Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Infektionsmedizin, Institut für Mikrobiologie und Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin/Ambulatorische Klinik Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer Streptococcus suis- Ganzzell- und einer Subunitvakzine INGUAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.) vorgelegt von Katharina Bennecke aus Braunschweig Hannover 2008
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Zentrum für Infektionsmedizin, Institut für Mikrobiologie und Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin/Ambulatorische Klinik
Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer Streptococcus suis- Ganzzell- und einer Subunitvakzine
INGUAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Katharina Bennecke aus Braunschweig
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Prof. Dr. K. H. Waldmann
1. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Prof. Dr. K. H. Waldmann
2. Gutachter: PD Dr. E. große Beilage
Tag der mündlichen Prüfung: 15. Mai 2008
Meinen Eltern
Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert bzw. eingereicht:
DIVA engl.: differentiating infected from vaccinated animals
DNA engl.: desoxyribonucleic acid
dNTP 2’-Desoxy-Nukleotid-5’-Triphosphat
dpi engl.: days post infectionem
dTTP 2’-Desoxy-Thymidin-5’-Triphosphat
EDTA engl.: ethylendiamine-tetraaceticacid
EF Extrazellulär Faktor
ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assey
et al. et ali
evtl. eventuell
FIA engl. : Freund’s incomplete adjuvans
fbl. engl.: final bleeding
gdh Glutamatdehydrogenase
ggf. gegebenenfalls
ggr. geringgradig
GZV Ganzzellvakzine
hgr. hochgradig
i.m. Intramuskulär
i.n. intranasal
insb. insbesondere
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
i.v. intravenös
LB Luria-Bertani
K Kontrollgruppe
KBE Kolonie bildende Einheit
kg Kilogramm
M Molar
MAP Murein-assoziierte Proteine
min. Minuten
mg Milligramm
mgr. mittelgradig
ml Milliliter
MLST engl.: multi locus sequence typing
mM millimolar
MP-PCR Multiplex PCR
MRP engl.: muramidase-released protein
MW Mittelwert
NaCl Natrium-Chlorid
OD Optische Dichte
ÖW Öl-in-Wasser
OFS engl.: opacity factor of S. suis
PBS engl.: phosphate buffered saline
PCR engl.: polymerase chain reaction
POD Peroxidase
prae imm. prae immun
PRRS Porzines Respiratorisches und Reproduktives Syndrom
post imm. post immun
prae Inf prae infectionem
post Inf. post infectionem
S. Streptococcus
SAS Statistical Analysis System for Windows
SDS engl.: sodium dodecylsulfate
SDS-PAGE engl.: sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SLY Suilysin
ST Serotyp
Taq Thermus aquaticus
TCA Trichloressigsäure
TEMED Tetramethylethylendiamin
TEN Tris EDTA NaCl
THB Todd-Hewitt Broth
Th Helfer –T-Lymphozyten
TSB Tryptone Soya Broth
WO Wasser-in-Öl
(w/v) engl.: weight per volume (Gewicht pro Volumen)
V Volt
(v/v) engl.: volume per volume (Volumen pro Volumen)
z.B. zum Beispiel
Einleitung
11
1 Einleitung
Streptococcus (S.) suis kann beim Schwein, vor allem in den ersten Lebenswochen,
Meningitis, Septikämie, Polyarthritis und plötzliche Todesfälle hervorrufen (BUSQUE
et al. 1997; HOLT et al. 1989; LAPOINTE et al. 2002; PALLARES et al. 2003;
REAMS et al. 1994). Zudem ist S. suis ein Zoonoseerreger, der beim Menschen vor
allem Meningitis auslösen kann (ARENDS u. ZANEN 1988; BUSQUE et al. 1997;
HOLT et al. 1989; LAPOINTE et al. 2002; REAMS et al. 1994). S. suis-Erkrankungen
gehören zu den Faktorenerkrankungen, da neben dem Infektionserreger biotische
und abiotische Faktoren eine wichtige Rolle für die Krankheitsentstehung spielen
(BAUMS et al. 2006; BERTHELOT-HERAULT et al. 2001; BERTHELOT-HERAULT
et al. 2005; CLIFTON-HADLEY et al. 1986).
Darüber hinaus besitzt der Erreger die Fähigkeit, Tonsillen, Schleimhäute des
Nasopharynx und des Genitaltraktes zu besiedeln, ohne jedoch eine Erkrankung
auszulösen (CLIFTON-HADLEY u. ALEXANDER 1980; KING et al. 2002; NORTON
et al. 1999; WILLIAMS et al. 1973). Inapparente Trägertiere können Ferkel mit einem
virulenten S. suis-Stamm durch Kontakt, wie zum Beispiel über den Genitaltrakt der
Sau, infizieren (CLIFTON-HADLEY et al. 1986).
Aufgrund der hohen Diversität der Kapselpolysaccharide sind derzeit 33 Serotypen
von S. suis bekannt. In Mitteleuropa werden Erkrankungen beim Hausschwein
hauptsächlich durch die Serotypen 2 und 9 verursacht (WISSELINK et al. 2001).
Für die Prophylaxe von S. suis-Erkrankungen steht in Deutschland kein kommerziell
erhältlicher Impfstoff zur Verfügung. Bei Bestandsproblemen mit S. suis werden oft
stallspezifische Vakzinen eingesetzt. Bei diesen handelt es sich um inaktivierte
Ganzzellvakzinen. S. suis-Subunitvakzinen kamen bis heute nur in experimentellen
Untersuchungen zum Einsatz. Experimentell wurden für unterschiedliche
Immunogene protektive Wirkungen gegenüber einer homologen Belastungsinfektion
aufgezeigt, d. h. Belastungsinfektionen mit dem selben Stamm. In der Praxis ist aber
auch mit dem Auftreten unterschiedlicher Serotypen zu rechnen, so dass die
protektive Wirkung gegenüber heterologen Serotypen für den Erfolg eines
Impfstoffes entscheidend ist. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der
Etablierung eines experimentellen Modells für Serotyp-9-Infektionen im Schwein.
Einleitung
12
Dieses Modell sollte in Immunisierungsversuchen zur Untersuchung auf eine
heterologe Protektion gegenüber Serotyp 2 und Serotyp 9 eingesetzt werden. In
Vorarbeiten war bereits ein S. suis-Serotyp-2-Modell etabliert worden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die protektive Wirkung einer Subunitvakzine mit
einem Ganzzellimpfstoff in homologen und heterologen Belastungsversuchen
verglichen. Da viele Oberflächenproteine von Bakterien wichtige Antigene darstellen,
wurde die Subunitvakzine auf der Basis der Murein-assoziierten Fraktion hergestellt.
Literatur
13
2 Literatur
2.1 S. suis
Bei S. suis handelt es sich um unbewegliche, grampositive, ovoide Kokken mit einer
Größe von ca. 1 μm. Diese liegen in Paaren oder selten in Kurzketten vor. Sie zeigen
ein fakultativ anaerobes Wachstum (KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987). Die
Kolonien auf Blutagar haben nach 24 Stunden Bebrütung einen Durchmesser von
1-2 mm und sind grau und teilweise schleimig. Auf Schafblutagar zeigt S. suis eine
α-Hämolyse.
2.2 Klinik von S. suis- Infektionen
S. suis ist in der Lage, beim Schwein eine Reihe von sehr unterschiedlichen
Krankheitsbildern hervorzurufen. Nach einer Inkubationszeit von zwei bis zehn
Tagen treten klinische Veränderungen in Abhängigkeit von dem Manifestationsorgan
auf (WALDMANN u. WENDT 2004). Bei der „Enzootischen Streptokokkenmeningitis“
stellen sich im Verlauf der Erkrankung neben unspezifischen Symptomen, wie
Inappetenz und Fieber, zentralnervöse Störungen ein. Dies äußert sich meist in
motorischen Ausfallerscheinungen, wie Ataxien und Paresen. Häufig ist dieses
Erscheinungsbild mit einem Opisthotonus verbunden. Im fortgeschrittenen Stadium
treten Seitenzwangslage und Nystagmus auf. Im Zusammenhang mit einer
S. suis-Infektion kommt es weiterhin häufig zu akuten und hochgradigen Lahmheiten
mit schmerzhafter Schwellung und Rötung der Gelenke. Wenn mehrere Gelenke
betroffen sind, kann es zum Festliegen der Tiere kommen. Die Synovia hat meist
einen serofibrinösen bis eitrigen Charakter. Bei einer akuten S. suis-assoziierten
Peritonitis zeigen die Tiere eine Kyphose und eine starke Bauchdeckenspannung.
Bei einer Pleuritis kommt es zu erhöhter Atemfrequenz: Der Atemtyp wechselt von
costoabdominal zu abdominal. Des Weiteren können Pneumonie, Otitis media und
Endocarditis auftreten (REAMS et al. 1994; STAATS et al. 1997; STAATS et al.
1998a; STAATS et al. 1998b; STAATS et al. 1999a; STAATS et al. 1999b;
TORREMORELL u. PIJOAN 1998). Bei zentralnervösen Störungen sind neben der
Steptokokkenmeningitis noch Morbus Aujeszky, Kochsalzvergiftung und die
Krampfformen der Kolienterotoxämie differentialdiagnostisch in Betracht zu ziehen
Literatur
14
(WALDMANN u. WENDT 2004). Die Haemophilus parasuis Polyserositis ist eine
wichtige Differentialdiagnose zur S. suis-assoziierten Peritonitis und Pleuritis.
2.3 Pathologie von S. suis- Infektionen
Fibrinös-eitrige Meningitiden gehören neben den akuten eitrigen Polyarthritiden,
fibrinösen Pleuritiden und Peritonitiden zu den pathologischen Veränderungen bei
S. suis-Serotyp-2-Infektionen. In Untersuchungen von MADSEN et al. (2002) über
S. suis-Serotyp 2, in denen nur die infizierten Tiere mit Läsionen berücksichtigt
wurden, zeigten 81% der Tiere typischene makroskopische Läsionen einer diffusen
exsudativen Meningitis, während 24% der Tiere eine exsudative Arthritis aufwiesen.
WILLIAMS und BLAKEMORE (1990b) fanden nach experimenteller intravenöser
Infektion die ersten Veränderungen im Gehirn am Plexus choroideus (Tabelle 1). Die
Autoren postulierten daher, dass der Eintritt von S. suis-Serotyp 2 ins Gehirn über
den Plexus choroideus erfolgt. S. suis-Infektionen manifestieren sich weiterhin häufig
in Gelenken, vor allem im Tarsal– und Karpalgelenk, und an der Serosa (WILLIAMS
u. BLAKEMORE 1990a). Bei einer Serositis, die auch mehrere Körperhöhlen
betreffen kann, treten fibrinöse Veränderungen auf (WILLIAMS u. BLAKEMORE
1990a). SANDFORD (1987) untersuchte pathologische und histologische
Veränderungen bei 53 Schweinen mit Anzeichen einer S. suis-Meningitis. Subakute
Meningoencephalitis und Meningoencephalomyelitis waren die häufigsten
Diagnosen, wobei das Alter der Tiere zwischen 5 Tagen und 26 Wochen lag. Häufige
pathologische Diagnosen waren außerdem Hyperämie der Gefäße und Blutungen im
Liquor cerebrospinalis. Histologisch konnten subakute und chronische
Leptomeningitis und Encephalitis festgestellt werden (SANFORD et al. 1987).
Weitere Untersuchungen zur Pathologie von S. suis-Serotyp 9-Infektionen wurden
von VASCONCELOS et al. (1994) durchgeführt. Das Krankheitsbild ähnelte sehr
dem der S. suis-Serotyp-2-Infektion. Auch hier erkrankten die Tiere an Meningitis,
Arthtritis, Peritonitis und Pleuritis. Der Schwerpunkt der Erkrankung lag allerdings bei
der Arthritis.
Literatur
15
2.4 Diagnostischer Nachweis von S. suis
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, S. suis zu identifizieren. Alle S. suis-Stämme
wachsen auf Nährboden mit Schaf- oder Pferdeblut (DEVRIESE et al. 1991). Auf
Schafblutagar wachsen sie mit einer α-Hämolyse, auf Pferdeblutagar mit einer
β-Hämolyse. Bei mikroaerophiler Anzucht verstärken sich das Wachstum und die
Hämolyse (DEVRIESE et al. 1991). TARRADAS et al. (1994) stellten Vergleiche der
biochemischen Profile verschiedener Serotypen auf und konnten eine große
Heterogenität feststellen. Zur Identifikation von S. suis sind dennoch nur einige
wenige Parameter in Betracht zu ziehen. Der Voges-Proskauer- Test (VP) ermöglicht
die Differenzierung von S. suis und S. bovis. Bei S. suis ist der VP-Test negativ
(HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990; TARRADAS et al. 1994). Des Weiteren kann
S. suis Äskulin zu Glucose und Äsculetin spalten, Äsculetin reagiert daraufhin mit
FeIII-Ionen. Trehalose wird ebenfalls gespalten. Ferner wächst S. suis nicht in
Abwesenheit von 6,5% NaCl (TARRADAS et al. 1994).
Eine Identifikation von S. suis-Isolaten kann auch durch eine Genotypisierung
erfolgen. OKWUMABUA et al. (2003) zeigten, dass durch den Nachweis des
gdh-Gens (Glutamat-Dehydrogenase) von S. suis mit der PCR der Erreger von
anderen Streptokokken unterschieden werden kann. Durch eine Multiplex-PCR nach
SILVA et al. (2006) ist es möglich, den Erreger durch ein gdh spezifisches Amplifikat
nachzuweisen und gleichzeitig die Serotypen 1, 2, 7 und 9 zu differenzieren.
Über die Immunhistochemie gibt es eine weitere Möglichkeit, eine S. suis-Infektion
zu diagnostizieren. MADSEN et al. (2002) stellten Vergleiche zwischen der
bakteriologischen Untersuchung und der Immunhistochemie an. Nach ihren
Ergebnissen korrelierten bei 50% der Tiere beide Untersuchungsmethoden
miteinander.
Literatur
16
Tabelle 1: Vergleiche von Tiermodellen für S. suis- Stamm (nur Wildtyp Stämme)
Literatur
17
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Literatur
18
2.5 Epidemiologie von S. suis
Zurzeit sind 33 Serotypen von S. suis bekannt, die anhand ihrer unterschiedlichen
Kapselpolysaccharide differenziert werden. Als Krankheitserreger ist der Serotyp 2
der am häufigsten vorkommende Serotyp weltweit (KING et al. 2002; MAROIS et al.
2007; STAATS et al. 1997; WISSELINK et al. 2000).
Die Verbreitung der Serotypen von S. suis kann regional sehr unterschiedlich sein.
Es besteht außerdem die Möglichkeit, dass sich die Prävalenzen der Serotypen in
einer Region verändern (KING et al. 2002; WISSELINK et al. 2001). So war in
Dänemark 1983 der Serotyp 7 und 1998 hauptsächlich der Serotyp 2 vorhanden
(AARESTRUP et al. 1998; PERCH et al. 1983). In den Niederlanden ist seit 1995
nicht mehr der Serotyp 2, sondern der Serotyp 9 am häufigsten (JACOBS et al.
1995; VECHT et al. 1985; WISSELINK et al. 2001). Serotyp-9-Stämme wurden in
Europa außerdem noch in Belgien und Deutschland häufig von erkrankten
Schweinen isoliert (WISSELINK et al. 2001). In Spanien kommt der Serotyp 9 mit
einer Prävalenz von 64,9% vor, gefolgt von Serotyp 2 mit 14,8% (VELA et al. 2003).
In England waren früher 1 und 14 die am häufigsten aus erkrankten Tieren isolierten
Serotypen (WISSELINK et al. 2001), seit einigen Jahren dominiert hier Serotyp 2
(HIGGINS et al. 1995).
2.6 Pathogenese von S. suis- Infektionen
Eine wichtige Eintrittsforte für S. suis ist der obere Respirationstrakt. Dort besiedelt
S. suis die Tonsillen und die Conchae nasales, wo dieser Erreger inapparent
persistieren kann (BAELE et al. 2001). Die Trägerrate von S. suis-Serotyp 2 variiert
zwischen 0 und 80% sehr stark. Bei vier bis zehn Wochen alten Ferkel ist die
Mehrheit der Tiere Träger von S. suis (CLIFTON-HADLEY et al. 1984). Bei S. suis-
Erkrankungen handelt es sich meist um Faktorenerkrankungen, das heißt, dass
biotische und/oder abiotische Faktoren die Erkrankung begünstigen. Zu den
biotischen Faktoren gehören virale Primärerkrankungen im Atmungstrakt, wie zum
Beispiel PRRS (GALINA et al. 1994; SCHMITT et al. 2001). Eine prädisponierende
Wirkung kann aber auch von anderen Erregern ausgehen. Durch experimentelle
Untersuchungen konnten VECHT et al. (1992) beispielsweise zeigen, dass durch
Bordetella bronchiseptica verursachte Schleimhautläsionen S. suis leichter in den
Literatur
19
Wirtsorganismus eindringen kann (Tabelle 1). Zu den prädisponierenden abiotischen
Faktoren zählen unter anderem Stallüberbelegung, schlechte Lüftung und Umstallen
(HEINRITZI 1998).
Monozyten gelangen über das Blut in die Tonsillen und nehmen S. suis auf. Es wird
angenommen, dass die Monozyten-assoziierten Bakterien über das Blut und den
Plexus choroideus in den Liquor cerebrospinales gelangen (GALINA et al. 1994;
GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; WILLIAMS u. BLAKEMORE 1990b).
2.7 Virulenzfaktoren von S. suis
Die Kapsel schützt S. suis vor der Phagozytose, so dass der Erreger im
Wirtsorganismus überleben kann (GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; SMITH et al.
1999). Die bisherigen Untersuchungen zur Bedeutung der Kapsel als Virulenzfaktor
beziehen sich auf die S. suis-Serotypen 2 und 1.
VECHT et al. (1992) beschreiben zwei Proteine, die als Faktoren hochvirulenter
Serotyp 1 und 2 Stämme eine wichtige Rolle spielen können. Zum einen das
„Muramidase-released Protein“ (MRP), das eine Größe von 136 kDa hat, und zum
anderen der „Extracellular Factor“ (EF) mit einer Größe von 110 kDa. Die
dazugehörigen Gene werden mit mrp und epf bezeichnet. Innerhalb des Serotyps 2
lassen sich durch die Differenzierung von MRP und EF drei unterschiedlich virulente
S. suis-Phänotypen differenzieren. Tierexperimentelle Untersuchungen von VECHT
et al. (1992) haben gezeigt, dass MRP+EF+ Serotyp-2-Stämme wesentlich virulenter
sind als MRP+ EF* oder MRP- EF- Serotyp-2-Stämme. Der Phänotyp MRP+ EF* wird
aufgrund der tierexperimentellen Ergebnisse für das Schwein als schwach virulent
beschrieben (VECHT et al. 1991). Trotzdem zeigten epidemiologische
Untersuchungen eine große Bedeutung von MRP+ EF* Serotyp-2-Stämmen für
invasive S. suis-Erkrankungen in Mitteleuropa und Brasilien (MARTINEZ et al. 2003;
SILVA et al. 2006; WISSELINK et al. 2001). S. suis-Isolate von erkrankten Menschen
gehören auch auffallend häufig zu diesem Phänotyp (GOTTSCHALK u. SEGURA
2000; SMITH et al. 1999; VECHT et al. 1992). Der Großteil der S. suis-Serotyp-2-
Erkrankungen von Schweinen in Europa geht aber auf MRP+ EF+ Stämme zurück
(GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; SMITH et al. 1999; WISSELINK et al. 2001).
Da für isogene mrp und epf Mutanten keine Abschwächung in experimentellen
Infektionen nachgewiesen werden konnte (VECHT et al. 1991), ist bis heute unklar,
Literatur
20
welche Bedeutung MRP und EF als putativen Virulenzfaktoren zukommt. Bei einer
Studie von SMITH et al. (1993) ergaben vergleichende Untersuchungen über EF*
und EF+, dass bei EF* zusätzliche Sequenzabschnitte vorhanden sind, ansonsten
sind diese beiden Proteine aber identisch. Aufgrund der unterschiedlichen
Längenvarianten wurde EF* in die Klassen eins bis fünf eingeteilt. Allerdings wird
bisher davon ausgegangen, dass nur das 110 kDa EF mit der Virulenz von
S. suis-Infektionen assoziiert ist.
Auch bei MRP gibt es verschiedene Varianten, die kleinere Variante wird mit MRPs,
die größeren mit MRP* bzw. MRP** bezeichnet. SILVA et al. (2006) etablierten eine
PCR zur Differenzierung der unterschiedlichen mrp-Varianten.
S. suis-Serotyp-2-Stämme besitzen überwiegend die mrp+ Variante, die für das
136 kDa Protein kodiert. Serotyp 9-Isolate aus Mitteleuropa enthalten meistens die
mrp* Variante, die etwas größer ist (MRP*: 151 kDa).
Ein weiterer wichtiger Virulenz-assoziierter Faktor ist das Hämolysin Suilysin (Gen:
sly). Es hat eine Größe von 54 kDa und gehört zur Familie der Thiol-aktivierten
Zytolysine (JACOBS et al. 1994). Bei in vitro Versuchen konnte eine zytotoxische
Wirkung des Suilysins festgestellt werden (NORTON et al. 1999). Das Suilysin
könnte durch die Lyse von Epithel- und Endothelzellen das Überwinden der
Schleimhautbarriere erleichtern. Es wurde gezeigt, dass nicht alle virulenten Stämme
Suilysin produzieren (ALLGAIER et al. 2001; JACOBS et al. 1994).
Auch der Serumtrübungsfaktor OFS (BAUMS et al. 2006) und das Fibronektin- und
Fibrinogen-Bindeprotein (FBP) von S. suis (DE GREEFF et al. 2002) gehören zu den
Virulenz-assoziierten Faktoren.
Neben MRP, EF und Suilysin spielen noch andere Faktoren bei der Pathogenese
eine Rolle, wie z.B. die Arginin Deiminase (ArcA). GRUENING et al (2006)
untersuchten die Struktur, Regulation und Funktion des ArcA bei S. suis und fanden
heraus, dass ArcA an der Zelloberfläche von S. suis exprimiert wird. Weitere
Untersuchungen zeigten, dass die ArcA-Aktivität mit reduzierten Sauerstoff und
Glucosegehalt ansteigt (FULDE 2007; GRUENING et al. 2006). Im Gegensatz dazu
wird ArcA durch einen Temperaturanstieg von 32°C auf 42°C induziert. ArcA verleiht
S. suis die Fähigkeit, im sauren Milieu überleben zu können (GRUENING et al. 2006;
WINTERHOFF et al. 2002). Diese Funktion könnte für die Pathogenese von S. suis
eine wichtige Rolle spielen, da S. suis in sauren Kompartimenten innerhalb der
Wirtszellen überleben kann.
Literatur
21
In Immunisierungsversuchen mit rekombinantem Surface antigen one (SAO) konnte
eine Protektion gegenüber homologen Belastungsinfektionen aufgezeigt werden
(LI et al. 2007).
2.8 Therapie und Prophylaxe von S. suis- Infektionen
Zu den prophylaktischen Maßnahmen gehören Verminderung von Stressfaktoren,
Verbesserung der Stallhygiene, Vermeidung einer Stallüberbelegung und eine gute
Belüftung der Stallungen. Ist ein Tier dennoch an einer S.suis-Infektion erkrankt,
kann eine antibiotische Behandlung zur Heilung führen. Erfolgt keine Therapie, führt
die Erkrankung häufig innerhalb von wenigen Tagen zum Tode (WALDMANN u.
WENDT 2004). Eine wirksame Prophylaxe ist eine Immunisierung, auf die im
Folgenden näher eingegangen wird.
2.9 Immunisierungen zum Schutz gegen S. suis- Infektionen
Gegenwärtig ist kein kommerzieller Impfstoff in Deutschland verfügbar. Bei
Bestandsproblemen wird häufig eine stallspezifische Vakzine eingesetzt. Diese
Impfstoffe sind mit Formalin inaktivierte Ganzzellimpfstoffe, die unter Verwendung
eines von dem entsprechenden Bestand isolierten S. suis-Stammes hergestellt
werden. WISSELINK et al. (2001,2002a) konnten durch experimentelle
Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer inaktivierten Ganzzellvakzine einen
Schutz dieser Vakzine aufzeigen (Tabelle 2).
Um eine Erkrankung der Ferkel zu minimieren, ist es möglich, eine
Muttertiervakzination, z.B. in der sechsten und zweiten Woche vor der Geburt,
durchzuführen. Somit wird der Antikörperspiegel gegen S. suis in der Kolostralmilch
erhöht (HAESEBROUCK et al. 2004).
WISSELINK et al. (2001), JACOBS et al. (1996) und LI et al. (2006, 2007) führten
Immunisierungsversuche mit Virulenz-assoziierten Faktoren durch. Versuche mit
einem rekombinanten Impfstoff wurden bis jetzt nur von LI et al. (2007)
unternommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Immunisierungsversuche mit einer heterologen Belastungsinfektion, d. h. mit einem
anderen Serotyp als dem, der für die Vakzine verwendet wurde, wurden noch nicht
Literatur
22
beschrieben. Eine Serotyp-übergreifende Schutzwirkung ist daher bis heute für keine
S. suis-Vakzine nachgewiesen worden.
Tabelle 2: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit experimenteller Belastungsinfektion (Auswahl)
Autoren Anzahl
der Tiere
Adjuvans/ Besonder-
heit Impfstoff
Belastungsstamm
(Serotyp)
Morbidität/Mortalität geimpfte Tiere(%)
Morbidität /Mortalität
Kontrolltiere(%)
LACOBS et al. 1996 3 Diluvac
Forte SLY ST 2 (P 1/7)1 20/ 0 100/100
152 Lebend-impfstoff
ST 2 (#1330)
ST 2 (# 999) 6,6/ 0 73 / 53
BUSQUE et al. 1997
153 Lebend-impfstoff
ST 2 (#1330)
ST 2 (# 999) 20 /6,6 20/6,6
HALBUR et al. 2000 10 -
PRRSV und ST2
(ISU VDL 40634/94)
Inaktivierte GZV
(SS VX)4 40/40 63/63
4 WO5 MRP (Subunit)
ST 2 (# 4005)6 -7/75
4 WO EF (Subunit)
ST 2 (# 4005) 6 -7/75
4 WO MRP und
EF (Subunit)
ST 2 (# 4005) 6 -7/25
-7/100
5 WO inaktivierte
GZV9
(#4005)
ST 2 (# 3881)6 -7/0 -7/75
5 AH8 MRP und
EF (Subunit)
ST 2 (# 3881) 6 -7/40
WISSELINK et al. 2001
5 AH inaktivierte GZV9
ST 2 (#3881) 6 -7/80
-7/80
Literatur
23
Autoren Anzahl
der Tiere
Adjuvans/ Besonder-
heit Impfstoff
Belastungsstamm
(Serotyp)
Morbidität/Mortalität geimpfte Tiere(%)
Morbidität /Mortalität
Kontrolltiere(%)
5 WO
inaktivierteKapsel-mutante
(10cps∆EF)
ST 2 (#10)10 80/0
5 Lebend- impfstoff 10cps∆EF ST 2
(#10) 10 100/40
WISSELINK et al. 2002b
5 WO 10 ST 2 (#10) 10 0/0
100/100
LI et al.2006 8 ÖW11 SAO12
(re-kombinant)
ST 2 (#166) 37,5 / 37,5 37,5 / 37,5
FITTIPALDI et al. 2007 7 Lebend-
impfstoff BD 101 ST 2 (S735) 0 / 0 100/100
LI et al. 2007 12 Saponin13
SAO (re-
kombinant)ST 2 (#166) 18/18 58/58
1 hochvirulenter MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stamm 2 Die Tiere wurden dreimal immunisiert 3 Die Tiere wurden zweimal immunisiert 4 Es erfolgten zwei Immunisierungen, die erste mit Emulsigen®, die zweite mit Aluminiumhydroxid als
Das SDS-Gel wurde für ca. 20 min. mit der Färbelösung gefärbt. Anschließend
erfolgte die Entfärbung des Hintergrundes mit der Entfärbelösung. Alle Schritte
wurden auf einem Schwenktisch durchgeführt. Vor dem Trocknen des Geles wurde
es mit einem Scanner digital dokumentiert. Nach vollständiger Entfärbung erfolgte
die Konservierung durch eine Geltrocknung. Hierfür wurde eine Zellophanfolie in eine
Geltrocknungslösung gelegt. Die entfärbten Gele wurden luftblasenfrei zwischen
zwei Folien gelegt und in einen Rahmen gespannt. Die dreistündige Trocknung
erfolgte durch einen Geltrockner (Biorad, München).
Material und Methoden
46
3.11.5 Western Blot (BURNETT 1981)
Benötigte Reagenzien:
Transferpuffer 24,8 mM Tris, 113 mM Glycin, 20% Methanol, 10% SDS
TBST 10 mM Tris pH = 8; 150 mM NaCl ; 0,05% Tween 20
Nach der Auftrennung der Proteine wurde das Gel von den Glasplatten gelöst, das
Sammelgel wurde abgetrennt und das Trenngel in Transferpuffer eingelegt. Auch die
Nitrozellulosemembran (NZ-Membran), das Filterpapier und der Schaumstoff wurden
10 min. in Transferpuffer eingelegt. Danach erfolgte das luftblasenfreie Schichten
von Schaumstoff-Filterpapier-NZ-Membran-Filterpapier-Schaumstoff. Nach dem
Schließen wurde der Halter in das Tank Blot System eingelassen, indem sich
ebenfalls der Tansferpuffer befand. Der Transfer von dem Gel auf die NZ-Membran
erfolgte für 90 min. bei 100 V. Anschließend wurde das Gel verworfen und die
NZ-Membran in 3% Magermilch in TBST über Nacht geblockt, um unspezifische
Bindungen zu vermeiden. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurde nun ein
Primär-Antikörper (Anti-rEF) in der erforderlichen Verdünnung (1:250) für eine
Stunde auf die NZ-Membran gegeben. Nach dreimaligem Waschen folgte die
Inkubation mit dem Antikörper-POD-Konjugat (1:20.000) für eine Stunde. Die
Antikörper wurden jeweils in Waschpuffer verdünnt. Alle Waschschritte erfolgten für
eine Dauer von jeweils 5 min. Die Inkubationsschritte wurden auf einem
Schwenktisch, die Waschschritte auf einem Schüttler durchgeführt.
Nach dem zweite Antikörper und mehrmaligem Waschen wurde die NZ-Membran
durch Filterpapier gründlich getrocknet und mit einer Chemolumineszenz-Lösung
(Pierce, Rockford) für 4 min. beschichtet. Nach erneutem Trocknen wurde ein
Röntgenfilm (Biomax,Kodak) auf die NZ-Membran gelegt und entwickelt.
3.12 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem „Statistical Analysis System for
Windows“, SAS® und wurde zusammen mit Herrn Dr. Beyerbach (Institut für
Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung, Tierärztliche Hochschule
Hannover) durchgeführt. Der zeitliche Verlauf der Merkmale Mortalität und Morbidität
wurde in Kaplan-Meyer-Diagrammen dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte
mit dem Log-Rank-Test.
Ergebnisse
47
4 Ergebnisse
4.1 Etablierung eines S. suis-Serotyp-9-Tiermodells
In dem ersten Teil der Arbeit wurden zwei invasive S. suis-Pathotypen in einem
intranasalen Infektionsmodell von Läuferschweinen auf ihre virulenten Eigenschaften
hin miteinander verglichen. Wie in den folgenden Infektionen der
Immunisierungsversuche kam zum einen der hochvirulente MRP+ EF+ SLY+
Serotyp-2-Stamm 10 zum Einsatz, zum anderen wurde erstmals ein
Serotyp-9-Stamm in experimentellen S. suis-Infektionen getestet. Der ausgewählte
Serotyp-9-Stamm (A3286/94) war von einem Schwein mit Meningitis isoliert worden
(ALLGAIER et al. 2001).
4.1.1 Vergleichende experimentelle Infektion mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-Stamm A3286/94
Fünf von sechs Tieren, die mit dem S. suis-Serotyp-2-Stamm-10 infiziert worden
waren, entwickelten klinische Symptome mit Fieber und Leukozytose. Zwei der Tiere
(106 und 119) zeigten zentralnervöse Störungen, wie Tremor, Opisthotonus und
Ataxie. Bei zwei weiteren Tieren (120 und 107) konnten hochgradige Lahmheiten
festgestellt werden. Ein Tier (148) zeigte im klinischen Bild eine Kyphose und
Apathie (Tabelle 5). Im Gegensatz dazu konnten während der gesamten
Versuchszeit von 20 Tagen keine klinischen Anzeichen bei den sechs Tieren
beobachtet werden, die mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 intranasal
infiziert worden waren. Die Körpertemperatur lag bei allen Messungen unter 40°C
(Tabelle 5). Dennoch stiegen innerhalb von elf Tagen nach der Infektion bei fünf der
sechs Tiere, die mit Serotyp 9 intranasal infiziert worden waren, die Leukozyten
temporär auf Werte über 22G/l an (Tabelle 5). Daraufhin wurden vier weitere Tiere
intravenös mit 108 KBE A3286/94 infiziert. Drei dieser Tiere (97, 99, 100) zeigten
innerhalb von 24 Stunden Anzeichen einer akuten Polyarthritis. Das vierte Schwein
(98) wies zentralnervöse Störungen mit Ataxie und Tremor auf. Dieses Tier (98) hatte
auch eine extrem hohe Körpertemperatur (42,7°C). Zwei weitere intravenös infizierte
Ergebnisse
48
Tiere (97, 99) zeigten ebenfalls eine Erhöhung der Körpertemperatur auf Werte
> 40,5°C. Bei einem Tier (100) konnte trotz Erkrankung keine Erhöhung der
Körpertemperatur festgestellt werden. Alle vier Schweine wurden aufgrund ihres
schweren Krankheitsbildes innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion
euthanasiert. Als Ergebnis ist festzuhalten, dass klinisch manifeste Erkrankungen bei
Läuferschweinen mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 durch eine
intravenöse, nicht jedoch durch eine intranasale Applikation hervorgerufen werden
konnten. Im Gegensatz dazu wurden durch eine intranasale Applikation des
S. suis-Serotyp-2-Stammes 10 in der gleichen Altersklasse schwere Erkrankungen
mit hohem Fieber und zum Teil mit zentralnervösen Störungen induziert.
Tabelle 5: Virulenz von S. suis-Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) und Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) in experimentellen Infektionen von Läuferschweinen
Experimentelle S. suis -Infektion
max. Körper-
temperatur (°C)
max. Leukozyten-zahl (G/l) 2 Anzahl der
infizierten Tiere
Stamm Appl. KBE Morbi-dität
Morta-lität
klinische Symp-tome 1
≤40 40 –40,5 ≥40,5 ≤ 22 22 –
30 ≥ 30
6 10 i. n. 109 5/6 4/6 4/6 1/6 3/6 2/6 1/6 4/6 1/6
6 A3286/94 i. n. 109 0/6 0/6 0/6 6/6 0/6 0/6 1/6 5/6 0/6
4 A3286/94 i. v. 108 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 3/4 2/4 2/4 0/4 1 Klinische Symptome, wie Apathie, Anorexie, zentralnervöse Störungen und akute Lahmheit. 2 Leukozytenwerte von Blutproben aus der Vena cava craniallis, die 3, 5, 7 und 11 Tage nach
der Infektion entnommen wurden. Alle Tiere wiesen vor der Infektion Werte unter 20 G/l auf.
4.1.2 Pathologische und pathohistologische Befunde nach experimentellen Infektionen mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-Stamm A3286/94
Alle Versuchstiere wurden in einer Sektion auf Veränderungen durch eine
S. suis-Infektion untersucht (3.4.6). Wie unter 4.1 aufgeführt, wurden vier von sechs
der intranasal mit Stamm 10 und bei allen vier intravenös mit Stamm A3286/94
infizierten Tieren vorzeitig euthanasiert und anschließend seziert aufgrund einer
Ergebnisse
49
schweren akuten Erkrankung. Alle übrigen Versuchstiere wurden 20 Tage nach der
Infektion euthanasiert und pathologisch untersucht.
Bei den drei Tieren (106, 116, 98), die aufgrund von zentralnervösen Störungen
euthanasiert wurden, konnten keine makroskopischen Veränderungen in der Sektion
festgestellt werden. Das Tier (148) mit der Kyphose zeigte in der Sektion eine
hochgradig fibrinöse Peritonitis. Die an Lahmheit erkrankten Tiere (120, 97, 99, 100)
wiesen in den betroffenen Gelenken eine milchig-gelbe Synovia auf.
Die Proben für die pathohistologischen Untersuchungen wurden im Rahmen der
Sektion zur Untersuchung auf typische Veränderungen einer S. suis-Infektion nach
einem im Vorfeld festgelegten Ablauf gewonnen (3.4.6). Die pathohistologischen
Untersuchungen der Tiere, die mit A3286/94 intranasal infiziert worden waren,
ergaben Läsionen und Infiltrationen in mehreren Organen (Tabelle 6). Gerringgradige
Peritonitis und/oder Pleuritis wurde bei allen sechs Schweinen diagnostiziert. Bei vier
Tieren waren diese fibrinös-eitrig (7, 10, 116,132), zwei andere Tiere wiesen
lymphoplasmazelluläre Infiltrationen in Pleura und/oder Peritoneum auf (6, 8). Von
den mit A3286/94 intranasal infizierten Schweinen war bei dem Tier 116 der Grad
und die Ausdehnung der Entzündungen im Gehirn am stärksten. Es konnte eine
sowie eine mittelgradige multifokale fibrinöse Ventrikulitis festgestellt werden
(Abbildung 16). Eine geringgradige fokale eitrige Meningitis lag in derselben Gruppe
bei dem Schwein 10 vor. Die anderen vier Läufer dieser Gruppe (6, 7, 8, 132) zeigten
lymphoplasmazelluläre Infiltrationen der Meningen und/oder des Plexus chorioideus
bzw. eine multifokale granulomatöse Enzephalitis (132).
Nur in der Gruppe, die intranasal mit Stamm10 infiziert worden war, konnten mittel-
bzw. hochgradige fibrinös-eitrige Meningitiden diagnostiziert werden. Zwei Tiere (106
und 119), die bereits durch zentralnervöse Störungen aufgefallen waren, zeigten
diese pathologischen Veränderungen (Tabelle 6 und Abbildung 13). Ähnlich wie bei
den mit Serotyp 9 intranasal infizierten Tieren wurden bei drei anderen Tieren dieser
Gruppe eine lymphoplasmazelluläre Meningitis und teils eine Plexus chorioiditis
festgestellt. Fibrinös-eitrige Veränderungen unterschiedlichen Grades waren bei den
Tieren dieser Versuchsgruppe noch in anderen Geweben zu erkennen (Tabelle 6).
Ergebnisse
50
Bei dem Tier 148 lag beispielsweise eine hochgradige diffuse bzw. multifokale
fibrinös-eitrige Pleuritis und Peritonitis vor (Abbildung 15).
Die geschilderten pathohistologischen Veränderungen führten zu einem höheren
Pathoscore bei der mit Stamm 10 (3,2) als bei der mit Stamm A3286/94 (2,5)
infizierten Gruppe (Tabelle 6).
Einen hohen Pathoscore von 4,0 wies ferner die Gruppe auf, die intravenös mit
A3286/94 infiziert worden war. Drei Tiere (97, 99, 100) zeigten mittelgradige bis
hochgradige neutrophile Infiltrationen in der Synovialis des Tarsalgelenks (Abbildung
14). Zudem lagen bei allen vier Tieren eine eitrige Splenitis und eine multifokale,
eitrige Pneumonie in unterschiedlichen Schweregraden vor (Tabelle 6). Das Schwein
98 zeigte im Gegensatz zu den anderen drei Tieren nicht nur eine hochgradige
multifokale eitrige Splenitis sondern auch eine mittelgradige multifokale eitrige
Hepatitis.
Zusammenfassend konnten schwerwiegende Befunde durch die pathohistologische
Untersuchung hauptsächlich in den intranasal mit MRP+EF+SLY+ Serotyp-2-Stamm
10 und in den intravenös mit Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Tieren
festgestellt werden. Die Tiere, die mit dem Serotyp-9-Stamm intranasal infiziert
worden waren, zeigten meist nur minimale bis geringgradig fokale Veränderungen in
den Serosen und im Gehirn. Neutrophile Infiltrationen waren in mehreren Organen
aufzufinden. Nach der intravenösen Infektion mit dem Serotyp-9-Stamm waren die
Veränderungen hauptsächlich in den Gelenken vorhanden.
Ergebnisse
51
Tabelle 6: Fibrinös-eitrige Entzündungen bei mit S. suis-Stamm 10 oder mit Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Läuferschweinen.
1 E
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3.4
.7).
5
App
likat
ions
art
Ergebnisse
52
4.1.3 Reisolierung der Belastungsstämme (A3286/94 und Stamm 10)
Als Nachweis der Belastungsstämme galt die Identifizierung des Genotyps.
Der Infektionsstamm konnte in unterschiedlichen Organen erkrankter Tiere, die mit
Stamm 10 intranasal oder mit A3286/94 intravenös infizierten worden waren, kulturell
nachgewiesen werden. Bis auf den Tonsillentupfer von Tier 8 war allerdings in allen
Proben der mit Stamm A3286/94 intranasal infizierten Schweine der
Belastungsstamm kulturell nicht nachweisbar (Tabelle 7).
Bei den Tieren mit mittel- oder hochgradiger fibrinös-eitriger Meningitis (106 und 119)
konnte der Infektionsstamm aus dem Liquor cerebrospinalis isoliert werden. Der
gleiche Stamm wurde auch aus der Leber und dem Peritoneum des mit Stamm 10
infizierten Schweines 148 isoliert.
Der Belastungsstamm A3286/94 wurde in dem Liquor cerebrospinals von Tier 98
nach intravenöser Applikation kulturell diagnostiziert. Alle weiteren
Gehirnflüssigkeitsproben waren in der kulturellen Untersuchung auf S. suis negativ
(Tabelle 7). Aus der Gelenkflüssigkeit konnte nur bei den drei Schweinen 97, 99 und
100 mit fibrinös-eitriger Tarsitis bzw. Karpitis nach intravenöser A3286/94 Infektion
der Belastungsstamm isoliert werden. Bei dem Tier 98 wurde der Belastungsstamm
in der Leber, Milz und dem Pleuratupfer, bei Tier 97 in dem Peritonealtupfer kulturell
nachgewiesen (Tabelle 7).
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass der Belastungsstamm bei drei von sechs
mit Stamm 10 intranasal und allen mit Stamm A3286/94 intravenös belasteten
Schweinen in inneren Organen nachgewiesen wurde. Der kulturelle Nachweis der
Belastungsstämme war mit Ausnahme der Tonsillenproben mit fibrinös-eitrigen
Organveränderungen assoziiert. Für die subklinischen pathohistologischen
Veränderungen der intranasal mit A3286/94 infizierten Schweine gelang im Rahmen
dieser Dissertation kein Erregernachweis.
Ergebnisse
53
Tabelle 7: Reisolierung des Belastungsstammes von Läuferschweinen, die mit S. suis-Stamm 10 oder Stamm A3286/94 infiziert worden sind.
Experimentelle S. suis- Infektion
Anzahl der Tiere in denen der S. suis-Belastungsstamm1 isoliert werden konnte Infizierte
Tiere Tonsille2
Alter n Stamm Appl.2 KBE
2-11 dpi
20 dpi Lu
nge3
Ser
osa4
Milz
und
/ od
er L
eber
Liqu
or
cere
bro-
spin
alis
Syn
ovia
6
7-8 6 10 i. n. 109 2/6 1/2 0/6 0/6 1/6 2/6 0/6
7-8 6 A3286/94 i. n. 109 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
7-8 4 A3286/94 i. v. 108 1/4 3/4 2/4 2/4 1/4 3/4
1 Der Belastungsstamm konnte von der Kultur mit einer MP-PCR differenziert werden
(siehe 3.8). 2 Tonsillentupfer oder Organprobe, Tage nach der Infektion (dpi). 3Untersuchung eines Lobus cranialis. 4Pleura-, Peritoneal- und/oder Perikardhöhle. 5Tarsal- und Karpalgelenkpunktate.
4.2 Protektive Wirkungen einer Ganzzell- und Subunitvakzine gegenüber homologen und heterologen Belastungsinfektionen mit S. suis-Serotyp 2 bzw. 9 Stämmen
Im zweiten Teil der Dissertation wurde die protektive Wirkung einer Subunitvakzine
aus Murein-assoziierten Proteinen mit der protektiven Wirkung einer Ganzzellvakzine
verglichen, beide auf der Grundlage des Serotyp-2-Stammes 10.
Insgesamt wurden drei Immunisierungsversuche durchgeführt, zwei mit homologer
und einer mit heterologer Belastungsinfektion. In dem Vorversuch zur Etablierung
eines Serotyp-9-Infektionsmodells (4.1) wurde festgestellt, dass der für die homologe
Belastungsinfektion eingesetzte hochvirulente Serotyp-2-Stamm 10 im intranasalen
Infektionsmodell eine hohe Morbidität hervorrief, während der für die heterologen
Belastungsinfektion ausgewählte MRP* SLY+ Serotyp-9-Stamm A3286/94 erst nach
Ergebnisse
54
intravenöser Applikation zu klinisch manifesten Erkrankungen führte. Aus diesem
Grund wurden die homologen Belastungsinfektionen intranasal und die heterologen
intravenös durchgeführt. Der einzige Unterschied der beiden homologen
Belastungsversuche war die Wahl des Adjuvans. Im ersten Immunisierungsversuch
kam Aluminiumhydroxid, im zweiten eine Öl-in-Wasser-Emulsion (Emulsigen®) zum
Einsatz.
Nach den jeweiligen Immunisierungen zeigten die Tiere, die mit Aluminiumhydroxid
als Adjuvans immunisiert worden waren, keine klinisch erkennbare Reaktion auf die
Immunisierung. Die Tiere des zweiten und dritten Immunisierungsversuches, denen
eine Öl-in-Wasser-Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans appliziert worden war, fielen
sechs bis acht Stunden nach der Immunisierung durch deutliche Reaktionen auf. Alle
Tiere, einschließlich der mit dem Placebo behandelten Kontrollgruppe, hatten eine
Körpertemperatur über 40°C. Sie zeigten verminderte Aufmerksamkeit und Anorexie.
24 Stunden nach der Immunisierung war die Körpertemperatur bei allen Tieren
wieder unter 40°C. Die Tiere waren aufmerksam und zeigten Appetit.
4.2.1 Protektive Wirkung einer S. suis-Ganzzellvakzine
4.2.1.1 Homologe Belastungsinfektion
Im ersten Versuch verhielt sich die mit der Ganzzellvakzine immunisierte Gruppe in
Bezug auf Morbidität und Mortalität in Folge der homologen Belastungsinfektion nicht
signifikant unterschiedlich zur Placebogruppe (Morbidität: P = 0,1455; Mortalität:
P = 0,2668). Es verstarben fünf von sieben Tiere (51-57) aus der Gruppe der
Ganzzellvakzine und fünf von acht aus der Placebo-Gruppe (71-78) an den Folgen
einer Infektion mit dem homologen Belastungsstamm (Abbildung 1, Tabelle 8). In
dieser Ganzzellvakzinegruppe stellten sich bei zwei Tieren zentralnervöse Störungen
ein. Eines dieser Tiere (51) zeigte hochgradigen Tremor. Das andere Tier (55) fiel
durch krampfartiges Stehen mit hochgradigem Tremor auf. Ein weiteres Tier (52)
wies eine hochgradige Lahmheit der vorderen linken Gliedmaße auf. Es konnte eine
Umfangsvermehrung des Karpalgelenkes und milchig-gelblich trübe Synovia
beobachtet werden. Zwei weitere Tiere (53, 57) zeigten Apathie und wiesen eine
Ergebnisse
55
Körpertemperatur von > 41°C auf. Bei den klinisch nicht erkrankten Tieren (54, 56)
konnte während der gesamten Versuchszeit keine Erhöhung der Körpertemperatur
registriert werden (< 40,5°C) (Tabelle 8). Bei den hämatologischen Untersuchungen
wurde bei drei erkrankten Tieren (51, 52, 53) ein Anstieg der Leukozyten auf > 22 G/l
festgestellt (Tabelle 8). Auch bei Tier 54, welches keine Anzeichen einer klinischen
Erkrankung und keine Temperaturerhöhung aufwies, erfolgte ein Anstieg der
Leukozyten auf >22 G/l. Tier 56, welches ebenfalls klinisch nicht erkrankte, zeigte
wie die Tiere 55 und 57, keinen Anstieg (< 22 G/l) der Leukozyten (Tabelle 8).
In der Placebo-Gruppe zeigten zwei Schweine (74, 71) zentralnervöse Störungen
und drei weitere Tiere (72, 73, 75) Apathie.
Sowohl in der Ganzzellvakzine- als auch in der Placebogruppe konnte der
Belastungsstamm bei der Mehrzahl der erkrankten Tiere aus den betroffenen
Geweben isoliert werden (Tabelle 9). In beiden Gruppen wurden bei allen erkrankten
Tieren in den histologischen Untersuchungen pathologische Veränderungen
diagnostiziert, die mit dem klinischen Bild der Tiere korrelierten (Tabelle 10).
Beispielsweise lagen bei den beiden Tieren (51, 55) mit zentralnervösen Störungen
aus der Ganzzellvakzinegruppe hochgradige diffuse fibrinös-eitrige Meningitiden vor,
die mit dem Nachweis des Belastungsstammes im Liquor cerebrospinalis bzw.
Gehirntupfer mit hochgradigem Keimgehalt assoziiert waren. Bei jeweils vier Tieren
aus der Ganzzellvakzine- bzw. Kontrollgruppe konnten fibrinös-eitrige bzw. eitrige
Entzündungen in mehreren Organen nachgewiesen werden. So konnten zum
Beispiel bei dem Tier 55 mit der klinisch manifesten Meningitis noch zusätzlich eine
mittel- bzw. geringgradige multifokale eitrige Polyserositis und Splenitis festgestellt
werden. In minimal und geringgradig entzündetem Gewebe erfolgte, wie in anderen
Infektionsversuchen, häufig kein Nachweis des Belastungsstammes. Weiterhin war
es nicht möglich, in dem Gelenkpunktat von Tier 52 mit der hochgradigen diffusen
fibrinös-eitrigen Synovialitis den Erreger zu bestätigen. Dieses Phänomen der
eitrigen sterilen Gelenkpunktate wurde in den unterschiedlichen
Belastungsversuchen dieser Dissertation wiederholt beobachtet. In anderen
entzündlich veränderten Geweben der entsprechenden Tiere konnte der
Belastungsstamm jedoch häufig nachgewiesen werden (Tabelle 9 und 10).
Ergebnisse
56
Beispielsweise wurde bei dem Tier 52 noch eine mittelgradige diffuse fibrinös-eitrige
Pleuritis diagnostiziert, die mit einem Nachweis des Belastungsstammes im
Pleuratupfer assoziiert war.
Im zweiten Versuch mit der Öl-in-Wasser Emulsion konnte im Vergleich zur Placebo
behandelten Gruppe bezüglich der Mortalität und Morbidität eine signifikante
protektive Wirkung (P=0,005) erzielt werden (Abbildung 3 und 4). In dieser
Ganzzellvakzinegruppe verstarben zwei von sieben Tieren. Zu den Symptomen
dieser beiden Tiere gehörten zum einen eine zentralnervöse Störung (93) zum
anderen Lahmheiten (98). Die Körpertemperatur dieser beiden Tiere war zum
Zeitpunkt der Euthanasie auf > 40,5°C angestiegen. Die Temperatur der anderen
Tiere dieser Gruppe lag bis zum Ende des Versuches unter 40,5°C (Tabelle 8). Das
an Lahmheit erkrankte Tier (98) zeigte, wie drei klinisch nicht erkrankte Tiere, eine
Erhöhung der Leukozytenwerte auf > 22 G/l (Tabelle 8). Abgesehen von einer
Ausnahme in der Placebogruppe (48) konnte bei allen klinisch erkrankten Tieren der
Ganzzellvakzinegruppe (93, 98) und der Placebo-Gruppe im zweiten Versuch der
Belastungsstamm in mindestens einem inneren Organ nachgewiesen werden
(Tabelle 9). Die Erregernachweise gingen in jedem dieser Fälle mit fibrinös-eitrigen
Entzündungen der entsprechenden Organe einher. Zusätzlich konnte bei Tier 98
eine geringgradig fokal eitrige Peritonitis festgestellt werden, ohne dass ein
Erregernachweis vorlag. Bei den klinisch nicht erkrankten Tieren der
Ganzzellvakzinegruppe konnte der Belastungsstamm bei vier von fünf Tieren aus
den Tonsillen post mortem reisoliert werden (Tabelle 9). Grundsätzlich waren im
zweiten Experiment in der Placebogruppe Nachweise des Belastungsstammes aus
mehreren inneren Organen häufiger als in den beiden immunisierten Gruppen
(Tabelle 9). So konnte bei vier Tieren (41, 44, 45, 46) der Placebogruppe der
Belastungsstamm in mindestens drei unterschiedlichen inneren Lokalisationen (d. h.
außer Lunge und Tonsille) nachgewiesen werden, während dieses Merkmal einer
generalisierten bakteriellen Erkrankung bei keinem der mit der Ganzzellvakzine
immunisierten Tiere vorlag. Die protektive Wirkung der Ganzzellvakzine im zweiten
Immunisierungsexperiment manifestierte sich auch in einem sehr niedrigen
Pathoscore von nur 1,25, während die Placebogruppe des gleichen Versuches 3,75
Ergebnisse
57
erreichte (Tabelle 10). Im Einklang mit den klinischen und bakteriologischen
Ergebnissen konnte hingegen die Ganzzellvakzine im ersten Immunisierungsversuch
mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans keinen Schutz vor fibrinös-eitrigen
Veränderungen als Folge einer homologen Belastungsinfektion vermitteln
(Pathoscore von 3,2; Tabelle 10). Die pathohistologischen Veränderungen waren
hauptsächlich Meningitiden und Serositiden. Unterschiede in Bezug auf die
Manifestationsorgane waren zwischen den einzelnen Gruppen des ersten und
zweiten Versuches nicht zu erkennen (Tabelle 10).
4.2.1.2 Heterologer Belastungsinfektion
Im dritten Immunisierungsversuch erzielte die Applikation der Ganzzellvakzine in
Bezug auf die Mortalität keinen signifikanten protektiven Schutz (P = 0,2841)
gegenüber der heterologen Belastungsinfektion (Abbildung 5). Im Gegensatz zur
Placebogruppe, in der fünf von sechs Tiere verendeten, überlebten aber in der
Ganzzellvakzinegruppe drei Tiere. In dieser Ganzzellvakzinegruppe zeigten zwei
Tiere (201, 203) hochgradige Lahmheiten. Bei Tier 203 waren zwei Gliedmaßen
betroffen, wodurch das Tier in der Bewegung stark eingeschränkt war. Obwohl die
Tiere 201 und 203 der Ganzzellvakzinegruppe das klinische Bild einer akuten
Arthritis zeigten, blieb der Nachweis einer Synovialitis in der histologischen
Untersuchung aus (Abbildung 10). Die Ursache dafür ist unklar, insbesondere da bei
einem Tier (203) das Gelenkpunktat makroskopisch verändert war (getrübt und
gelblich). Ein weiteres Tier (205) zeigte zentralnervöse Störungen in Form von
Kreisbewegungen und Tremor. In der Placebo-Gruppe kamen zwei Tiere (214, 218)
durch hochgradige Lahmheit der Hintergliedmaße zum Festliegen. Zwei weitere
Tiere (215, 216) zeigten zentralnervöse Störungen, wie Tremor und
Gleichgewichtsstörungen (215). Ein Tier (217) wurde tot aufgefunden.
Im Gegensatz zur Mortalität lag im dritten Versuch für die Morbidität eine statistisch
signifikante protektive Wirkung (P = 0,0426) der Ganzzellvakzine im Vergleich zum
Placebo vor (Abbildung 6). Während in der Placebogruppe in Folge der heterologen
Infektion fünf von sechs Tieren Fieber entwickelten, blieben in der
Ganzzellvakzinegruppe die drei klinisch nicht erkrankten Tiere (202, 204, 206) bei
Ergebnisse
58
allen Messungen unter 40,5°C (Tabelle 8). Alle Tiere der Ganzzellvakzinegruppe, bis
auf 206, zeigten jedoch nach der Belastungsinfektion eine Leukozytose. Bei drei
erkrankten Tieren (214, 217, 218) der Placebogruppe konnte hingegen kein Anstieg
der Leukozyten (Tabelle 8) dokumentiert werden. Dieser Unterschied stand
wahrscheinlich in Zusammenhang mit dem perakuten Krankheitsverlauf der
Placebogruppe. Bei den klinisch erkrankten Tieren gab es, wie in den ersten beiden
Immunisierungsversuchen keine deutlichen Unterschiede im Krankheitsbild zwischen
den beiden Gruppen. Zentralnervöse Störungen und hochgradige Lahmheiten
prägten das Krankheitsbild (Tabelle 8). Die ersten Tiere erkrankten in allen Gruppen
bereits am ersten Tag nach der Belastungsinfektion (Abbildung 6). Die
Körpertemperatur der klinisch erkrankten Tiere der Ganzzellvakzinegruppe lag wie in
der Placebogruppe über 40,5°C. Die Reisolierung des Belastungsstammes erfolgte
nur bei jeweils zwei Tieren der Ganzzellvakzine- (201, 205) bzw. der Placebogruppe
(215, 217). Der Erregernachweis war in der Milz von Tier 205 und im Perikard von
Tier 201 möglich. In der Placebo-Gruppe konnte bei einem verstorbenen Tier (217) in
vier verschiedenen Organen (Lunge, Milz, Leber, Gehirn) der Erreger nachgewiesen
werden. Ein Isolat des Belastungsstammes aus dem Gehirn lag auch bei dem Tier
215 vor (Tabelle 9). Alle eitrigen Gelenkpunktate (203, 212, 214) des heterologen
Belastungsversuches erwiesen sich als steril.
In der pathohistologische Auswertung des dritten Immunisierungsversuches mit der
heterologen Belastungsinfektion gab es deutliche Unterschiede zwischen der
Ganzzellvakzine- und der Placebogruppe (Tabelle 10). In der Ganzzellvakzinegruppe
konnten bei keinem Tier fibrinös-eitrige Veränderungen festgestellt werden, die über
den Grad geringgradig hinausgingen oder die sich als diffus darstellten.
Einschränkend ist aber zu berücksichtigen, dass für die beiden Tiere aus der
Ganzzellvakzinegruppe mit akuter Lahmheit der Nachweis der Synovialitis ausblieb.
Die schwersten dokumentierten Veränderungen in dieser Gruppe hatte das Tier 203,
bei dem eine geringgradige fibrinös-eitrige, multifokale Pleuritis und eine
geringgradige eitrige, multifokale Splenitis diagnostiziert wurde. Im Gegensatz dazu
hatten in der Placebogruppe drei Tiere mittel- oder hochgradige fibrinös-eitrige
Entzündungen, insbesondere lagen bei den Tieren 215 und 217 hochgradige
Ergebnisse
59
fibrinös-eitrige, diffuse Meningitiden vor (Tabelle 10). Diese Unterschiede kamen
auch in den sehr unterschiedlichen Pathoscores der beiden Gruppen zum Ausdruck:
Die Ganzzellvakzinegruppe erzielte einen sehr niedrigeren Score von nur 0,8 im
heterologen Belastungsversuch, während die Placebo-Gruppe 3,0 erreichte (Tabelle
10).
4.2.1.3 Fazit zur S. suis-Ganzzellvakzine
Die S. suis-Ganzzellvakzine rief bei Absetzferkeln nach zweimaliger Applikation
einen signifikanten Schutz gegenüber einer homologen intranasalen
Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm hervor, die 14 Tage
nach der zweiten Immunisierung erfolgte. Diese Protektion konnte mit einem Öl-in-
Wasser Adjuvans (Emulsigen®), jedoch nicht mit dem Adjuvans Aluminiumhydroxid,
erzielt werden. Diese Arbeit lieferte erstmalig Hinweise, dass eine Serotyp-2-
Ganzzellvakzine auch einen eingeschränkten partiellen Schutz gegenüber einer
heterologen intravenösen Belastungsinfektion mit einem Serotyp-9-Stamm vermitteln
kann. Hierfür sprachen geringe Unterschiede in Mortalität und Morbidität sowie
deutliche Unterschiede bei den pathohistologischen Befunden im Vergleich zur
Placebogruppe.
4.2.2 Untersuchung der protektiven Wirkung einer S. suis-Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP)
4.2.2.1 Homologe Belastungsinfektion
Parallel zu den Immunisierungen mit der Ganzzellvakzine wurde immer auch eine
Gruppe gleichaltriger Schweine mit einer S. suis-Subunitvakzine behandelt, die sich
aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) zusammensetzte.
Im ersten Versuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans verstarben in dieser
Subunitvakzinegruppe mit vier von acht Tieren annähernd so viele Tiere wie in der
Placebogruppe (Tabelle 8 sowie Abbildung 1). Fünf Tiere dieser
Ergebnisse
60
Subunitvakzinegruppe wiesen im ersten Versuch eine vorübergehende
Körpertemperatur von > 40,5°C auf (Tabelle 8). Ein Tier (68) mit Fieber zeigte keine
weiteren klinischen Anzeichen einer Erkrankung. Bei den anderen erkrankten Tieren
prägten zentralnervöse Störungen und akute hochgradige Lahmheiten das klinische
Bild. Zwei Tiere (62, 67) erkrankten an einer fibrinös-eitrige Synovialitis der
Tarsalgelenke (Tabelle 9). In diesen beiden Fällen gelang der kulturelle Nachweis
des Belastungsstammes aus den eitrigen Gelenkpunktaten. Das Tier 67 zeigte eine
hochgradige Störung des Allgemeinbefindens mit Festliegen im Zusammenhang mit
Symptomen einer beidseitigen Tarsitis. Bei diesem Tier konnten mit dem
Serotyp-2-Belastungsstamm assoziierte gering- oder mittelgradige multifokale
fibrinös-eitrige Entzündungen in insgesamt fünf unterschiedlichen Geweben
diagnostiziert werden (Lunge, Milz, Peritoneum, Meningen, Tarsalgelenke). Ein
ähnliches Bild zeichnete sich bei den Tieren 63 und 66 ab, bei denen fibrinös-eitrige
Entzündungen in drei unterschiedlichen Geweben festgestellt wurden. Im
Vordergrund standen bei diesen beiden Tieren mittelgradige multifokale
fibrinös-eitrige Meningitiden, die in einem Fall (66) mit zentralnervösen Störungen
und in dem anderen (63) mit Apathie assoziiert waren. Der Nachweis von
multifokalen fibrinös-eitrigen Entzündungen in mindestens drei unterschiedlichen
Geweben der drei Tiere 63, 66 und 67 sprach für generalisierte bakterielle
Erkrankungen, die mit Ausnahme der Ganzzellvakzinegruppe des zweiten
Experimentes in allen mit Stamm 10 belasteten Gruppen auftrat. In der
Subunitvakzinegruppe des ersten Experimentes erfolgte der Nachweis einer
Leukozytose in Folge der Belastungsinfektion bei drei von fünf erkrankten Tieren (62,
63, 66) und bei einem klinisch unauffälligen Tier (64). Deutliche Unterschiede in
Bezug auf die Ausbildung einer Leukozytose waren somit im ersten Experiment
zwischen den drei Gruppen nicht erkennbar (Tabelle 8). Im Einklang mit dem
ungestörten Allgemeinempfinden konnte bei den klinisch nicht erkrankten Tieren kein
Reisolat aus inneren Organen gewonnen werden. Die pathologischen
Untersuchungen ergaben jedoch bei zwei Tieren Veränderungen in Form einer
mittelgradigen (64) bzw. geringgradigen (61) fokalen fibrinös-eitrigen Meningitis
(Tabelle 10).
Ergebnisse
61
Im zweiten Versuch mit Emulsigen als Adjuvans konnte die MAP-Subunitakzine
keine mit der Ganzzellvakzine vergleichbare Schutzwirkung gegenüber einer
homologen Belastungsinfektion mit dem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm erzielen
(Tabelle 8, Abbildung 3 und 4). Ein verzögertes Eintreten der mittel- bis
hochgradigen Störung des Allgemeinbefindens bei den erkrankten Tieren der MAP-
Subunitvakzinegruppe im Vergleich zu den erkrankten Tieren der Placebo-Gruppe
war im zweiten Versuch aber auffällig. In der statistischen Auswertung der Kaplan-
Meyer Diagramme (Abbildung 3 und 4) resultierte dies in schwach signifikanten
Unterschieden zwischen der MAP-Subunitvakzine- und der Placebogruppe bezüglich
der Morbidität (P = 0,0065), jedoch nicht der Mortalität (P = 0,3974).
Das Spektrum der Symptomatik und Pathologie war in der Subunitvakzinegruppe
des zweiten Experimentes sehr vielfältig (Tabelle 8 und 10). Bei zwei Tieren traten
akute Lahmheiten (85, 90) auf. Zwei weitere Tiere (86, 87) verstarben in Folge
hochgradiger diffuser fibrinös-eitriger Meningitiden, die mit dem Nachweis des
Belastungsstammes im Liquor cerebrospinalis bzw. im Gehirntupfer korrelierten. Vier
Tiere (84, 85, 86, 88) entwickelten in Folge der Belastungsinfektion fibrinös-eitrige
Pleuritiden bzw. in einem Fall (88) sogar eine teils fibrinöse teils nekrotisierende
Pleuropneumonie. Ein Tier (90) fiel durch eine fokale eitrige Hepatitis auf. Es ist
festzuhalten, dass bei den pathohistologischen Untersuchungen insgesamt keine
deutlichen Unterschiede in Bezug auf den Grad und die Ausdehnung der fibrinös-
eitrigen Veränderungen zwischen der Subunit- und der Placebogruppe festgestellt
wurden (Tabelle 10). Dies kommt auch in den Pathoscores der beiden Gruppen zum
Ausdruck (3,1 bzw. 3,75, Tabelle 10).
4.2.2.2 Heterologe Belastungsinfektion
Im dritten Versuch mit der heterologen Belastungsinfektion überlebte in der
Subunitvakzine- wie in der Placebogruppe nur eines von sechs Tieren. Die
statistische Auswertung des Verlaufs des Merkmals Mortalität im Kaplan-Meyer-
Diagramm (Abbildung 5) ergab entsprechend keine signifikanten Unterschiede
zwischen der Subunitvakzine- und der Placebogruppe (P =0,4785). Fünf Tiere dieser
Ergebnisse
62
Gruppe zeigten hochgradige Lahmheiten. Meist waren mehrere Gelenke betroffen,
so dass drei Tiere (208, 210, 211) nicht mehr in der Lage waren aufzustehen. Tier
208 zeigte trotz Lahmheit zusammen mit dem gesunden Tier (209) keinen Anstieg
der Leukozyten. In der Kontrollgruppe zeichnete sich ein ähnliches Bild ab. Auch hier
lag der Schwerpunkt der Erkrankung bei hochgradigen Lahmheiten. Bei den
erkrankten Tieren der Kontrollgruppe konnte ein Temperaturanstieg von >40,5°C
gemessen werden. Während in der Gruppe der Subunitvakzine nur drei Tiere (208,
211, 212) einen Anstieg der Körpertemperatur zeigten. Dies manifestierte sich bei
der statistischen Auswertung der Morbidität im Vergleich zur Placebogruppe in einem
des Belastungsstammes konnte nur bei einem Tier (210) der Subunitvakzinegruppe
in zwei Organen (Lunge, Peritoneum) erbracht werden (Tabell 9). Im Gegensatz zu
den homologen Belastungsversuchen konnte in den eitrigen Gelenkpunktaten trotz
Anreicherung kein Erreger nachgewiesen werden. In der pathohistologischen
Untersuchung konnten in der Subunitvakzinegruppe zwei (211, 212) mittelgradige
multifokale fibrinös-eitrige Synovialitiden diagnostiziert werden. Für drei Tiere (207,
208, 210) mit akuten Lahmheiten fehlte aber der Nachweis einer Synovialitis. Der
Pathoscore lag mit 1,5 unter dem der Placebogruppe, die durch den Nachweis
hochgradiger fibrinös-eitriger Entzündungen im Gehirn, Gelenk, Leber und/oder Milz
einen hohen Score von 3,0 erzielte (Tabelle 10).
4.2.2.3 Fazit zur Subunitvakzine
Abschließend ist festzuhalten, dass in keiner mit der Subunitvakzine immunisierten
Gruppe ein signifikanter Schutz vor Mortalität im Vergleich zur Placebogruppe erzielt
werden konnte. Im Vergleich zur Placebogruppe konnte aber unter Berücksichtigung
des zeitlichen Verlaufes im zweiten und dritten Versuch eine schwach signifikante
Schutzwirkung in Bezug auf das Merkmal Morbidität nachgewiesen werden
(Abbildung 4 und 6). Im Gegensatz zum ersten Versuch zeigte auch das Merkmal
Mortalität im zweiten homologen Belastungsversuch mit Emulsigen® als Adjuvans in
der Gruppe der Subunitvakzine einen weniger steilen Anstieg als in der
Placebogruppe (Abbildung 4). Im Immunisierungsversuch mit der heterologen
Ergebnisse
63
Belastungsinfektion verendeten in der Gruppe der Subunitvakzine genauso viele
Tiere wie in der Placebogruppe. Die pathologischen Ergebnisse sprachen aber für
ein geringeres Ausmaß fibrinös-eitriger Entzündungen in der Subunitvakzine- im
Vergleich zur Placebogruppe (Tabelle 10).
Ergebnisse
64
Abbildung 1: Mortalität bei Schweinen, die nach einer zweimaligen Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer Diagramm)
Abbildung 2: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8)aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer Diagramm)
Ergebnisse
65
Abbildung 3: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)
Abbildung 4: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)
Ergebnisse
66
Abbildung 5: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine(n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) intravenös mit dem heterologen Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®).(Kaplan-Meyer Diagramm)
Abbildung 6: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)
Ergebnisse
67
Tabelle 8: Klinische Befunde bei Schweinen, die nach einer Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.
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Ergebnisse
68
Tabelle 9: Reisolation des Belastungsstammes von Schweinen, die mit einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) immunisiert und anschließend homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.
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Ergebnisse
69
Tabelle 10: Differenzierung von fibrinös-eitrigen Entzündungen bei Schweinen nach homologer (Stamm 10) oder heterologer (Stamm A3286/94) Belastungsinfektion in Immunisierungsexperimenten mit einem Pathoscore von 1 bis 5 (1: minimal; 2 und 3: geringgradig und fokal; 4 und 5: mittel- oder hochgradig sowie multifokal oder diffus) 1
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Ergebnisse
70
4.3 Antikörperantworten von Schweinen nach experimenteller Infektion mit S. suis- Serotyp-2-Stamm 10 und Serotyp-9-Stamm A3286/94
Im dritten Teil dieser Dissertation wurde untersucht, wie sich der Gehalt der
spezifischen Immunglobuline G im Serum der Versuchstiere in Folge der Infektion
bzw. der Immunisierung veränderte. Es wurden zunächst ELISA-Verfahren für die
Bestimmung von relativen Antikörpertitern gegen MAP und MRP sowie EF etabliert.
Diese Etablierungsarbeiten ermöglichten das Festlegen von Qualitätskriterien (3.10).
Eine Berücksichtigung von Messwerten für diesen Ergebnisteil erfolgte nur, wenn alle
Kriterien erfüllt waren. Trotz wiederholter Versuche war es nicht möglich, einen
Ganzzell-ELISA zu etablieren, der ähnlichen Qualitätskriterien standhielt. Das in allen
ELISAs eingesetzte Konjugat erkannte nach Herstellerangaben alle IgG-Subtypen.
4.3.1 Experimentelle Infektion zur Etablierung des S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 Modells
Im Rahmen der Etablierung eines Modells für S. suis-Serotyp-9-Stamm Schweine
intranasal mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 infiziert. Keines der Tiere entwickelte
Symptome einer S. suis-Erkrankung. In hämatologischen und pathologische
Untersuchungen konnten aber Hinweise auf entzündliche Veränderungen in Folge
dieser intranasalen Belastungsinfektion gewonnen werden (siehe 4.1 und BEINEKE
et al. 2007). Es sollten die relativen Antikörpertiter gegen MAP und MRP sowie EF
prae und 20 Tage post infectionem verglichen werden. Bei der Interpretation der
Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass die Versuchstiere aus einem Bestand
kamen, der frei von Serotyp-9-Stämmen, aber nicht frei von S. suis war. In Proben
von Tieren dieses Bestandes wurden bis heute keine S. suis-Stämme nachgewiesen,
die positiv für das EF-Gen epf waren (BAUMS 2007). Vereinzelt konnten aber von
den Tonsillen Stämme isoliert werden, die das mrp-Gen trugen.
In Abbildung 7 sind die Antikörpertiter für die intranasal mit Stamm A3286/94
infizierte Gruppe vor und nach der Infektion dargestellt. Alle Tiere dieser Gruppe
zeigten einen Anstieg MRP-spezifischer Antikörper. Dieser Titeranstieg erreichte
Ergebnisse
71
jedoch bei keinem dieser Tiere Werte über 100 ELISA-Units. Bei fünf dieser sechs
Tiere konnte ein Anstieg spezifischer Antikörper gegen MAP Stamm A3286/94
festgestellt werden. Nach der Infektion wurde bei zwei Tieren (8, 116) ein anti-MAP
Antikörpertiter über 100 ELISA Units gemessen. In der Untersuchung des
Antikörperspiegels gegen EF konnte bei diesen mit A3286/94 infizierten Tieren wie
erwartet kein Anstieg ermittelt werden (Abbildung 7). In der mit Stamm 10 infizierten
Gruppe zeigten zwei der drei Tiere (119, 150), die mindestens die ersten fünf Tage
nach der Belastungsinfektion überlebten, eine Erhöhung des Antikörpertiters gegen
EF von 6 bzw. 8,7 ELISA-Units auf über 20 ELISA-Units. Bei diesen beiden Tieren
erfolgte auch ein Anstieg der Antikörpertiter gegen MRP und MAP auf Werte über
100 ELISA Units.
Abbildung 7: Antikörper gegen MRP (136 kDa Variante), MAP von A3286/94 und EF (110 kDa Variante) vor bzw. 20 Tage nach der intranasalen Infektion mit dem MRP+ SLY+ Serotyp 9 Stamm A3286/94 (EF negativ).
Ergebnisse
72
4.3.2 Immunisierungs- und Belastungsversuche
Die Etablierung des anti EF-ELISAs stand in Zusammenhang mit der Möglichkeit, auf
Grundlage der MAP-Subunitvakzine das DIVA-Konzept für MRP+ EF+
Serotyp-2-Stämme umzusetzen. Aufgrund der mangelhaften protektiven Wirkung der
Subunitvakzine wurde in den serologischen Untersuchungen zunächst auf die
Untersuchung der Antikörpertiter gegen EF verzichtet. Zum Nachweis der Induktion
der Antikörperbildung in Folge der Immunisierung mit der MAP-Subunit- bzw. der
Ganzzellvakzine wurde der MRP- und der MAP-ELISA eingesetzt.
In den beiden ersten Immunisierungsversuchen mit homologer Belastungsinfektion
konnte sowohl in der Ganzzell- als auch in der Subunitvakzinegruppe ein Anstieg der
Antikörper gegen MRP und MAP festgestellt werden (Abbildungen 8 und 9). Im
ersten Immunisierungsversuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans lagen jedoch 14
Tage nach der zweiten Immunisierung die relativen Antikörpertiter gegen MRP und
MAP bei allen Tieren unter 100 ELISA Units (Abbildung 8). Im Gegensatz dazu
entwickelten im zweiten Immunisierungsversuch mit Emulsigen® als Adjuvans alle
Tiere der Ganzzellvakzinegruppe 14 Tage nach der zweiten Immunisierung relative
MRP-spezifische Antikörpertiter über 100 ELISA-Units. Mit Ausnahme von zwei
Tieren (83, 85) konnte auch bei den Tieren der Subunitvakzinegruppe im zweiten
Immunisierungsversuch ein Anstieg der Antikörper auf Werte über 100 ELISA Units
festgestellt werden (Abbildung 9). Der Mittelwert des relativen Antikörperspiegels lag
bei Tieren der Ganzzellvakzinegruppe mit 369 ELISA-Units deutlich über dem der
Subunitvakzinegruppe mit 238 ELISA-Units. In den Kontrollgruppen des ersten und
zweiten Immunisierungsversuches konnte bei keinem Tier ein Anstieg des
MRP-spezifischen Antikörpertiters auf Werte über 100 ELISA-Units nachgewiesen
werden (Abbildungen 8 und 9).
Im dritten Immunisierungsexperiment zeigte sich wie im zweiten Versuch ein
deutlicher Anstieg des Titers der MRP-spezifischen Antikörper bei allen Tieren der
Ganzzell- und der Subunitvakzinegruppe (Abbildung 10). Die Varianz der
Antikörpertiter nach der Vakzinierung mit der Ganzzell- oder der Subunitvakzine war
im dritten wie auch zuvor im zweiten Immunisierungsexperiment sehr groß
(Standardabweichungen von 160 bis 230 ELISA-Units innerhalb einer Gruppe).
Ergebnisse
73
Trotzdem waren die Mittelwerte der MRP-spezifischen Antikörpertiter im zweiten und
dritten Immunisierungsexperiment gut reproduzierbar. Die Mittelwerte der
Ganzzellvakzine- bzw. Subunitvakzinegruppe im dritten Versuch waren 348 bzw. 265
ELISA-Units.
Die Tiere des zweiten und dritten Immunisierungsversuches wurden serologisch
auch auf einen Anstieg des Antikörpertiters gegen die Fraktion aus Murein-
assoziierten Proteinen von Stamm 10 untersucht. In Folge der Immunisierung trat bei
allen Tieren sowohl in der Ganzzell- als auch in der Subunitvakzinegruppe in beiden
Immunisierungsversuchen eine deutliche Serokonversion auf. Beide Gruppen
verhielten sich in Bezug auf diese Antikörpertiter sehr ähnlich und erreichten in
beiden Versuchen Mittelwerte zwischen 200 und 300 ELISA-Units (Abbildungen 11
und 12). Die Varianz der Antikörpertiter war 14 Tage nach der zweiten
Immunisierung innerhalb einer Gruppe sehr groß (Standardabweichungen von 80 bis
230 ELISA-Units innerhalb einer Gruppe). Mit Ausnahme von zwei Tieren erreichten
alle Tiere dieser immunisierten Gruppen MAP-spezifische Antikörpertiter mit Werten
über 100 ELISA-Units. Nur das Tier 94 der Ganzzellvakzinegruppe im zweiten
Versuch und das Tier 209 der Subunitvakzinegruppe des dritten Versuches blieben
mit 95 bzw. 70 ELISA-Units am 14. Tag nach der zweiten Immunisierung unter
diesem Grenzwert. Im dritten Immunisierungsversuch hatten in allen drei Gruppen
jeweils zwei Tiere Ausgangstiter mit Werten über 20 ELISA-Units, die im Vergleich zu
den positiven und negativen Kontrollen des ELISA als schwach positiv auffielen.
Diese schwach positiven relativen Titer, die auch in der Kontrollgruppe beobachtet
wurden, waren vermutlich Ausdruck der Auseinandersetzung mit anderen S. suis-
Stämmen, die bei allen Versuchstieren in den Tonsillen nachgewiesen wurden
(Ergebnisse nicht gezeigt).
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass in allen drei Immunisierungsversuchen
sowohl in den Ganzzell- als auch in den Subunitvakzinegruppen im Gegensatz zu
den Kontrollgruppen Serokonversionen gegenüber MRP in Folge der Immunisierung
nachgewiesen wurden. Die MRP-spezifischen Antikörpertiter erreichten in beiden
Versuchen mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans im Gegensatz
zu dem ersten Versuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans Werte, die deutlich über
Ergebnisse
74
dem relativen Titer von 100 ELISA-Units des Rekonvaleszenzserums lagen. In den
beiden letzten Versuchen mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) waren die
MRP-spezifischen Antikörpertiter in der Ganzzellvakzinegruppe tendenziell höher als
in der Subunitvakzinegruppe. Untersuchungen der Antikörpertiter gegen die Fraktion
der Murein-assoziierten Proteine ergaben ein sehr ähnliches Bild. Die
Ganzzellvakzinegruppe erzielte sowohl im zweiten als auch im dritten Versuch
höhere Mittelwerte für MAP-spezifische Antikörper als die entsprechende
MAP-Subunitvakzinegruppe.
Abbildung 8: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung (Alter von 3-4 Wochen) sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 51-57), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 61-68) oder einem Placebo (K, Tier 71-78) bei Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans. (1. Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion).
Ergebnisse
75
Abbildung 9: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8 Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. ( 2. Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion).
Abbildung 10: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8 Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans ( 3. Immunisierungsversuch, vor der heterologen Belastungsinfektion).
Ergebnisse
76
Abbildung 11: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10 vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans (2. Immunisierungsversuch, vor homologer Belastungsinfektion).
Abbildung 12: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10 vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. (3. Immunisierungsversuch, vor heterologer Belastungsinfektion).
Ergebnisse
77
4.3.3 Abschätzung der Bedeutung von MRP- und MAP-spezifischen Antikörpertitern (Gesamt IgG) als prognostische Indikatoren
Mehr als die Hälfte aller Versuchstiere mit Antikörpertitern > 100 ELISA-Units sowohl
gegen MRP als auch gegen MAP erkrankten bzw. verstarben in Folge der
S. suis-Infektion (Tabelle 11). Im zweiten Versuch entwickelte ein Tier (98) aus der
Ganzzellvakzinegruppe und zwei Tiere (86, 87) aus der Subunitvakzinegruppe eine
hochgradige diffuse fibrinös-eitrige Meningitis, obwohl diese Versuchstiere vor der
homologen Belastungsinfektion sowohl gegenüber MRP als auch gegenüber MAP
Antikörpertiter über 150 ELISA-Units aufwiesen. In dem dritten Versuch mit
heterologer Belastungsinfektion war in den immunisierten Gruppen gleichfalls kein
Zusammenhang zwischen hohen Antikörpertitern und Protektion zu erkennen. Die
Tiere 211 und 212 aus der MAP-Subunitvakzinegruppe hatten beispielsweise vor der
Belastungsinfektion sehr hohe MRP- und MAP-spezifische Antikörpertiter von über
400 bzw. 160 ELISA-Units. Trotzdem entwickelten beide Tiere schwere Lahmheiten
im Zusammenhang mit mittelgradigen multifokalen fibrinös-eitrigen Tarsitiden.
Ergebnisse
78
Tabelle 11: Mortalität und Morbidität aller Versuchstiere im Zusammenhang mit Antikörpertitern gegen MRP bzw. MAP vor der experimentellen Belastungsinfektion
MRP MAP-Serotyp 2
ELISA-Units 14 Tage nach der 2. Immunisierung > 100 < 100 > 100 < 100
Anzahl der überlebenden Tiere 9 13 10 3 Mortalität
Anzahl der verstorbenen Tiere 13 29 18 10
Positiver prädiktiver Wert für Protektion vor Mortalität 0,41 0,36
Negativer prädiktiver Wert für Protektion vor Mortalität 0,59 0,77
Anzahl nicht erkrankter Tiere 8 10 8 3
Morbidität
Anzahl erkrankter Tiere 15 31 17 13
Positiver prädiktiver Wert für Protektion vor Morbidität 0,35 0,32
Negativer prädiktiver Wert für Protektion vor Morbidität 0,76 0,81
Diskussion
79
5 Diskussion
In dem ersten Teil dieser Arbeit sollte ein Infektionsmodell für
S. suis-Serotyp-9-Stämme etabliert werden. Ein erheblicher Anteil von etwa 20% der
invasiven S. suis Erkrankungen in Europa kann auf Serotyp-9-Stämme zurückgeführt
werden (SILVA et al. 2006; WISSELINK et al. 2002b). Eine vergleichbare Bedeutung
besitzen vor allem in Mitteleuropa nur noch Serotyp-2-Stämme. Die Etablierung
eines Infektionsmodells für S. suis-Serotyp 9 eröffnete die Möglichkeit, in
Immunisierungsexperimenten mit Vakzinen aus Serotyp 2 Antigenen deren
Schutzwirkung gegenüber einer heterologen Belastungsinfektion mit Serotyp-9-
Stämmen zu untersuchen. Der Bedarf an einem Impfstoff mit einer solchen
heterologen Schutzwirkung ist in Europa erheblich. Es wäre erstmalig möglich,
S. suis-Erkrankungen in der Schweineproduktion prophylaktisch mit stallspezifischen
Vakzinen entgegen zu wirken.
Im Gegensatz zu dem Serotyp-2-Stamm 10 führte die intranasale Applikation des
Serotyp-9-Stammes A3286/94 bei sieben bis acht Wochen alten Ferkeln nicht zu
klinisch manifesten Erkrankungen. Aufgrund dieses Ergebnisses könnten Zweifel
aufkommen, ob der ausgewählte Stamm A3286/94 wirklich ein Vertreter der
virulenten Serotyp-9-Stämme ist, die in Europa für erhebliche Tierverluste
verantwortlich sind. Dieser Kritikpunkt erscheint vor allem plausibel, da bei S. suis
sehr unterschiedliche Genotypen zu einem Serotyp gehören können (KING et al.
2002; REHM et al. 2007; SMITH et al. 1997), die sich in der Virulenz erheblich
unterscheiden können. Aus folgenden Gründen erscheinen diese Zweifel aber
unberechtigt: A3286/94 wurde aus dem Gehirn von einem Schwein mit Meningitis
isoliert. Dieser Stamm exprimiert eine große Variante des „Muramidase-released
Proteins“ (MRP*) und besitzt das Suilysingen sly (SILVA et al. 2006). Beide Faktoren
sind Marker virulenter S. suis-Stämme (ALLGAIER et al. 2001; STAATS et al. 1999a;
VECHT et al. 1991). Typisierungen mit der AFLP und MLST zeigen, dass A3286/94
genetisch eng verwandt mit anderen Serotyp-9-Stämmen ist, die auch aus inneren
Organen von erkrankten Tieren isoliert wurden (REHM et al. 2007). Insbesondere
gehört A3286/94 zum klonalen Komplex 87. Klonale Komplexe stehen häufig im
Zusammenhang mit besonderen Virulenz- und Resistenzmerkmalen der
entsprechenden Stämme. Obwohl die intranasale Infektion mit A3286/94 klinisch
unauffällig verlief, spricht der Anstieg der Leukozyten im Blut in der ersten Woche
Diskussion
80
nach der Infektion für eine akute Infektion. Ferner konnten in den
pathohistologischen Untersuchungen dieser Tiere 20 Tage nach der Infektion
entzündliche Veränderungen der Serosen und im Gehirn festgestellt werden. Im
Einklang mit dem ungestörten Allgemeinbefinden waren diese Veränderungen alle
geringgradig und fokal begrenzt. Mit den im Rahmen dieser Dissertation
durchgeführten kulturellen bakteriologischen Untersuchungen war es nicht möglich,
den Erreger zu isolieren. Mit immunhistologischen und molekularbiologischen
Untersuchungen des Gehirns konnte aber in drei dieser sechs Fälle der
Belastungsstamm nachgewiesen werden (BEINECKE et al. 2007). Bei den anderen
drei Tieren konnten keine anderen Infektionserreger durch die bakteriologische
Untersuchung festgestellt werden. Nach intravenöser Applikation des
Serotyp-9-Stammes A3286/94 entwickelten alle vier infizierten Schweine klinisch
manifeste S. suis-Erkrankungen, insbesondere Synovialitis, Serositis und Meningitis.
Aufgrund der schwachen Virulenz des Serotyp-9-Stammes A3286/94 im intranasalen
Infektionsmodell wurden die Belastungsinfektionen mit A3286/94 in den
Immunisierungsversuchen intravenös ausgeführt.
In dem zweiten Teil der Arbeit sollte die protektive Wirkung einer Ganzzell- und einer
Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen verglichen werden. Die protektive
Wirkung von Ganzzellvakzinen gegenüber homologen Belastungsinfektionen mit
Serotyp-2-Stämmen konnte in vorangegangenen Studien von Wisselink et al. (2001,
2002) und BUSQUE et al. (1997) experimentell belegt werden (Tabelle 2).
Ganzzellvakzinen in der Form stallspezifischer Impfstoffe sind in Deutschland heute
vor allem bei Bestandsproblemen ein wichtiges Instrument zur Bekämpfung von
S. suis-Erkrankungen. Diese Form der Vakzinierung besitzt aber eine Reihe von
Nachteilen: Die Vakzinierung kann erst erfolgen, nachdem Erkrankungen aufgetreten
sind und die Diagnostik sowie die Herstellung der stallspezifischen Vakzine
abgeschlossen wurde. Die Herstellung der stallspezifischen Vakzinen erfolgt nicht
nach einer tierexperimentellen Prüfung der protektiven Wirkung.
Obwohl für S. suis keine Belastungsversuche mit heterologen Serotypen
beschrieben wurden (Tabelle 2), wird S. suis-Ganzzellvakzinen grundsätzlich keine
Abbildung 13: Tier 119 mit hgr. diffuse fibrinös-eitrige Meningitis nach intranasaler S. suis Stamm 10 Infektion. HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.
Abbildung 14: Tier 97 mit hgr. multifokaler fibrinös-eitriger Synovialitis nach intravenöser Infektion mit S. suis A3286/94 (Serotyp 9). HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.
Anhang
115
Abbildung 15: Tier 148 mit hgr. diffuser fibrinös-eitriger Pleuritis nach intranasaler S. suis Infektion mit Stamm 10. HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.
Tabelle 12: Pathohistologische Diagnosen und Nachweise der
Belastungstämme von allen Tieren im Überblick ..........................................105
Danksagung
Mein erster Dank geht an Herrn Prof. Dr. P. Valentin-Weigand und Herrn Prof. Dr. K. H. Waldmann für die Bereitstellung des interessanten Themas, für die Betreuung und bereitwillige Unterstützung. Herrn Dr. C. G. Baums möchte ich herzlich für die Organisation, Planung und Unterstützung bei der Durchführung der Tierversuche, für die Betreuung der Laborarbeit und für die Hilfe bei der Zusammenstellung der Dissertation danken. Danken möchte ich auch Frau Dr. C. Schroeder für die aktive Unterstützung in den Tierversuchen und der Beratung in klinischen Fragen. Für die Bearbeitung der Blutproben möchte ich ganz herzlich Herrn Prof. Dr. Ganter und seiner Arbeitsgruppe, hier insbesondere Frau Großmann, danken. Die Arbeitsgruppe der Abteilung Valentin-Weigand unterstützte mich während der gesamten Dissertation. Vor allem bedanke ich mich bei Frau C. Neis, Herrn PhD M. Fulde, Herrn PhD L. Benga für die tatkräftige Hilfe bei der Durchführung der Sektionen. Einen wichtigen Teil dieses Forschungsprojektes konnte durch die pathohistologischen Untersuchungen der Organproben von Herrn Dr. A. Beineke vom Institut für Pathologie verwirklicht werden. Herrn Fiedler und Herrn Richter danke ich für die problemlosen Tiertransporte zur Tierärztliche Hochschule Hannover. Weiterhin möchte ich Herrn Henstorf für die Bereitstellung von Nährböden danken. Auch Herrn W. Scharnhorst danke ich für die sorgfältige Reinigung und Desinfektion der Stallungen nach den Tierversuchen sowie für die Unterstützung bei den Vorbereitungsarbeiten im Tierstall. Für die Unterstützung und Beratung zur Etablierung des ELISAs danke ich Herrn Dr. T. Rehm. Des Weiteren danke ich Herrn Dr. Fischer aus der IVD GmbH für die Bereitstellung von Elmulsigen® und für die professionelle Beratung zur Herstellung der Ganzzellvakzine. An dieser Stelle möchte ich mich auch bei Herrn Dr. M. Beyerbach vom Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung meiner Daten und bei Herrn J. Merkel für die Hilfestellung zur digitalen Bearbeitung bedanken. Finanziert wurde diese Arbeit von der IDT Biologika GmbH, Dessau-Tornau, auch hierfür herzlichen Dank. Mein besonderer Dank gilt meiner Familie und Philipp, die mich im gesamten Studium tatkräftig unterstützt haben und mir das Erreichen meiner Ziele ermöglichten.