 24 h 48 h
caprine Scrapie (ZYP 13)
1 h 6 h 24 h 48 h
caprine Scrapie (ZYP 21)
Abb. 13 Darstellung der Stabilität von PrPSc nach Proteinase K-Verdau für 1, 6, 24 und 48 h der caprinen (ZG 01), ovinen BSE (486) und capriner Scrapie (ZYP 13, ZYP 21) im Westernblot; Antikörper: MAK L42
60 Ergebnisse
0102030405060708090
100
1 6 24 48
Zeit (in h)
%
ZG 01
486
ZYP 13
ZYP 19
ZYP 21
ZYP 27
ZYP 30
Abb. 14 Vergleichende Darstellung der Proteinase K-Resistenz des PrPSc von capriner BSE (ZG 01), oviner BSE (486) und fünf caprinen Scrapie-Isolaten (ZYP) aus Zypern. Im Diagramm wur-de der prozentuale Anteil der Signalstärke des PrPSc im Westernblot nach 6, 12 und 24 h am Gesamtsignal nach 1 h (= 100%) dargestellt. Es wurden Mittelwerte aus 4 Gelläufen ver-wendet (ZYP 21 drei Gelläufe). Auf die Darstellung des Standardfehlers wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet.
4.1.4 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen
Nach der Voruntersuchung von Stammhirnproben aller Zypernziegen im BioRad-Schnelltest
wurden die Obexregion sowie ausgewählte Gewebe des LRS (Ln. retroph., Tonsille, 3. Au-
genlid und Milz), des Magen-Darm-Trakts (Rektum) und des enterischen Nervensystems
(Rektum) auf histopathologische Veränderungen und immunhistologisch auf das Vorhanden-
sein von PrPSc untersucht. Von den histopathologischen Befunden werden dabei nur die Be-
funde der Obexregion ausführlich beschrieben, da diese für die Diagnose und Charakterisie-
rung der Scrapie-Erkrankung von Bedeutung sind.
4.1.4.1 Histopathologische Auswertung der Obexregion
Die immunhistochemischen und histopathologischen Untersuchungen der Obexregion aller 42
Zypernziegen ergaben für 25 Ziegen TSE-positive und für 17 Ziegen TSE-negative Ergebnis-
se. Diese Resultate bestätigten die Ergebnisse des BioRad-Schnelltests. Die pathomorphologi-
schen Veränderungen und PrPSc-Ablagerungen der 25 Scrapie-positiv getesteten Obices wur-
den in den sechs Hauptkerngebieten #cl. motorius n. hypoglossi, #cl. parasympathicus n.
vagi (DMNV), #cl. tractus solitarii, #cl. cuneatus, #cl. tractus spinalis n. trigemini und in
Ergebnisse 61
den #uclei (Ncll.) olivares näher untersucht (s. Abb. 15). Von 25 Obices waren nur 22 nach
diesem Schema auswertbar, da in einigen weiter kaudal entnommenen Hirnstammproben
nicht alle Kerngebiete entsprechend angeschnitten worden waren. Als pathomorphologische
Veränderungen traten sowohl Vakuolisierungen der Neurone (nicht in den #cll. olivares) als
auch spongiforme Veränderungen des Neuropils auf, wobei letztere insgesamt häufiger auftra-
ten. Acht Tiere zeigten eine geringgradige, neun eine mittelgradige und fünf Tiere eine hoch-
gradige spongiforme Enzephalopathie der Obexregion. Die drei nicht in den Kerngebieten
auswertbaren Tiere wiesen eine geringgradige (ZYP 21) bzw. eine hochgradige (ZYP 34 und
40) spongiforme Enzephalopathie auf.
Abb. 15 Schematische Abbildung eines Querschnitts durch den Hirnstamm auf der Ebene der Obex-region. In den Untersuchungen berücksichtigte Kerngebiete sind mit den Nummern 1 - 6 ge-kennzeichnet (nach ANONYM 2010)
Tiere mit einer geringgradigen spongiformen Enzephalopathie der Obexregion (n=8) wiesen
im DMNV, #cl. tractus solitarii und dem #cl. tractus spinalis n. trigemini stets patho-
morphologische Veränderungen auf, welche in den beiden zuerst genannten Kerngebieten
vorwiegend geringgradig und in letzterem überwiegend mittelgradig ausgeprägt waren. In den
anderen drei untersuchten Kerngebieten waren diese pathomorphologischen Veränderungen
62 Ergebnisse
vorwiegend geringgradig ausgeprägt, konnten aber auch, wie v. a. für die #cll. olivares zu-
treffend (sechs von acht Tieren waren in diesem Kerngebiet ohne histopathologischen Be-
fund), vollständig fehlen.
Tiere mit einer mittelgradig ausgeprägten spongiformen Enzephalopathie der Obexregion
(n=9) wiesen ebenfalls alle pathomorphologische Veränderungen in dem DMNV, dem #cl.
tractus solitarii und dem #cl. tractus spinalis n. trigemini sowie zusätzlich auch im #cl. mo-
torius n. hypoglossi auf. Der Ausprägungsgrad der Veränderungen war vorwiegend mittelgra-
dig und nur der DMNV war überwiegend geringgradig betroffen. Der #cl. cuneatus und die
#cll. olivares waren vorwiegend mittelgradig betroffen und auch hier wiesen die #cll. oliva-
res häufig keine Veränderungen auf (sechs von neun Tieren waren in den #cll. olivares ohne
histopathologischen Befund).
Bei den Tieren mit einer hochgradigen spongiformen Enzephalopathie traten, mit Ausnahme
von den #cll. olivares, in allen Kerngebieten der Obexregion vakuoläre Veränderungen auf,
welche vorwiegend hochgradig ausgeprägt waren. In den #cll. olivares konnten dagegen nur
drei (v. a. geringgradig betroffen) von fünf Tieren positiv befundet werden. Die detaillierten
Ergebnisse der vakuolären Veränderungen der untersuchten Tiere sind in Abb. 16 (S. 63) auf-
geführt.
4.1.4.2 Immunhistochemische Auswertung der Obexregion
Immunhistochemisch waren insgesamt mittel- (10 Tiere) bzw. hochgradige (12 Tiere) diffuse
feingranuläre bis grobkörnige PrPSc-Ablagerungen mit wenigen Ausnahmen in allen sechs
untersuchten Kerngebieten der Obexregion nachweisbar. In einem wesentlich geringeren Ma-
ße gelang dagegen der PrPSc-Nachweis in der weißen Substanz der 22 Proben der Obexregion.
PrPSc konnte sowohl in den Glia- und Nervenzellen als auch extrazellulär im Neuropil nach-
gewiesen werden. Der Grad von intraneuronalen PrPSc–Ablagerungen in den Kerngebieten
dieser Ziegen konnte teilweise deutlich zwischen den verschiedenen Kerngebieten variieren.
Sie traten zu einem geringeren Grad in den Kerngebieten #cl. n. hypoglossi, DMNV und #cl.
tractus solitarii verglichen zu den anderen drei Kerngebieten auf. Ein unmittelbarer Zusam-
menhang zwischen dem Grad der PrPSc-Ablagerungen und dem Grad der pathologischen Ver-
änderungen in den betroffenen Kerngebieten war im direkten Vergleich nicht feststellbar.
Ergebnisse 63
A
Ncl.motorius n.hypoglossi
DMNV Ncl. tractussolitarii
Ncl.cuneatus
Ncl. tr.spinalis n.trigemini
Ncll. olivares
Zyp 8
Zyp 9*
Zyp 11
Zyp 17
Zyp 19
Zyp 25
Zyp 27
Zyp 31
mgr.
ggr.
hgr.
negativ
Gra
d de
r V
erän
deru
ngen
geringgradige spongiforme Enzephalopathie
B
Ncl.motorius n.hypoglossi
DMNV Ncl. tractussolitarii
Ncl.cuneatus
Ncl. tr.spinalis n.trigemini
Ncll. olivares
Zyp 3
Zyp 10
Zyp 13
Zyp 14
Zyp 20
Zyp 26
Zyp 29
Zyp 30
Zyp 33
mgr.
ggr.
hgr.
negativ
Gra
d de
r V
erän
deru
ngen
mittelgradige spongiforme Enzephalopathie
C
Ncl.motorius n.hypoglossi
DMNV Ncl. tractussolitarii
Ncl.cuneatus
Ncl. tr.spinalis n.trigemini
Ncll. olivares
Zyp 12
Zyp 16
Zyp 22
Zyp 35
Zyp 41mgr.
ggr.
hgr.
negativ
Gra
d de
r V
erän
deru
ngen hochgradige spongiforme Enzephalopathie
Abb. 16 Graduelle Ausprägung vakuolärer Veränderungen in den sechs Kerngebieten der Obexregion
der Damaskusziegen aus Zypern mit einer gering- (A), mittel- (B) und hochgradigen (C) spongiformen Enzephalopathie. Ncl./Ncll. = Nucleus/Nuclei, n. = nervi, tr. = tractus, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hochgradig. *Beurteilung des Ncl. tractus solitarii war für dieses Tier nicht möglich.
64 Ergebnisse
Die 10 Tiere mit insgesamt mittelgradigen PrPSc-Ablagerungen in der gesamten Obexregion
(s. Abb. 17, A) zeigten vorwiegend hochgradige PrPSc-Ablagerungen im DMNV. Die Kern-
gebiete #cl. tractus solitarii, #cl. tractus spinalis n. trigemini, #cl. motorius n. hypoglossi
und #cl. cuneatus waren dagegen vorwiegend mittelgradig von Ablagerungen betroffen. Die
#cll. olivares der Hälfte der untersuchten Tiere war gering-, die der anderen Hälfte mittelgra-
dig betroffen.
Die 12 Tiere mit insgesamt hochgradigen PrPSc-Ablagerungen in der Obexregion (s. Abb. 17,
B) wiesen, außer im #cl. motorius n. hypoglossi vorwiegend hochgradige Ablagerungen in
den untersuchten Kerngebieten auf. Der #cl. motorius n. hypoglossi war hingegen überwie-
gend mittelgradig betroffen.
A
Ncl. motorius n.hypoglossi
DMNV Ncl. tractussolitarii
Ncl. cuneatus Ncl. tractusspinalis n.trigemini
Ncll. olivares
Zyp 9*
Zyp 19
Zyp 22
Zyp 25
Zyp 26
Zyp 27
Zyp 29
Zyp 31
Zyp 33
Zyp 41
mgr.
ggr.
hgr.
negativ
Gra
d de
r Pr
PS
c -A
blag
erun
gen
B
Ncl. motorius n.hypoglossi
DMNV Ncl. tractussolitarii
Ncl. cuneatus Ncl. tractusspinalis n.trigemini
Ncll. olivares
Zyp 3
Zyp 8
Zyp 10
Zyp 11
Zyp 12
Zyp 13
Zyp 14
Zyp 16
Zyp 17
Zyp 20
Zyp 30
Zyp 35
mgr.
ggr.
hgr.
negativ
Gra
d de
r P
rPS
c -A
blag
erun
gen
Abb. 17 Graduelle Ausprägung der PrPSc-Ablagerungen in den sechs Kerngebieten der Obexregion der Damaskusziegen aus Zypern mit einem mittel- (A) bzw. hochgradigen (B) Gesamtbe-fund für die PrPSc-Ablagerungen der Obexregion. Ncl./Ncll. = Nucleus/Nuclei, n = nervi, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hochgradig. *Beurteilung des Ncl. tractus solitarii war für dieses Tier nicht möglich.
Zusätzlich zur Obexregion erfolgte die immunhistochemische Untersuchung weiterer Körper-
proben aus unterschiedlichen Gewebeanteilen nach dem in Abb. 5 (S. 31) dargestellten Sche-
ma. Von allen 42 Zypernziegen wurden mit dem Ln. retroph., der Tonsille, dem 3. Augenlid,
der Milz und dem GALT des Rektums fünf Proben des lymphoretikulären Systems, und mit
dem Plexus submucosus und myentericus des Rektums auch das enterische Nervensystem auf
PrPSc-Ablagerungen hin untersucht. Konnten in mindestens einer dieser Proben PrPSc-
Ablagerungen detektiert werden, so wurden zur Prüfung möglicher Übertragungswege zusätz-
lich das Euter, die Niere, der Uterus und, soweit vorhanden, die Plazenta gleichermaßen im-
munhistochemisch untersucht. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der immunhistochemi-
schen Untersuchungen zeigt Tab. 15 (S. 66).
Die in der Obexregion Scrapie-positiv getesteten 25 Ziegen zeigten zumeist eine breite Betei-
ligung des lymphoretikulären Gewebes, wobei die einzelnen Gewebe überwiegend mittel- bis
hochgradig von PrPSc-Ablagerungen betroffen waren. Abgesehen von drei Ziegen (ZYP 3,
ZYP 9 und ZYP 12) traten zusätzlich PrPSc–Ablagerungen im Plexus myentericus und bzw.
oder im Plexus submucosus auf. Von diesem breiten Verteilungsmuster des PrPSc in den ver-
schiedenen Proben des LRS wich ausschließlich die Ziege ZYP 40 ab, welche neben einem
mittelgradigen positiven Befund in der Obexregion PrPSc–Ablagerungen ausschließlich im
Ln. retroph. aufwies, welche zudem nur geringgradig ausgeprägt waren. Im ENS dieses Tieres
konnte PrPSc außerdem im Plexus myentericus des Rektums (hochgradig) detektiert werden
(s. Abb. 18, S. 67), während alle anderen untersuchten Proben ohne positiven Befund blieben.
Der Ln. retroph. (23/23), die Tonsille (20/22) und die Milz (24/25) des LRS waren am häu-
figsten und überwiegend hochgradig betroffen. Es waren nur zwei von 22 auswertbaren Pro-
ben der Tonsillen (2/22) und eine von 25 Proben der Milzen (1/25) PrPSc-negativ bei gleich-
zeitig positivem Befund für den Ln. retroph.. Weniger häufig, aber vorrangig mittel- bis
hochgradig betroffen, zeigten sich das 3. Lid (18/25) und das GALT (21/24) sowie das zu-
meist geringgradig betroffene ENS des Rektums (je 22/25). Bei 11 Ziegen konnten beide Ple-
xus des ENS positiv getestet werden (11/25), 21 Ziegen (21/25) zeigten PrPSc–positive Er-
gebnisse im Plexus myentericus, und im Plexus submucosus waren es 12 von 25 Ziegen.
66 Ergebnisse
Tab. 15 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung von Gewebeproben der Damaskuszie-gen aus Zypern. Nur Tiere mit mindestens einem positiven PrPSc-Befund sind aufgeführt.
24 negativ + k.P. negativ + + negativ negativ k.P. Ln. retroph. = Lymphonodus retropharyngealis medialis, LRS = lymphoretikuläres System, ENS = enterisches Nervensystem, Pl. my. = Plexus myentericus, Pl. sub. = Plexus submucosus, k. P. = kein Probenmaterial, 0 = keine Follikel im Anschnitt, Ergebnis nicht auswertbar, + bis +++ = gering-, mit-tel- bzw. hochgradige PrPSc-Ablagerungen, grau hinterlegt = Ziege ist PrPSc-negativ im Obex
PrPSc war im LRS, unabhängig davon, wie viele Follikel betroffen waren, in Makrophagen
und Lymphozyten nachweisbar. Ein fein- bis grobkörniges Reaktionsmuster war dabei vor-
herrschend, aber auch teilweise grobschollige PrPSc–Ablagerungen konnten v. a. in den
Makrophagen nachgewiesen werden. Häufig war auch ein sog. follikulär-dendritisches Mus-
ter im LRS nachweisbar, bei dem feinkörnige PrPSc-Ablagerungen in Form eines netzartigen
Ergebnisse 67
Reaktionsmusters auftraten. Im ENS gelang der Nachweis von fein- bis grobkörnigen PrPSc-
Ablagerungen v. a. intraneuronal sowie in einem geringeren Maße auch in den Gliazellen.
Abb. 18 Befunde der Ziege ZYP 40: PrPSc-Ablagerungen in Makrophagen des Lymphonodus retropharyngealis medialis (A) und in Neuronen des Plexus myentericus des Rektums (B); Immunhistochemie MAK 6C2, 40-er Objektiv, Balken = 10 µm
In der Plazenta gelang der Nachweis von PrPSc lediglich bei drei von 15 untersuchten Ziegen
(ZYP 21, 26 und 27). Die feinkörnig bis grobscholligen PrPSc–Akkumulationen waren ge-
ringgradig ausgeprägt und intrazellulär in Trophoblastenzellen und Epithelzellen des Endo-
metriums im Bereich der plazentären Kotelydonen nachweisbar (s. Abb. 19).
M
F
M
F
E
TT
A A1
Abb. 19 Scrapie-positive Ziege ZYP 27: geringgradige, feinkörnig bis grobschollige PrPSc-Ablagerungen in Trophoblasten- ( ) und Endometriumepithelzellen ( )der plazentären Ko-telydone; A und A1 = Originalbild und 2-fache Vergrößerung des Originals, M = maternaler Anteil, F = fetaler Anteil, T = Trophoblastenzelle, E = Endometriumepithelzelle; Immun-histochemie MAK 6C2, 40-er Objektiv, Balken 10 µm
68 Ergebnisse
In anderen fetalen bzw. in den maternalen Anteilen der Plazenta oder in uterinen Strukturen
war PrPSc nicht nachweisbar. Die Tiere ZYP 21, 26 und 27 wiesen außerdem vorwiegend ge-
ring bis mittelgradige PrPSc–Ablagerungen im Obex, in den meisten der untersuchten Proben
des LRS und hochgradige PrPSc–Ablagerungen im ENS auf (s. Tab. 15, S. 66).
In den untersuchten Proben von Euter (Proben von 23 Tieren untersucht) und Niere (Proben
von 24 Tieren untersucht) der Ziegen konnten keine PrPSc–Ablagerungen detektiert werden.
Eine der 17 in der Obexregion PrPSc-negativ getesteten Ziegen (ZYP 24) zeigte geringgradige
PrPSc-Ablagerungen im Ln. retroph., der Milz und dem lymphatischen Gewebe des Rektums
(s. Abb. 20). Die PrPSc-Ablagerungen konnten in Makrophagen und Lymphozyten der Ziege
ZYP 24 detektiert werden und im Ln. retroph. zeigte sich zusätzlich ein follikulär-
dendritisches Färbemuster. Die Untersuchung der Tonsille dieses Tiers war mangels Proben-
materials nicht möglich. Im 3. Augenlid gelang der Nachweis von PrPSc ebenso wenig wie im
Euter, im Uterus oder in der Niere.
Abb. 20 ZYP 24 (Obexbefund PrPSc-negativ): feinkörnige bis grobschollige PrPSc-Ablagerungen im lymphatischen Gewebe des Lymphonodus retropharyngealis medialis (A – Ein follikulär-dendritisches Färbemuster ist netzartig zwischen den Lymphozyten und Makrophagen er-kennbar.), der Milz (B) und des Rektum (C) der Ziege; Immunhistochemie MAK 6C2, 40-er Objektiv, Balken = 20 µm
4.1.5 Statistische Betrachtung aufgetretener Polymorphismen des Prion-Gens
Von den 42 untersuchten Ziegen aus Zypern, wurden 25 Ziegen mittels Untersuchung der
Ergebnisse 69
Obexregion im Schnelltest Scrapie-positiv und 17 Ziegen Scrapie-negativ getestet. Diese Be-
funde wurden durch die proteinbiochemische und immunhistochemische Untersuchung der
Obexregion bestätigt. Bei der immunhistochemischen Untersuchung ausgewählter Gewebe
des LRS konnte bei einer Ziege mit Scrapie-negativem Befund in der Obexregion PrPSc im
Ln. retroph., in der Milz und dem lymphatischen Gewebe des Rektums nachgewiesen werden.
Demnach wiesen insgesamt 26 Ziegen in mindestens einer der untersuchten Proben einen
positiven Befund auf (Gruppe 1) und 16 Ziegen blieben Scrapie-negativ (Gruppe 2).
Von den Tieren der Gruppe 1 wies ein Tier einen Polymorphismus des PRNP auf, von den
Ziegen der zweiten Gruppe wiesen fünf Tiere mindestens einen Polymorphismus auf. Mit
dem Vergleich dieser beiden Gruppen im Exakten Fisher-Test ergab sich ein signifikanter
Unterschied für das Auftreten von Polymorphismen bei den Tieren beider Gruppen (p =
0,023). Die Ziegen mit mindestens einem Polymorphismus auf den untersuchten Kodons
(142, 146, 151, 154, 211 oder 222) wiesen demnach signifikant häufiger einen Scrapie-
negativen Befund auf, als Ziegen ohne Polymorphismen auf diesen Kodons.
Beide Gruppen wurden gezielt in Hinblick auf die jeweils an den Kodons 142, 146, 151, 154,
211 und 222 auftretenden Polymorphismen verglichen. Wegen der bereits in vorhergehenden
Studien beobachteten erhöhten Resistenz gegen Scrapie (GOLDMANN et al. 1996;
BILLINIS et al. 2002; VACCARI et al. 2006; PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007,
2010), standen diese Kodons besonders im Fokus. Die mit dem Exakten Fisher-Test errechne-
ten p-Werte für aufgetretene Polymorphismen auf den Kodons zeigt Tab. 16 (S. 70).
Auf den Kodons 211 und 222 traten keine Polymorphismen auf, die Gruppen sind somit iden-
tisch (p = 1). An den Kodons 142 und 151 trat jeweils bei einem Tier mit negativem Scrapie-
Befund und an dem Kodon 154 trat bei einem positivem Tier ein Polymorphismus auf. Die
Unterschiede für die genannten Polymorphismen beider Gruppen sind mit p-Werten von je-
weils 0,381 nicht signifikant. Für das Kodon 146, auf dem vier Tiere mit einem negativen
Scrapie-Befund einen Polymorphismus zeigten, ließ sich dagegen ein signifikanter Unter-
schied (p = 0,016) zwischen den Gruppen feststellen. Die hier untersuchten Ziegen mit einem
Polymorphismus am Kodon 146 (N/D, S/S und N/S) waren demnach signifikant häufiger
Scrapie-negativ, als Ziegen ohne Polymorphismen auf diesem Kodon.
70 Ergebnisse
Tab. 16 Vergleich der Ziegen aus Zypern mit mindestens einem positiven bzw. mit negativem Scra-pie-Befund in Hinblick auf signifikante Unterschiede (p < 0,05 im Exakten Fisher-Test) be-züglich der Häufigkeiten von Polymorphismen an den gezielt untersuchten Kodons 142, 146, 151 und 154
(p = 0,016) *signifikanter Unterschied festgestellt, Met = Methionin, D = Asparaginsäure, H = Histidin, N = Asparagin, R = Arginin, S = Serin, grau hinterlegt = Leerfeld; berechnet in R, Version 2.8.1 (2008)
4.2 Pathogenesestudie Bovine Spongiforme Enzephalopathie in der Ziege
4.2.1 Untersuchung der Tonsillen- und Rektumbioptate
Die Tonsillen- und Rektumbioptate wurden von allen jeweils noch lebenden Ziegen der Herde
zu den Zeitpunkten 9 (n = 29), 12 (n = 21) und 20 Mon. p. i. (n =18) entnommen und in der
Immunhistochemie mittels MAK L42 oder MAK 6C2 untersucht (Tab. 17, S. 71). In den
Schnitten der Tonsillenbioptate konnten bis zu acht Follikel ausgewertet werden, in den Biop-
taten der Rektalschleimhaut waren es bis zu 11 Follikel. Von 68 entnommenen Tonsillenbiop-
taten waren sechs (8,8 %), von 68 entnommenen Rektumbioptaten 33 Bioptate (48,5 %) auf-
grund fehlender Follikel nicht auswertbar. In keinem der untersuchten und auswertbaren Fol-
likel konnte PrPSc nachgewiesen werden. Auch das die Follikel umgebende Gewebe wies kei-
ne detektierbaren PrPSc-Ablagerungen auf.
4.2.2 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 6 bis 14 Monate post inoculationem
Sechs Mon. p. i. erfolgte die planmäßige Euthanasie und Sektion von je drei Ziegen pro Ge-
notyp (3x I142R211Q222/IRQ, 3x I142Q211Q222/IRQ und 3x I142R211K222/IRQ), 8 Mon. p. i. muss-
te ein Tier (I142Q211Q222/IRQ) infolge einer Urolithiasiserkrankung außerplanmäßig euthana-
siert und seziert werden und 12 Mon. p. i. wurden acht weitere Ziegen entsprechend der Zeit-
vorgaben in der Versuchsplanung (3x I142R211Q222/IRQ, 2x I142Q211Q222/IRQ und 3x
I142R211K222/IRQ) euthanasiert und seziert. Ein Kontrolltier (ZG 27, I142R211Q222/IRQ) musste
Ergebnisse 71
ebenfalls außerplanmäßig infolge einer Erkrankung an Urolithiasis 14 Mon. p. i. in einer Not-
sektion seziert und beprobt werden (s. Sektionszeitpunkte in Tab. 9, S. 38). Keine der insge-
samt 19 sezierten Ziegen wies klinische Symptome für BSE auf.
Tab. 17 Verhältnis PrPSc-positiver Follikel zur Gesamtanzahl der auswertbaren Follikel in den Ton-sillen- und Rektalbioptaten der Ziegen aus den drei Gruppen mit unterschiedlichen Genoty-pen zu definierten Zeitpunkten post inoculationem
9 Mon. p. i. 12 Mon. p. i. 20 Mon. p. i. Tier Genotyp
Einen Überblick über die Proben und die Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung
gibt Tab. 18 (S. 73). Lediglich bei zwei Ziegen gelang dabei der Nachweis von PrPSc. Ein Tier
des wahrscheinlich weniger empfänglichen Genotyps I142Q211Q222/IRQ (ZG 22) der 12 Mon.
p. i. sezierten Ziegen, zeigte 364 Tage post inoculationem (Tage p. i.) geringgradige fein- bis
grobkörnige PrPSc–Ablagerungen in Makrophagen des lymphatischen Gewebes im Bereich
des Ileozäkaleingangs (s. Abb. 21). Bei einem weiteren Tier des empfänglichen
I142R211Q222/IRQ-Genotyps (ZG 24) konnten nach einer ähnlichen Inkubationszeit (371 Tage
p. i.) geringgradige PrPSc–Ablagerungen in einer Nervenzelle des Ggl. coeliacum mittels
MAK 6C2 nachgewiesen werden (s. Abb. 22, S. 73). In den immunhistologischen Untersu-
chungen der anderen Proben, in denen auch hunderte Follikel des LRS untersucht wurden,
gelang dagegen der Nachweis von PrPSc nicht.
Abb. 21 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen in Makrophagen
des lymphoretikulären Gewebes am Ileozäkaleingang der Ziege ZG 22 (I142Q211Q222/IRQ-Genotyp) 364 Tage post inoculationem; Immunhistochemie MAK 6C2 (A) und F99 (B), 40-er Objektiv, Balken 10 µm.
Ergebnisse 73
Abb. 22 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen in einer Nervenzel-le des Ganglion coeliacum der Ziege ZG 24 (I142R211Q222/IRQ-Genotyp) 371 Tage post ino-culationem; Immunhistochemie MAK F99; 40-er Objektiv, Balken 10 µm.
Tab. 18 Übersicht zu den Befunden der in der Immunhistochemie untersuchten Proben der Ziegen der drei PRNP-Genotypen aus der BSE-Pathogenesestudie zu den Zeitpunkten sechs und 8-14 Monate post inoculationem
0/1227 0/308 0/463 0/91 n.u. - - n.u. *Kontrolltier, Genotyp = Aminosäuren für die Kodons 142, 211 und 222; I = Isoleucin, K = Lysin, Q = Glutamin, R = Arginin; Ln. retroph. = Lymphonodus retropharyngealis medialis; IPP = ileale Peyer` Platte, ICE = Ileozäkaleingang, Lnn. jej. (caud.) = Lymphonodi jejunales (caudal), Ggl. coel. = Ganglion coeliacum; n. u. = nicht untersucht, NZ = Nervenzelle. Die zwei positiven Befunde sind farbig hervorgehoben. Für die Proben des lymphatischen Gewebes ist das Verhältnis für die Anzahl PrPSc-positiver Follikel zu den insgesamt untersuchten Follikeln angegeben.
74 Ergebnisse
4.2.3 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 24 und 25 Monate post
inoculationem
Vierundzwanzig Mon. p. i. wurden pro Genotyp ein Tier und zusätzlich eine hochgradig kli-
nisch an BSE erkrankte Ziege (ZG 01) seziert. Die Ziege ZG 01 gehörte dem vermutlich emp-
fänglicheren I142R211Q222/IRQ-Genotyp an und hatte ca. fünf Monate zuvor als Muttertier
zwei Lämmer ausgetragen. Einen Monat später erfolgte die Euthanasie und Sektion von zwei
klinisch auffälligen Ziegen (ZG 34, ZG 38) sowie eines Tieres ohne klinische Anzeichen (ZG
39). Alle drei Tiere wiesen ebenfalls den I142R211Q222/IRQ-Genotyp auf (s. Tab. 9, S. 38).
4.2.3.1 Klinik der 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten Tiere
Einen Überblick über die Klinik der vier erkrankten Ziegen gibt Tab. 19.
Tab. 19 Inkubationszeit, klinische Anzeichen und Zeitraum der Klinik der 24 und 25 Monate post inoculationem klinisch an BSE erkrankten Ziegen des I142R211Q222/IRQ-Genotyps
Tiere Inkubationszeit
(Tage post inoculationem) klinische Anzeichen Zeitraum der Klinik
ZG 33 743 Hypersensibilität am Kopf fraglich, da am Tag der Sektion aufgefallen
Die Ziege ZG 33, welche den I142R211Q222/IRQ-Genotyp aufwies, wurde 743 Tage p. i. plan-
mäßig seziert und fiel durch eine auffällige Scheu bei der Manipulation am Kopf kurz vor der
Sektion auf.
Die Ziege ZG 01 (I142R211Q222/IRQ-Genotyp) musste außerplanmäßig infolge einer behand-
lungsresistenten Gewichtsabnahme 753 Tage p. i. euthanasiert werden. Das Tier wies neben
einer deutlichen Abmagerung einen ausgeprägten Pruritus unbekannter Genese auf, was sich
in zahlreichen haarlosen Stellen im Bereich der Hornbasis sowie dorsal der Schwanzwurzel
infolge fortwährenden Kratzens zeigte. Das herabgesetzte Allgemeinbefinden fand bei der
Ziege seine Ausprägung in vermindertem Ohrspiel, unkontrolliertem Speicheln sowie stark
verlangsamter Nahrungsaufnahme bei erhaltener Fresslust. Nach Berührung in der Kopf- bzw.
Ergebnisse 75
Steißgegend konnten heftige Abwehrreaktionen des Tieres beobachtet werden, welche sich im
Bereich der Hinterhand in Form von Hypermetrien äußerten. Erste klinische Anzeichen in
Form von Hypersensibilitäten nach Berührung v. a. im Steißbereich waren bereits drei bis
sechs Wochen vor der Sektion des Tieres festzustellen.
Zwei weitere Ziegen (ZG 34, ZG 38) desselben Genotyps wiesen 765 Tage p. i. eine deutliche
BSE-Symptomatik auf. So zeigten die Tiere im Kopfbereich und in der Steißgegend deutliche
haarlose Stellen. Allerdings konnte bei beiden ein Pruritus-bedingtes Kratzen nicht beobachtet
werden. Aufgrund des Ausprägungsgrades dieser Fellveränderungen, wurde die Krankheits-
dauer auf mindestens 1-2 Wochen geschätzt. Die Tiere reagierten mit teilweise übermäßigen
Abwehrbewegungen auf Berührungen an den Hintergliedmaßen und im Kopfbereich und
zeigten ein stark reduziertes Allgemeinverhalten in Form von vermindertem Ohrenspiel und
verzögerter Nahrungsaufnahme bei erhaltener Fresslust.
4.2.3.2 Ergebnisse des Schnelltests und der proteinbiochemischen Untersuchungen
Von allen sieben Ziegen der drei Genotypen, die 24 und 25 Mon. p. i. seziert wurden (s.
Tab. 9, S. 38), erfolgte die Untersuchung von Stammhirnmaterial in einem IDEXX Herd
Chek-Schnelltest und im FLI-Test. Die Ergebnisse beider Tests sind in Tab. 20 dargestellt, die
Blots zeigt Abb. 23 (S. 77).
Tab. 20 Ergebnisse des IDEXX Herd Chek-Schnelltests und proteinbiochemischer Untersuchungen (FLI-Test) der 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten sieben Ziegen der BSE-Pathogenesestudie
di-, mono-, unglyk. = di-, mono-, unglykosylierte Form des PrPSc, MM = molekulare Masse, Differenz zur ScrapieRef. = Differenz aus molekularer Masse der unglykosylierten Form des PrPSc der Probe und des Scrapie-Referenzmaterials, AK = Antikörper, ± = Standardabweichung, Cut-off-Wert: 0,179 bzw. *0,254
76 Ergebnisse
Die planmäßig sezierten Ziegen ZG 10 (I142R211K222/IRQ) und ZG 13 (I142Q211Q222/IRQ) so-
wie ein weiteres zusätzlich seziertes Tier (ZG 39, I142R211Q222/IRQ) lagen mit ihren Tester-
gebnissen im IDEXX Herd Chek deutlich unter dem Grenzwert von 0,179 (ZG 13) bzw. unter
0,254 (ZG 10 u. ZG 39) und wurden als BSE-negativ bewertet. BSE-positiv waren die Ziegen
des I142R211Q222/IRQ-Genotyps ZG 33 (planmäßig seziert), ZG 01, ZG 34 und die ZG 38,
welche mit Testergebnissen von 3,105 bis 3,225 weit über dem Grenzwert von 0,179 lagen
und bereits eine BSE-Symptomatik zeigten.
Im FLI-Test wurde die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc von allen vier
im Schnelltest BSE-positiv getesteten Ziegen bestimmt. Mit Werten zwischen 18,3 und 18,8
kDa wiesen diese stets eine kleinere molekulare Masse auf als die jeweilige interne Scrapie-
Referenz. Das MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis lag mit Werten zwischen
0,01 und 0,16 sehr niedrig, das Verhältnis der diglykosylierten Form des PrPSc zur monogly-
kosylierten Form betrug 62,1-66,5 % zu 23,2-25,0 %. Der Anteil der diglykosylierten Form
des PrPSc der caprinen BSE-Proben (ZG 01, ZG 33, ZG 34 u. ZG 38) besaß damit einen deut-
lich größeren Anteil am Gesamtsignal als die interne Scrapie-Referenz und war gleichzeitig
auch bei allen Tieren eindeutig größer als 50 %. Somit wiesen alle Ziegen einen Anteil der
diglykosylierten Form des PrPSc über 50 %, ein Antikörperbindungsverhältnis von deutlich
unter 0,4 auf, und die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc der Proben war
mehr als 0,5 kDa geringer als die der internen Scrapie-Referenz. Die Proben wurden anhand
der Befunde als eindeutig BSE-ähnlich charakterisiert (Abb. 23, S. 77). Werte über 60 %,
welche die caprinen Isolate für den Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc zeigten (s.
Abb. 24, S. 77), wurden weder von der ovinen (489) noch von der bovinen (R8/07) BSE-
Referenz erreicht. Das caprine Scrapie-Isolat (ZYP 21) wies mit prozentualen Anteilen der
diglykosylierten zur monoglykosylierten Form des PrPSc von ca. 45 zu 32 % ähnlich wie ovi-
ne Scrapie (46:30 %) einen wesentlich geringeren Anteil der diglykosylierten Form auf (s.
Abb. 24, S. 77).
Ergebnisse 77
bovi
ne B
SE
capr
ine Sc
rapi
e
ZG 3
9
Mar
ker
ZG 3
4
ZG 3
8
23 kDa
23 kDa
bovi
ne B
SE
capr
ine Sc
rapi
e
ZG 0
1
Mar
ker
ZG 1
3
ZG 3
3
ZG 1
0
23 kDa
23 kDa
L42
P4
L42
P4
Abb. 23 Immunoblot zur Bestimmung des Glykosylierungsmusters, der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc und des MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungs-verhaltens der in der BSE-Pathogenesestudie 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten Ziegen (ZG); Marker: FLI-Marker
0
40
60
80
60
40
20
80 60 40 20
digl
ykos
ylie
rtes P
rPSc
%
monoglykosyliertes
PrP Sc %
unglykosyliertes PrPSc %
Abb. 24 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der vier caprinen BSE-Isolate ( ), des caprinen Scrapie-Isolats (ZYP 21- …), des ovinen (486 - ) und des bovinen BSE-Isolats (R 8/07 – ) sowie des ovinen Scrapie-Isolats (Stdl. 171 - ) in einem Dreiecksdiagramm. Auf der linken Achse ist der Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc, auf der rechten Achse der Anteil der monoglykosylierten Form des PrPSc und auf der unteren Achse der An-teil der unglykosylierten Form des PrPSc am Gesamtsignal im Westernblot dargestellt. Die Scrapie-Isolate positionieren sich klar distanziert vom ovinen und bovinen BSE-Isolat und den im gleichen Bereich angeordneten vier caprinen BSE-Isolaten.
78 Ergebnisse
4.2.3.3 Histopathologische Ergebnisse - Auswertung der Obexregion
Sechs ausgesuchte Kerngebiete der Obexregion (s. Abb. 15, S. 61) der Ziegen wurden nach
der H.-E.-Färbung auf TSE-spezifische histopathologische Veränderungen untersucht. Die
vier klinisch auffälligen von insgesamt sieben untersuchten Ziegen zeigten TSE-positive Be-
funde (spongiforme Auflockerung des Neuropils, vakuoläre Degeneration der Neurone), wo-
bei 2 Tiere (ZG01, ZG 34) hochgradige und je ein Tier mittel- (ZG 38) bzw. geringgradige
(ZG 33) Veränderungen aufwiesen (s. Abb. 25 A, S. 79).
Die zwei Ziegen mit der hochgradigen spongiformen Enzephalopathie (ZG 01, ZG 34) wiesen
in der Mehrzahl der untersuchten Kerngebiete hochgradige Alterationen auf. Lediglich in den
#cll. olivares der ZG 34 waren mittelgradige Veränderungen feststellbar. Der #cl. tractus
solitarii der Ziege ZG 01 war nicht beurteilbar. Das Tier ZG 38, welches eine mittelgradige
spongiforme Enzephalopathie aufwies, zeigte neben hochgradigen vakuolären Veränderungen
im DMNV und #cl. tractus spinalis n. trigemini geringgradige Veränderungen im #cl. cunea-
tus sowie einen negativen Befund in den #cll. olivares. Der #cl. tractus solitarii und der #cl.
motorius n. hypoglossi wiesen mittelgradige Veränderungen auf. Die Ziege ZG 33 mit einer
geringgradigen spongiformen Enzephalopathie, zeigte geringgradige Vakuolisierungen und
spongiforme Veränderungen ausschließlich im DMNV und im #cl. tractus spinalis n. trige-
mini. Der #cl. tractus solitarii konnte nicht beurteilt werden.
Die Ziegen ZG 10, ZG 13 und ZG 39 zeigten keine histopathologischen Veränderungen in der
Obexregion.
4.2.3.4 Immunhistochemischer PrPSc-&achweis – Auswertung der Obexregion
Sechs definierte Kerngebiete (vgl. Abb. 15, S. 61) der Obexregion wurden in der Immun-
histochemie auf PrPSc-Ablagerungen untersucht. Korrespondierend zu den histopathologi-
schen Befunden wiesen diese Obexregionen der vier klinisch erkrankten Ziegen hochgradige
PrPSc-Ablagerungen auf. Diese Ablagerungen waren fein- bis grobkörnig diffus überwiegend
in der grauen Substanz, aber auch in geringerem Maße in der weißen Substanz nachweisbar.
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung aller betroffenen Tiere sind in der
Abb. 25 B (S. 79) dargestellt.
Ergebnisse 79
A
mgr.
ggr.
hgr.
negativ
Gra
d de
r V
erän
deru
ngen
Ncl. motoriusn. hypoglossi
DMNV Ncl. tractus solitarii
Ncl. cuneatus Ncl. tr. spinalis n. trigemini
Ncll. olivares
ZG 01*
ZG 33*
ZG 34
ZG 38
B
Ncl. motoriusn. hypoglossi
DMNV Ncl. tractus solitarii
Ncl. cuneatus Ncl. tr. spinalis n. trigemini
Ncll. olivares
ZG 01*
ZG 33*
ZG 34
ZG 38
mgr.
ggr.
hgr.
negativ
Gra
d de
r V
erän
deru
ngen
Abb. 25: Grad der histopathologischen Veränderungen (A) und der PrPSc-Ablagerungen (B) definier-
ter Kerngebiete der Obexregion der vier klinisch erkrankten Ziegen (24/25 Monate post ino-culationem, BSE-Pathogenesestudie), Ncl./Ncll. = Nucleus/Nuclei, n. = nervi, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hoch-gradig. *Der Ncl. tractus solitarii dieser Tiere konnte nicht beurteilt werden.
Die Kerngebiete #cl. motorius n. hypoglossi, DMNV und #cl. tractus solitarii (letzteres
konnte bei den Ziegen ZG 01 und 33 nicht beurteilt werden) waren bei allen Tieren hochgra-
dig betroffen. Die Kerngebiete #cl. cuneatus, #cl. tractus spinalis n. trigemini und die #cll.
olivares wiesen dagegen nur bei der bereits im Endstadium erkrankten Ziege ZG 01 hochgra-
dige PrPSc-Ablagerungen auf. Bei den Ziegen ZG 33 und ZG 38 wurden die Ablagerungen als
mittelgradig bewertet. Die Ziege ZG 34 wies im #cl. tractus spinalis n. trigemini und in den
#cll. olivares mittelgradige PrPSc-Ablagerungen auf, der #cl. cuneatus war hochgradig von
den Ablagerungen betroffen.
80 Ergebnisse
Die PrPSc-Ablagerungen in den Kerngebieten konnten überwiegend extrazellulär sowie intra-
zellulär von Gliazellen und Neuronen nachgewiesen werden. Hochgradige PrPSc-Ablager-
ungen waren dabei nicht zwangsweise an hochgradige histopathologische Veränderungen
gebunden. Ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen dem Grad der vakuolären Verände-
rungen und dem Grad der PrPSc-Ablagerungen in den betroffenen Kerngebieten konnte nicht
festgestellt werden.
In der Obexregion der Ziegen ZG 10, ZG 13 und ZG 39 waren keine PrPSc-Ablagerungen
nachweisbar. Die Tiere wurden als TSE-negativ bewertet (s. auch Befunde der Histopatholo-
gie).
4.2.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung der &achgeburtsproben
Von der Nachgeburt der drei Muttertiere der verschiedenen PRNP-Genotypen wurden die
Kotelydonen der Plazenta und Proben des Nabelstrangs immunhistochemisch untersucht. Die
Beprobung der Nachgeburt des I142R211Q222/IRQ-Muttertiers ZG 01 im März 2009 erfolgte
nur 5 Monate vor der erkrankungsbedingten Euthanasie des Tieres im August 2009. Es waren
in keiner der untersuchten Proben PrPSc-Ablagerungen nachweisbar. Die beiden Muttertiere
der anderen Genotypen I142Q211Q222/IRQ (ZG 12) sowie I142R211K222/IRQ (ZG 25) waren auch
> 1000 Tage p. i. klinisch noch vollständig unauffällig.
Diskussion 81
5 Diskussion
5.1 Ziel der Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler Spongi-
former Enzephalopathien der Ziege
In den durchgeführten Studien wurden Damaskusziegen aus Zypern auf caprine Scrapie und
oral mit BSE inokulierte Ziegen aus einer Pathogenesestudie untersucht. Hierbei sollte der
Einfluss der PRNP-Genotypen auf die Empfänglichkeit ermittelt und im Falle der zyprioti-
schen Damaskusziegen mit weiteren anamnestischen Daten verglichen werden. Die Pathoge-
nese sollte mittels histopathologischer und immunhistologischer sowie proteinbiochemischer
Methoden zum Nachweis des PrPSc untersucht werden. Anhand der ermittelten proteinbio-
chemischen Eigenschaften sollte der Vergleich der caprinen Scrapie-Isolate mit den caprinen
BSE-Isolaten und einem zusätzlichen ovinen und bovinen BSE-Isolat erfolgen, um die Scra-
pie-Isolate eindeutig von BSE differenzieren zu können. Außerdem sollte die Möglichkeit der
horizontalen und vertikalen Übertragung bzw. der Übertragung im perinatalen Zeitraum un-
tersucht werden, und mit der Untersuchung der in der BSE-Pathogenesestudie in definierten
Zeitintervallen entnommenen Bioptate aus Tonsille und Rektum sollte überprüft werden, in-
wieweit der Einsatz einer prämortalen Diagnostik für die Detektion der caprinen BSE möglich
ist. Anhand der Erkenntnisse über den Genotyp-abhängigen pathogenetischen Verlauf von
TSEn bei Ziegen und anhand identifizierter Übertragungswege sollten schließlich Empfeh-
lungen zum Schutz des Verbrauchers und für eine effiziente Diagnostik und Bekämpfung
dieser Zoonose formuliert werden.
5.2 Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate aus Zypern
Scrapie wurde auf Zypern erstmals 1985 bei Schafen (TOUMAZOS 1988) und ein Jahr später
bei Ziegen (TOUMAZOS 1991) beschrieben und war vermutlich über den Handel mit infi-
zierten Schafen nach Zypern gelangt. Ziegen werden in Zypern traditionell überwiegend zu-
sammen mit Schafen in einer Herde gehalten. Trotz der Anwendung von Tierseuchenkon-
trollmaßnahmen (frühe Diagnostik, Quarantänemaßnahmen, teilweise oder komplette Keu-
lung betroffener Herden), hat sich die Infektion mittlerweile auf den gesamten zypriotischen
Schaf- und Ziegenbestand ausgebreitet (GRAVENOR et al. 2004).
Die insgesamt 42 untersuchten Damaskusziegen aus Zypern wurden anhand klinischer Anzei-
82 Diskussion
chen für Scrapie aus den Herden ausgewählt und seziert. Die Obexregion der Tiere wurde
mittels BioRad-Schnelltest auf PrPSc untersucht und die Kodons 142, 146, 151, 154, 211 so-
wie 222 des PRNP aller Tiere wurden sequenziert. Die Untersuchung der pathogenetischen
Verbreitung des PrPSc erfolgte immunhistochemisch in Proben der Obexregion, des LRS und
des MDT sowie im Euter, in der Niere, dem Uterus und der Plazenta. Mit der Bestimmung
des Glykosylierungsverhältnisses, der molekularen Masse der unglykosylierten Form des
PrPSc und des MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnisses der Isolate im Immu-
noblot (FLI-Test) erfolgte die proteinbiochemische Charakterisierung der Isolate und deren
Differenzierung von caprinen, ovinen und bovinen BSE-Isolaten. Die PK-Resistenz fünf aus-
gewählter Isolate wurde außerdem in einem Langzeitverdau über 48 h ermittelt und mit der
PK-Resistenz von BSE-Isolaten kleiner Wiederkäuer (caprine und ovine BSE) verglichen.
Siebzehn der 42 Ziegen zeigten im BioRad-Schnelltest ein PrPSc-negatives, 25 Ziegen ein
PrPSc-reaktives Ergebnis. Diese Befunde der Obexregion konnten immunhistochemisch bestä-
tigt werden. In den weiteren immunhistochemisch untersuchten Proben konnten bei 26 Ziegen
(Obex PrPSc-positiv n = 25, Obex PrPSc-negativ n = 1) in mindestens einer der Proben des
LRS oder ENS (MDT) PrPSc-Ablagerungen detektiert werden. In fast allen Tieren zeichnete
sich, bei einer einzelnen zweijährigen Ziege selbst bei negativem Obexbefund (ZYP 24), eine
breite Beteiligung dieser Systeme ab. Eine Ziege (ZYP 40) mit positivem Obex-Befund zeigte
dagegen mit auf den Ln. retroph. (geringgradig) und das ENS des Rektums (hochgradig) be-
schränkten PrPSc-Ablagerungen ein abweichendes PrPSc-Verteilungsmuster. Dieses Tier wies,
im Unterschied zu den anderen PrPSc-positiven Ziegen (alle homozygot
I142N146R151R154R211Q222), am Kodon 154 einen R/H-Polymorphismus auf. In der Plazenta von
drei Ziegen (Obex PrPSc-positiv) konnte PrPSc nachgewiesen werden. Im Euter, in der Niere
und im Uterus war PrPSc nicht detektierbar.
Von den Ziegen, die mindestens einen Polymorphismus auf den untersuchten Kodons des
PRNP aufwiesen, zeigten signifikant mehr Tiere einen negativen Befund für den PrPSc-
Nachweis, als von denen ohne Polymorphismen. Ein weiterer signifikanter Unterschied ließ
sich für vier Ziegen mit einem Polymorphismus am Kodon 146 feststellen. Ziegen, die einen
Polymorphismus am Kodon 146 zeigten, waren signifikant häufiger Scrapie-negativ, als Zie-
gen, die an diesem Kodon keinen Polymorphismus zeigten.
Diskussion 83
Insgesamt acht der 25 Ziegen mit PrPSc-positivem Obexbefund wiesen im FLI-Test, abwei-
chend von allen anderen Isolaten, einen Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc von mehr
als 50 % und damit ein eher BSE-typisches Glykosylierungsmuster auf. Anhand der Gesamt-
heit der proteinbiochemischen Eigenschaften wurden diese Isolate aber ebenso wie die ande-
ren 17 Isolate als Scrapie-ähnlich eingestuft.
5.2.1 Der Einfluss des Prion-Gen-Genotyps
In einer ersten umfassenderen Studie über Genotypen zypriotischer Ziegen (PAPASAVVA-
STYLIANOU et al. 2010) zeigten die Tiere am häufigsten den Wildtyp-Genotyp
I142N146R151R154. Polymorphismen traten vorwiegend am Kodon 146, 154 und 240 auf, aber
auch am Kodon 142 und 151 konnten Polymorphismen festgestellt werden. Diese Poly-
morphismen des caprinen PRNP wurden bereits in vorhergehenden Untersuchungen in Her-
den unterschiedlicher Länder beschrieben (GOLDMANN et al. 1996; BILLINIS et al. 2002;
KUROSAKI et al. 2004; ZHANG et al. 2004; PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007).
PAPASAVVA-STYLIANOU et al. (2010) untersuchten insgesamt 717 Damaskusziegen bzw.
mischrassige Damaskusziegen aus 75 unterschiedlichen Herden, die als Scrapie-positiv (kli-
scher sowie proteinbiochemischer Methoden und unter Einbeziehung genetischer Daten zu
charakterisieren. Zur Unterscheidung der caprinen Scrapie von den caprinen, ovinen und bo-
vinen BSE-Infektionen wurden die Glykosylierungsmuster, die molekularen Massen des
unglykosylierten krankheitsassoziierten Prion-Proteins (PrPSc) nach Proteinase K (PK)-
Verdau und die P4-L42-Antikörperbindungsverhältnisse (sog. FLI-Test) herangezogen. Wei-
terhin wurden relevante Gewebe zur Identifizierung pathogenetischer Wege und von horizon-
talen und vertikalen Übertragungswegen sowie Biopsien für die Beurteilung der prämortalen
Diagnostik immunhistologisch untersucht. Anhand der Erkenntnisse sollten Empfehlungen
zum Schutz des Verbrauchers, für eine effizientere Diagnostik und für die Bekämpfung der
Tierseuchen formuliert werden.
Im zentralen Nervensystem (ZNS) von 25 Ziegen aus Zypern war neben vakuolären Verände-
rungen PrPSc immunhistochemisch und mittels Schnelltest nachweisbar. Mit dem FLI-Test
konnte jeweils das Vorliegen einer Scrapie-Infektion bestätigt und eine BSE-Infektion ausge-
schlossen werden. Acht Scrapie-Isolate zeigten ein eher für BSE-typisches Glykosylierungs-
muster mit einem Anteil des diglykosylierten PrPSc von mehr als 50 Prozent, was auf einen
besonderen Scrapie-Stamm hindeutet. Die Bestimmung der PK-Resistenz erfolgte im Lang-
zeitverdau (48 Stunden) für fünf ausgewählte Isolate, die eine deutlich geringere PK-
Resistenz als caprine und ovine BSE-Vergleichsproben zeigten. Die PK-Resistenz bietet sich
daher als ergänzender Parameter an, um Scrapie- und BSE-Isolate zu unterscheiden.
PrPSc-Ablagerungen ließen sich regelmäßig in Proben des lymphoretikulären Systems (LRS)
nachweisen, selbst bei negativem Befund in der Obexregion. Daher eignet sich die Befundung
des LRS für die präklinische Scrapie-Diagnostik bei Ziegen. Eine Ziege (ZYP 40) mit positi-
vem Obex-Befund, zeigte ein auf den Lymphonodus retropharyngealis medialis und das ente-
Zusammenfassung 101
rische Nervensystem beschränktes abweichendes PrPSc-Verteilungsmuster, welches durch
deren R/H-Polymorphismus am Kodon 154 bedingt sein könnte. Dieser Einzelbefund gestat-
tet aber keine sicheren Aussagen. Der PrPSc-Nachweis gelang erstmalig in caprinem Plazen-
targewebe. Dieses Organ sollte hinsichtlich seiner Infektiosität und Rolle bei der Übertragung
von Scrapie weiterführend getestet werden. Eine reduzierte Scrapie-Empfänglichkeit abhän-
gig vom PRNP-Genotyp konnte für die Ziegen bestätigt werden, die mindestens einen Poly-
morphismus aufwiesen (p = 0,023) und davon insbesondere für die mit einem als protektiv
geltenden Polymorphismus auf dem Kodon 146 (p = 0,016).
In der BSE-Pathogenesestudie wurden 13 Ziegen des I142R211Q222/IRQ- und je 12 Ziegen des
I142Q211Q222/IRQ- bzw. I142R211K222/IRQ-Genotyps oral mit je einem Gramm caprinem, BSE-
positivem Hirnmaterial inokuliert. Von den sechs bis 14 Monate post inoculationem (p. i.)
sezierten 19 Ziegen konnte nach der Untersuchung des LRS, des ZNS und peripheren Ner-
vensystems sowie des Magen-Darm-Trakts lediglich im lymphatischen Gewebe des Ileozäka-
leingangs einer präklinischen Ziege (ZG 22, I142Q211Q222/IRQ-Genotyp, 364 Tage p. i.) und
im Ganglion coeliacum einer weiteren Ziege (ZG 24, I142R211Q222/IRQ-Genotyp, 371 Tage p.
i.) PrPSc nachgewiesen werden. Klinisch erkrankten bisher vier Ziegen (I142R211Q222/IRQ-
Genotyp, 743 bis 765 Tage p. i.) und zeigten Pruritus, Hyperästhesien und Abmagerung bei
erhaltener Fresslust über zwei bis sechs Wochen. Neben vakuolären Veränderungen war PrPSc
immunhistochemisch und mittels Schnelltest in der Obexregion nachweisbar. Der FLI-Test
bestätigte das Vorliegen von BSE. In keiner der Tonsillen- und Rektumbioptate und auch
nicht in den Nachgeburten der drei Muttertiere ließ sich PrPSc nachweisen.
Caprine BSE scheint sich demnach nach oraler Aufnahme innerhalb von ein bis zwei Jahren
vom Verdauungstrakt über das periphere Nervensystem und vermutlich in geringerem Maße
über das LRS bis in das Gehirn der Ziege auszubreiten. Die prämortale Diagnostik anhand
von Bioptaten, erscheint daher nicht zuverlässig zu sein. Zur Übertragung von BSE über die
Nachgeburt ist aufgrund der wenigen verfügbaren Daten derzeit keine Aussage möglich. Die
sich andeutende höhere Empfänglichkeit der Ziegen des I142R211Q222/IRQ-Genotyps für BSE
muss mit weiteren Daten untermauert werden.
Am Ende dieses langjährigen Infektionsexperiments werden valide Daten für die Definition
von spezifiziertem Risikomaterial, zur Wichtung diagnostischer Verfahren und zu BSE-
resistenteren Genotypen bei Ziegen zur Verfügung stehen.
102 Summary
7 Summary
Susanne Freyse
Studies of pathogenesis and characterization of transmissible spongiform
encephalopathies in goats
Scrapie infected goats of Cyprus and goats of an oral bovine spongiform encephalopathy
(BSE) pathogenesis study were examined with the objective of characterizing these
transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) by using histopathological,
immunohistological and biochemical methods and also by taking genetic data into
consideration. To differentiate between caprine scrapie and caprine, ovine and bovine BSE
infections, the glycosylation patterns, the molecular masses of the non-glycosylated forms of
the pathological isoform of the prion protein (PrPSc) after proteinase K (PK) digestion and the
P4/L42 antibody binding ratios were analyzed (FLI-test). In addition, relevant tissues and
biopsies were examined immunohistochemically to identify pathogenic pathways as well as
horizontal and vertical transmission routes, and to evaluate effective pre-mortal diagnostics.
Based on the findings, recommendations for consumer protection, for a more efficient
diagnostic and for better control of the epizootics should be given.
In the central nervous system (CNS) of 25 Cypriot goats, apart from vacuole formations PrPSc
could be detected immunohistochemically and by applying a rapid test system. Based on the
FLI-test, a scrapie infection could be confirmed for all the 25 isolates and BSE could be
excluded without any exception. Eight of the scrapie isolates exhibited a more BSE-like
glycosylation pattern, owing a fraction of the diglycosylated form of PrPSc of more than 50
percent, which indicated the existence of a still unknown scrapie strain. For five selected
isolates, proteinase K long term resistance against proteolysis was determined over 48 hours.
The five scrapie isolates were clearly less PK resistant than caprine and ovine BSE references.
Therefore, PK resistance measurement can be applied as a supplementary parameter to
differentiate scrapie from BSE isolates. Regularly, PrPSc accumulations could be detected
immunohistochemically in tissue samples of the lympho-reticular system (LRS), even when
the obex sample was diagnosed to be PrPSc negative. The examination of lymphatic tissues is
therefore suited for pre-mortal scrapie diagnostics in goats. One goat (ZYP 40), obex PrPSc
positive, exhibited PrPSc accumulation restricted to the retropharyngeal lymph node and
Summary 103
enteric nervous system, in conjunction with R/H polymorphism at codon 154. Interrelations
may exist, but more detailed conclusions are hindered by the low number of goats examined.
For the first time, PrPSc was detected in caprine placental samples. This organ should be
investigated more intensive concerning its infectivity and significance for scrapie
transmission. A reduced scrapie susceptibility according to the PRNP genotype was proven
for the goats with at least one polymorphism (p = 0,023), and especially for those showing
polymorphisms at codon 146 (p = 0,016).
In an experimental pathogenesis study 13 goats of the I142R211Q222/IRQ genotype and 12 goats
of the I142Q211Q222/IRQ and the I142R211K222/IRQ genotype, respectively, were orally
inoculated with one gram of caprine BSE-positive brain material. From the 19 goats, which
had been necropsied from six up to 14 months post inoculationem (p. i.) at the latest, the LRS,
the central and peripheral nervous system and the gut were examined immuno-
histochemically. PrPSc could be detected in the lymphatic tissue of the ileo-caecal junction of
one pre-clinical goat (ZG 22, I142Q211Q222/IRQ genotype, 364 days p. i.) only, and in the
celiac ganglion of another goat (ZG 24, I142R211Q222/IRQ genotype, 371 days p. i.). Four goats
became clinically affected (I142R211Q222/IRQ-genotype, 743 to 765 days p. i.) with symptoms
of pruritus, hyperaesthesia and cachexia, but with unchanged appetite over a two to six week
period. Apart from vacuole formations, PrPSc deposits could be detected
immunohistochemically and by rapid testing in the obex samples. BSE was confirmed in the
FLI test. PrPSc could not be detected, neither in the biopsies of the tonsils and the rectum, nor
in the afterbirths of the three goats.
These preliminary results show that orally administered caprine BSE spreads from the gut to
the brain within one to two years, passing the peripheral nervous system and assumingly less
the LRS. Therefore, pre-mortal diagnostic of caprine BSE based on biopsies does not seem to
be rather reliable. Due to the poor data, the question concerning transmission of BSE via the
afterbirth remains unanswered, yet. Goats of the I142R211Q222/IRQ genotype appear to be more
susceptible to BSE than those of the two other genotypes. This trend has to be further
substantiated.
After finishing this long-term infection study, valid data will be available to define specific
risk material for consumer protection, to interpret diagnostic methods and to give concrete
recommendations for the selection of highly BSE resistant genotypes for breeding.
104 Literaturverzeichnis
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8.1 Gesetze und Verordnungen
2001
Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des europäischen Parlaments und des Rates vom 22.Mai 2001 mit Vorschriften zur Verhütung, Kontrolle und Tilgung bestimmter transmissibler spongifor-mer Enzephalopathien (zuletzt geändert durch Verordnung (EU) #r. 189/2011 der Kommissi-
on vom 25. Februar 2011, L53/56)
(Amtsblatt L147/1 vom 31.05.2001)
2002
Verordnung zur fleischhygienerechtlichen Untersuchung von geschlachteten Rindern auf BSE (BSE-Untersuchungsverordnung - BSEUntersV) vom 18. September 2002 (zuletzt geändert
durch Artikel 1 der Verordnung vom 13. Juli 2011, BGBl. I S. 1390) (BGBl. I S. 3730; 2004 I S. 1405)
Literaturverzeichnis 131
2005
Verordnung (EG) Nr. 36/2005 der Kommission vom 12. Januar 2005 zur Änderung der An-hänge III und X der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der epidemiologischen Überwachung auf transmissible spongiforme En-zephalopathien bei Rindern, Schafen und Ziegen
(Amtsblatt L10/9 vom 13.1.2005)
2006
Verordnung (EG) Nr. 1041/2006 der Kommission vom 7. Juli 2006 zur Änderung des An-hangs III der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Überwachung transmissibler spongiformer Enzephalopathien bei Schafen
(Amtsblatt L187/10 vom 8.7.2006)
2010
Verordnung (EU) Nr. 956/2010 der Kommission vom 22. Oktober 2010 zur Änderung des Anhangs X der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Liste der Schnelltests
(Amtsblatt der Europäischen Union L279/10 vom 23.10.2010)
132 Anhang
9 Anhang
9.1 Material
9.1.1 Antikörper gegen das Prion-Protein
Tab. 21 Übersicht über die in der Immunhistochemie und im Westernblot verwendeten Erstantikör-per
• Ziege-Anti-Maus IgG, spezifisch für die H + L-Ketten, mit alkalischer Phosphatase
gekoppelt (115-035-062, Dianova, Hamburg)
Anhang 133
• Anti-Histidin-Antikörper, RGS – His, zur Detektion des mit einem Histidin-Tag ver-
sehenen FLI-Markers (Qiagen, Hilden).
9.1.1.2 Vorbehandlung für die in der Immunhistologie verwendeten Antikörper
Tab. 22 Übersicht über die Vorbehandlungen der in der Immunhistologie verwendeten monoklonalen Antikörper mittels Ameisensäurebad, Blockierung der endogenen Peroxidase durch Was-serstoffperoxid (H2O2), Hitzebehandlung im Autoklaven, verschiedener Puffermedien oder Proteinase K (PK)-Verdau
Antikörper Ameisensäure Methanol
+H2O2 Autoklav
(121 °C, 3 bar) Puffer PK-Verdau
6C2 30 min 30 min 20 min Zitratpuffer,
(pH 6,0)
F99 30 min 30 min 20 min Zitratpuffer,
(pH 6,0)
L42 15 min 30 min PK-Puffer
5 min PK-Puffer, 15 min PK-Gebrauchslösung bei 37 °C
9.2.1.2 Entparaffinisierung und Rehydrierung der histologischen Schnitte
Xylol I u. II je 5 Minuten
Isopropanol 96 %-ig I u. II je 3 Minuten
Ethanol 96 %-ig 2 Minuten
134 Anhang
Ethanol 70 %-ig 2 Minuten
Ethanol 50 %-ig 2 Minuten
9.2.1.3 Dehydrierung der histologischen Schnitte
Ethanol 50 %-ig 2 Minuten
Ethanol 70 %-ig 2 Minuten
Ethanol 96 %-ig 2 Minuten
Isopropanol 96 %-ig I u. II je 2 Minuten
Xylol I u. II je 3 Minuten
9.3 Schemata zur Auswertung von histologisch untersuchten Schnitten
Tab. 23 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Ausprägungsgrades vakuolärer Verände-rungen (Vakuolisierungen, spongiforme Veränderungen) in den Kerngebieten der Obexregi-on (nach Färbung mit Hämatoxylin-Eosin)
geringgradig ≤ 5 Vakuolen (10- er Objektiv)
mittelgradig 5-10 Vakuolen (10- er Objektiv)
hochgradig > 10 Vakuolen (10- er Objektiv)
Tab. 24 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-exprimierender Folli-kel/Ganglien an der Gesamtanzahl der untersuchten Follikel/Ganglien in der immunhisto-chemischen Untersuchung des lymphoretikulären Systems/enterischen Nervensystems
geringgradig weniger als 30 % der untersuchten Follikel/Ganglien positiv
mittelgradig weniger als 50 % der untersuchten Follikel/Ganglien positiv
hochgradig mehr oder gleich 50 % untersuchten der Follikel/Ganglien positiv
Tab. 25 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-exprimierender Zellen an der Gesamtzellzahl der Gewebestruktur für die immunhistologischen Untersuchungen der Obex-region
+ geringgradig einzelne positive Zellen, maximal 20 % der Gesamtzellzahl
++ mittelgradig viele positive Zellen, maximal 60 % der Gesamtzellzahl
+++ hochgradig (fast) alle Zellen positiv, 80-100 % der Gesamtzellzahl
Anhang 135
9.4 Tabellarische Übersichten über die in den Sektionen entnommenen Proben
Tab. 26 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Kopfes und des Magen-Darm-Trakts
*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn. = Lymphonodus/Lymphonodi, M. = Musculus, N. = Nervus
136 Anhang
Tab. 27 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Tierkörpers
*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; 1Proben nur bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn. = Lymphonodus/Lymphonodi, M. = Musculus, N. = Nervus
Anhang 137
Tab. 28 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Zentralen Nervensystems
Proben des Zentralen &ervensystems
C 1 – 2* L 5 – L 6
C 2 – 3 Cauda equina
C 3 – 4 Cerebellum
C 4 – 5 Mesencephalon
C 5 – 6 Pons
C 6 – 7 Medulla cranialis
C 7 – T 2 Obex
T 2 – T 4 Medulla caudalis
T 4 – T 6 Gehirn1 (Anteile cranial der Pons)*
T 6 – T 8* Rhinencephalon
Dorsale Wurzelganglien C1 – C6 Cerebrum frontalis
T 9 – 10 Cerebrum parietalis
T 10 – 11 Cerebrum occipitalis
T 12 – L 1 Basalkerne
L 2 – L 3* Thalamus
L 3 – L 4
*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; 1bei zwei Dritteln der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie und bei allen Damaskusziegen aus Zypern wurde das Gehirn paramedian ge-teilt und konserviert, bei einem Drittel der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie wurde das Gehirn in Einzelproben zerteilt und konserviert; C = Nervi cervicales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae cervica-les, L = Nervi lumbales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae lumbales, T = Nervi thoracales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae thoracales, grau hinterlegt = Leerfeld
138 Anhang
9.5 Protokolle zur Fraktionierung der in der BSE-Pathogenesestudie entnommenen
Blut- und Milchproben
9.5.1 Protokoll zur Fraktionierung von caprinem Citrat-Vollblut
Die Proben sind TSE-steril zu entnehmen. Das Mischungsverhältnis von Citratpuffer und Blut
beträgt 1 ml : 9 ml.
1. Gewinnung von Thrombozyten und Plasma aus Citratvollblut:
- entnommene Blutproben für 30 min bei 200 g und Raumtemperatur (RT) ohne Bremse
zentrifugieren
- thrombozytenreiches Plasma (Überstand) sehr vorsichtig Abnehmen (Einmalpasteurpipette)
- thrombozytenreiches Plasma und verbliebene Erythrozyten für 10 min bei 2000 g und RT
ohne Bremse zentrifugieren (Weiterbearbeitung der roten Blutzellen erfolgt unter Punkt 2.
und Punkt 3.)
- Plasma über dem Thrombozytenpellet verwerfen und das Thrombozytenpellet ohne Luftin-
sufflation in 2 ml 1 x PBS resuspendieren, auf zwei 1,5 ml-Reaktionsgefäße verteilen und
diese für 5 min bei 700 g und RT zentrifugieren
- Überstand verwerfen und Pellets bei -70 °C einfrieren
2. Gewinnung der Leukozyten (buffy coat-Zellen) aus Citratvollblut:
Fortsetzung von Punkt 1.:
- Plasma über Erythrozyten abnehmen und 10 min bei 2000 g und RT zentrifugieren
- zellfreies Plasma vorsichtig abnehmen, alliquotieren und bei –70 °C lagern
- buffy coat-Zellen über Erythrozyten abnehmen und Erythozyten-Lysispuffer zugeben (fünf-
faches Volumen an Erythrozyten-Lysispuffer zur hypotonen Lyse der Erythrozyten zugeben)
invertieren und 5 min bei RT inkubieren
- mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und für 10 min bei 300 g und RT mit Bremse zentrifugieren
- Überstand verwerfen, Leukozytenpellet erneut in 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer resuspendie-
ren dann 5 min bei RT inkubieren, mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und für 10 min bei 300 g
und RT mit halber Bremse zentrifugieren
Anhang 139
- Überstand verwerfen, Pellet in 10 ml 1 x PBS resuspendieren auf 50 ml mit 1 x PBS auffül-
len und 10 min bei 300 g und RT zentrifugieren
- den Überstand verwerfen das Pellet in 6 ml 1 x PBS resuspendieren, in drei 2 ml-
Reaktionsgefäße alliquotieren dann 5 min bei 300 g abzentrifugieren
- Überstand verwerfen und Leukozytenpellet bei –70 °C einfrieren
3. Gewinnung der Erythrozyten aus Citratvollblut
Fortsetzung von Punkt 1.:
- Erythrozyten invertieren, alliquotieren und bei -70 °C einfrieren
9.5.2 Protokoll zur Verarbeitung von Serumproben
Die Proben sind TSE-steril zu entnehmen.
- Serumröhrchen nach Abnahme bei RT für 3-4 h stehen lassen
- Röhrchen für 5 min bei 300 g und RT ohne Bremse zentrifugieren
- Serumüberstand abnehmen für 10 min bei 2000 g bei RT zentrifugieren
- gereinigten Serumüberstand abnehmen, alliquotieren und bei -70 °C lagern
9.5.3 Protokoll zur Fraktionierung von capriner Vollmilch
Die Proben sind TSE- steril zu entnehmen.
- Milch- und Kolostrumproben in PBS mit 10 mM EDTA 1 : 2 bzw. 1 : 5 verdünnen
- bei 780 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren
- Rahm mit Einwegteelöffel abnehmen und bei -70 °C einfrieren
- Rest der Probe schwenken bis die Zellen vom Boden vollständig aufgewirbelt sind, dann
durch ein 100 µm Zellsieb geben, erneut bei 780 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren
- entrahmte Milch über Zellpellet abnehmen, alliquotieren bei –70 °C einfrieren
- Zellpellet dreimal in PBS mit 10 mM EDTA waschen, zwischen den Waschschritten jeweils
bei 1900 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren, danach das Zellpellet bei -70 °C einfrieren
- Zellen vor dem Einfrieren in einer Zählkammer zählen
140 Anhang
9.6 Ergebnistabellen
9.6.1 Damaskusziegen aus Zypern
9.6.1.1 Ergebnisse des FLI-Tests
Tab. 29 Vergleich der klassischen caprinen und ovinen Scrapie-Isolate und der caprinen, ovinen und bovinen BSE-Isolate nach den Glykosylierungsverhältnissen (4 Gelläufe), dem Antikörper-bindungsverhältnis (2 Gelläufe), der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc sowie deren Differenz zur unglykosylierten Form des PrPSc der internen Scrapie-Referenz (4 Gelläufe)
lykosylierungsverhältnisse der di-, mono- und unglykosylierten F
orm des P
rPS
c, molekula-
re Masse der unglykosylierten PrP
Sc-F
orm, L
angzeit-Proteinase K
-Verdau und A
ntikörper-bindungsverhalten von einem
caprinen und ovinen BS
E-Isolat und fünf ausgesuchten capri-
nen Scrapie-Isolaten der Z
ypernziegen
AK-
Bindungs-
verhältnis
P4/ L42
0,16
0,16
0,81
1,17
1,49
1,68
1,23
48 h
38,7 ±2,1
32,7 ±7,3
27,6 ± 4,5
19,7 ± 1,9
20,5 ± 3,4
19,5 ± 2,0
23,3 ± 3,4
24 h
62,8 ±5,2
52,9 ±3,2
42,1 ±3,1
32,9 ±3,0
34,3 ±3,6
33,8 ±2,7
32,6 ±4,8
6 h
79,2 ± 4,3
74,6 ± 6,3
60,7 ± 6,1
68,0 ± 2,5
66,1 ± 2,5
72,4 ± 5,8
61,1 ± 5,0
Langzeit-Proteinase K-Verdau (%)
1 h
100
100
100
100
100
100
100
MM (kDa)
unglyk. PrPSc
18,8 ±0,6
18,7 ±0,7
18,7 ±0,6
18,9 ±0,7
19,3 ±0,2
19,1 ±0,1
19,0 ±0,2
unglyk. PrPSc
13,0 ±2,3
15,6 ±1,3
21,9 ±1,5
18,8 ±2,0
22,4 ±5,8
19,2 ±1,3
18,7 ±1,1
monoglyk. PrPSc
25,0 ±1,9
25,8 ±1,8
28,1 ±3,0
31,1 ±2,9
32,4 ±6,4
29,2 ±3,7
29,9 ±0,7
Glykosylierungsverhältnisse (%)
diglyk. PrPSc
62,1 ±3,7
58,6 ±2,3
50,1 ±1,4
50,1 ±4,8
45,2 ±5,2
51,7 ±2,7
51,4 ±1,6
Isolat
caprine BSE ZG 01
ovine BSE 486
ZYP 13
ZYP 19
ZYP 21*
ZYP 27
ZYP 30
diglyk., monoglyk. und unglyk. PrPSc = di-, mono- und unglykosylierte Form des PrPSc, MM = molekuare Masse, AK = Antikörper, *Aus Mangel an Material wurde der Mittelwert für den Langzeit-Proteinase K-Verdau der ZYP 21 aus nur drei statt der üblichen 4 Gelläufen ermittelt
142 Anhang
9.7 Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben in A. bidest angesetzt und
bei RT gelagert.
APS-Lösung (10 %-ig)
Ammoniumpersulfat 1 g
A. bidest. 10 ml
Assay Puffer (10x, pH 9,8)
Tris 24,2 g
MgCl2 2,03 g
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt.
Blotting Puffer
Tris 3,03 g
Glycin 14,4 g
Methanol 200 ml
SDS 2 g
A. bidest. ad 1 l
Bromphenolblaulösung (1 %-ig)
Bromphenolblau 1 g
A. bidest. ad 100 ml
Citratpuffer (pH 7,2; Citratblut)
Trinatrium-Citrat-Dihydrat 19 g
NaCl 4,5 g
A. dest. ad 500 ml
Der pH-Wert wurde mit Zitronensäure eingestellt, die Lösung anschließend steril filtriert. Lagerung bei 4 °C.
Citratpuffer (1 M, pH 6,0; Methanol-Fällung)
Zitronensäuremonohydrat 21,01 g
A. bidest. ad 100 ml
Der pH-Wert wurde mit Natronlauge eingestellt.
Citratpuffer (0,01 M, pH 6,0; Immunhistologie)
Trinatriumzitrat-dihydrat 2,94 g
Anhang 143
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) vorsichtig eingestellt.
CVL-Puffer (10x, pH 6,8)
SDS 2 g
Tris/HCl-Lösung (1 M, pH 7,4) 5 ml
Mercaptoethanol 5 ml
Sucrose 3 g
1 %-ige Bromphenolblau-Lösung 5 Tropfen
A. bidest. ad 20 ml
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 2x Konzentrati-on verdünnt.
DAB-Lösung
Diaminobenzidintetrahydrochlorid 100 mg
Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,1) ad 200 ml
Vor Gebrauch filtrieren.
H2O2 (kurz vor Gebrauch zufügen) 70 µl
Denaturierungspuffer
SDS 5 g
Mercaptoethanol 10 ml
A. bidest. ad 100 ml
Eosin
Eosin G 10 g
Eisessig 10 Tropfen
Ethanol (50 % v/v) ad 1 l
E-Puffer (10x)
Tris 150 g
Glycin 720 g
SDS 50 g
A. bidest. ad 5 l
Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentration verdünnt.
Erythrozyten-Lysispuffer (pH 7,2-7,3)
NH4Cl 8,0 g
KHCO3 1,0 g
144 Anhang
Na2-EDTA 37,2 mg
A. dest. ad 1000 ml
Nach Sterilfiltrierung Lagerung bei 4 °C bis zu 3 Wochen.
Formalin (4 %-ig, neutral gepuffert)
A. bidest. 900 ml
Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat 4 g
Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei 8,15 g
komplett mit Magnetrührstäbchen lösen
37 %-iges Formalin 100 ml
Hämatoxylin-Lösung
Hämatoxylin 1 g
A. bidest. ad 1 l
vollständig lösen
Natrium-Iodat 0,2 g
Kalium-Aluminiumsulfat 50 g
dazugeben und vollständig lösen
Chloralhydrat 50 g
Zitronensäure-Monohydrat 50 g
Mindestens 4 Wochen reifen lassen. Vor Gebrauch filtrieren.
Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,1)
Imidazol 1,36 g
A. bidest. ad 200 ml
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt.
Kaliumchlorid (3 M)
Kaliumchlorid 7,46 g
A. bidest. ad 100 ml
Lysispuffer (Methanolfällung)
Kaliumchlorid 3 M 667 µl
Citratpuffer (pH 6) 1M 500 µl
Magnesiumchlorid 1 M 50 µl
Sarkosin 0,125 g
A. bidest. ad 10 ml
Anhang 145
Magermilch (5 %-ig)
Magermilchpulver 5 g
PBS-Tween ad 100 ml
Methanol mit 3 % H2O2
Wasserstoffperoxid, 30 %-ig 20 ml
Methanol 180 ml
Magnesiumchloridlösung (0,1 M)
Magnesiumchloridhexahydrat 2,03 g
A. bidest. ad 100 ml
Magnesiumchloridlösung (1 M)
Magnesiumchloridhexahydrat 20,33 g
A. bidest. ad 100 ml
&atriumazidlösung (10 %-ig)
Natriumazid 0,65 g
A. bidest ad 100 ml
&atronlauge (2 M)
Natriumhydroxid 80 g
A. bidest. ad 1 l
PBS (10x)
Natriumchlorid 400 g
Kaliumchlorid 10 g
Kaliumdihydrogenphosphat 10 g
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 57,5 g
A. bidest. ad 5 l
Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentration verdünnt.
PBS mit 10 mM EDTA
EDTA (x2H2O) 3,27g
PBS ad 1 l
PBS mit 4 % Sarkosyl (pH 7,4)
Sarkosyl 10 g
PBS ad 250 ml
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt.
146 Anhang
PBS-Tween
Tween 20 1 ml
PBS ad 1 l
Pefabloc (0,1 M)
Pefabloc 100 mg
A. bidest. ad 4,17 ml
Lagerung bei –20 °C.
PK-Gebrauchslösung (Histologie, 4 µg/ml PK))
PK-Stammlösung 760 µl
PK-Puffer (1x) 190 ml
PK-Puffer (10x, pH 8,3)
Tris 60,56 g
EDTA 2,92 g
Tween 20 10 ml
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt. Lagerung bei 4-8 °C.
PK-Stammlösung (1 mg/ml)
Proteinase K 100 mg
A. bidest. 100 ml
Lagerung bei – 20 °C.
4 %-ige PTA mit 34 mM MgCl2 (pH 7,4)
PTA 4 g
Magnesiumchloridhexahydrat 691 mg
A. bidest. ad 100 ml
Der pH-Wert wurde mit Natronlauge (NaOH) eingestellt.
SDS-Lösung (10 %-ig)
SDS 1 g
A. bidest. ad 10 ml
Sucrose-DOC-&P40-Lysis-Puffer
Sucrose 10,95 g
NP40 0,5 ml
DOC 0,5 g
Anhang 147
A. bidest. ad 100 ml
TBS (10x, pH 7,6)
Tris 60,57 g
Natriumchlorid 80 g
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt.
TBS mit 10 % Ziegenserum und 0,03 % &atriumazid
Ziegenserum (hitzeinaktiviert 3 h, 56 °C Wasserbad) 10 ml
Natriumazid (30 %-ig) 300 µl
1x TBS ad 100 ml
Lagerung bei 4-8 °C.
Tris-Puffer
Tris/HCl 0,5 M, pH 6,8
Tris 60,57 g
A. bidest. ad 1 l
Tris/HCl 1,5 M, pH 8,8
Tris 181,71 g
A. bidest. ad 1 l
Der pH-Wert wurde jeweils mit Salzsäure (HCl) eingestellt.