Tierärztliche Hochschule Hannover Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen und Optimierung der Messzeit des Multiplate® Aggregometers INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Monia Abid Essen Hannover 2011
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen und Optimierung
der Messzeit des Multiplate® Aggregometers
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Monia Abid
Essen
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke Klinik für Kleintiere 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. K. Feige
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2011
Meiner Familie
„Klingt komisch, ist aber so.”
- Die Sendung mit der Maus -
Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form eines Posters auf folgender
Fachtagung präsentiert:
19. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“ der DVG
(InnLab 2011):
Thrombozytenfunktionsmessung mit dem Multiplate® analyser: Optimierung der
Messzeit für canines Blut
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung ....................................................................................................... 1
II Literaturübersicht ........................................................................................ 4
Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss entzündlicher
Erkrankungen aufgrund bakterieller und protozoischer Infektionen auf die
Thrombozytenfunktion bei Hunden zu untersuchen. Dies geschah mittels verschiedener
Globaltests und spezifischer Methoden, zu denen auch das im ersten Teil bearbeitete, relativ
neue Multiplate® Impedanzaggregometer gehörte. Die Ergebnisse wurden mit denen einer
gesunden Kontrollgruppe verglichen und darüber hinaus wurden die Ergebnisse von Patienten
mit SIRS und ohne SIRS miteinander verglichen.
II Literaturübersicht
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II Literaturübersicht
1. Thrombozytenfunktion
Thrombozyten sind in der Lage, kleine endotheliale Defekte durch die Formation eines
primären Thrombus zu verschließen und dienen somit der Aufrechterhaltung der
Gefäßintegrität (SCHARF 1997). Des Weiteren fördern sie die Heilung der
Gefäßwandverletzung und spielen eine wichtige Rolle bei Entzündungsprozessen (GENTRY
1992).
1.1. Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel
Eine Verletzung der Gefäßwand führt zur Freilegung subendothelialer Strukturen, die
aus Struktur- und Adhäsionsproteinen zusammengesetzt sind und deren Interaktion mit den
Thrombozyten normalerweise durch das intakte Endothel verhindert wird (RUGGERI 1994).
Von Bedeutung für die primäre Hämostase sind v.a. Kollagene, Fibronektin und Laminin,
sowie der von-Willebrand-Faktor (vWF), der vom Endothel sezerniert wird und im Fall eines
Gefäßwanddefektes an das freigelegte Kollagen binden kann (JACKSON et al. 2000). Diese
Faktoren bilden die Grundelage für die Adhäsion der Thrombozyten an den Defekt.
Die an der Adhäsion beteiligten Rezeptoren und Liganden sind abhängig von den
vorherrschenden Scherkräften: in Bereichen mit niedrigen Scherkräften (venöses
Gefäßsystem) ist die irreversible Bindung von Kollagen, Fibronektin und Laminin an die
entsprechenden thrombozytären Integrine ausreichend, um eine Ansammlung und Adhäsion
der Plättchen zu ermöglichen (KROLL et al. 1996). Bei hohen Scherkräften, wie sie im
arteriellen Stromgebiet und in der Mikrozirkulation vorherrschen, sind Bindungen mit höherer
Affinität erforderlich. In diesem Fall findet die Interaktion zunächst zwischen dem vWF und
dem thrombozytären GPIb/IX/V-Rezeptor statt (REININGER et al. 2006). Im Anschluss
erfolgt eine Stabilisierung der Plättchenadhäsion durch die bereits erwähnten irreversiblen
Bindungen mit Kollagen, Fibronektin und Laminin (SIXMA et al. 1995). Die Adhäsion der
Thrombozyten führt zum sogenannten „shape change“, einer Formveränderung der Zelle, die
mit Ausbildung von Pseudopodien einhergeht. Sie führen zur Oberflächenvergrößerung und
somit einer besseren Abdichtung des Defekts (GAWAZ 1999).
II Literaturübersicht
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1.2. Aktivierung der Thrombozyten
Die Aktivierung der Thrombozyten führt zu strukturellen und funktionellen
Veränderungen der Zelle und ist Voraussetzung für den Ablauf der Aggregation. Sie wird
zum einen durch den Adhäsionsvorgang selbst, zum anderen durch chemische Stimuli in
Form von Agonisten induziert (GAWAZ 1999). Diese werden sowohl vom Thrombozyt
selbst, als auch vom umliegenden Gewebe produziert und binden an spezifische Rezeptoren
auf der Thrombozytenoberfläche. Neben dem bereits erwähnten „shape change“ und der
Freilegung des GPIIb/IIIa-Rezeptors kommt es zu einer Umorientierung der
Membranphospholipide. Von übergeordneter Bedeutung ist dabei die Translokation des
Phosphatidylserins von innen nach außen, das als Bindungsstelle für aktivierte
Gerinnungsfaktoren dient und maßgeblich an der Generierung von aktiviertem Faktor X und
Thrombin beteiligt ist (ZWAAL u. SCHROIT 1997).
1.2.1. Signaltransduktion
Die Signaltransduktion dient der Weiterleitung von Reizen außerhalb der Zelle ins
Zellinnere. Dabei sind in der Regel eine Vielzahl von Enzymen und „second messenger“
beteiligt. Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung haben die verschiedenen
Signaltransduktionswege alle eine Erhöhung der intrazellulärem Ca2+-Konzentration zum
Ziel, die durch den Influx von extrazellulärem Ca2+ und der Degranulation erreicht wird
(ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Die drei Enzyme Phospholipase C, Phospholipase A2
und Adenylatzykalse sind daran maßgeblich beteiligt.
Zunächst bindet ein Agonist an seinen spezifischen thrombozytären
Oberflächenrezeptor, die zur Gruppe der Guaninnukleotid-bindenden Proteine (G-Proteine)
gehören. Das aktivierte G-Protein wiederum aktiviert zwei Enzyme: die Phospholipase C und
die Phospholipase A2.
Die Phospholipase C führt zu einer hydrolytischen Spaltung des
Membranphospholipids Phosphoinositol-4,5-biphosphonat (PIP2) in Inositol-1,4,5-
Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DG). Während IP3 zu einem Anstieg des intrazellulären
Ca2+ führt, aktiviert DG die Proteinkinase C, welche über weitere Signalproteine zur
Degranulation und der Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors führt (BRASS et al. 1997).
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Die Phospholipase A2, zusätzlich durch die erhöhte Ca2+-Konzentration aktiviert,
bedingt die Freisetzung von Arachidonsäure (AS) aus der Plasmamembran. Sie dient als
Substrat für die Cyclooxygenase-1 (COX-1) und die Thromboxansynthetase, welche daraus
Thromboxan A2 (TxA2) bilden. Neben der Degranulation bewirkt TxA2 auch eine
Vasokonstriktion und agiert außerdem selbst als Agonist (BRASS et al. 1997).
Handelt es sich bei dem durch den Agonisten aktivierten G-Protein um ein
inhibitorisches G-Protein, führt dies zu einer Hemmung der Adenylatzyklase, was eine
erniedrigte zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP)-Konzentration zur Folge hat. cAMP
wirkt antagonistisch auf die Thrombozytenaktivierung (BRASS et al. 1997).
1.3. Sekretion der Granula-Inhaltsstoffe
Im Verlauf des Adhäsionsvorgangs kommt es zur Freisetzung der thrombozytären
Granula-Inhaltsstoffe. Dies geschieht per Exozytose (Fusion der Granulamembran mit der
Plasmamembran) und durch Verschmelzung der Granula mit dem offenen kanalikulären
System (RENDU u. BROHARD-BOHN 2001). Die Degranulation ist abhängig von der
intrazellulären Ca2+ -Konzentration, wobei jeder der drei verschiedenen Granulatypen eine
andere Schwellenkonzentration aufweist, die überschritten werden muss. Dadurch bedingt
werden zunächst die dichten Granula und dann die α -Granula, gefolgt von den Lysosomen
freigesetzt (GAWAZ 1999). Folge der Degranulation ist die Verstärkung der
Thrombozytenaktivierung, die Einleitung der Aggregation und die Rekrutierung weiterer
Blutplättchen. Im Rahmen der Degranulation der α-Granula kommt es darüber hinaus zu einer
Translokation des P-Selektins von der Granula-Membran auf die Thrombozytenoberfläche
(PENG et al. 1994).
1.4. Aggregation der Thrombozyten
Die Aggregation umfasst den Vorgang der Koadhäsion zweier Thrombozyten
(GAWAZ 1999). Eine zentrale Rolle spielt dabei der GPIIb/IIIa-Rezeptor der Blutplättchen.
Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung werden Bindungsstellen für Fibrinogen am
GPIIb/IIIa-Rezeptor freigelegt und es findet eine primäre Aggregation statt, bei der reversible
Fibrinogenbrücken zwischen den Plättchen entstehen (RUGGERI 1994). Sobald es zur
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Degranulation der Thrombozyten kommt, verfestigen sich die Fibrinogenbrücken, es findet
eine irreversible, sekundäre Aggregation statt (GAWAZ 1999).
Von entscheidender Bedeutung für den Prozess der Aggregation ist Ca2+, denn nur in
Anwesenheit dieses Kations kann plasmatisches Fibrinogen an den GPIIb/IIIa-Rezeptor
binden (SIESS 1989). Ca2+ und auch Fibrinogen sind außerdem in den Granula gespeichert
und liegen deshalb nach der Degranulation in besonders hoher Konzentration vor (MEYERS
et al. 1982).
1.5. Die Rolle der Thrombozyten für die Blutgerinnung (zellbasiertes Modell)
Das in den letzten Jahren etablierte zellbasierte Modell der Hämostase hat deutlich
gemacht, dass eine strikte Trennung von primärer und sekundärer Hämostase, wie es in der
Vergangenheit üblich war, in vivo nicht gegeben ist. Der Vorgang der Blutstillung wird
demnach in drei Phasen unterteilt, die überlappend ablaufen und als Initiation, Amplifikation
und Propagation bezeichnet werden (HOFFMAN u. MONROE 2001; SMITH 2009).
1.5.1. Initiation
Ein Integritätsverlust des Endothels führt zur Freilegung tissue factor (TF)-tragender
Zellen, die sich im Subendothel der Gefäßwand befinden. Physiologischerweise im Blut
zirkulierender Gerinnungsfaktor (F) VIIa bildet einen Komplex mit dem freigelegten TF
(SMITH 2009). Dieser Komplex aktiviert FX und FIX, woraufhin FXa an den Cofaktor FVa
bindet und damit einen Prothrombinasekomplex erzeugt, der aus einer kleinen Menge
Prothrombin Thrombin generieren kann (BECKER 2005). Der Prozess der Initiation findet
bis hierhin auf der TF-tragenden Zelle statt. Während FXa nach Abspaltung von der TF-
tragenden Zelle sofort durch Antithrombin und tissue factor pathway inhibitor inaktiviert
wird, ist FIXa in der Lage zu dissoziieren und zur Thrombozytenmembran zu gelangen
(ROBERTS et al. 2006).
1.5.2. Amplifikation
Das während der Initiation generierte Thrombin diffundiert in den Blutfluss und setzt
weitere Mechanismen in Gang. Auf der Thrombozytenoberfläche führt Thrombin zur
Aktivierung von FV und FXI und darüber hinaus wird FVIII mithilfe des Thrombins vom
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zirkulierenden vWF abgespalten und aktiviert (SMITH 2009). Während FVIIIa zu einer
Amplifikation der Thrombingenerierung führt, induziert der isolierte vWF die
Thrombozytenadhäsion (s. Kap. 1.2.) und –aggregation (s. Kap. 1.4.) (HOFFMAN u.
MONROE 2001). Außerdem bindet Thrombin direkt an Rezeptoren auf der
Thrombozytenoberfläche und aktiviert dadurch die Blutplättchen. Diese vollziehen einen
„shape change“, erzeugen durch Umverteilung der Membranphospholipide eine negative
geladene, prokoagulatorische Oberfläche, die zur Bildung weiteren Thrombins beiträgt und
setzen den Inhalt ihrer Granula frei (s. Kap 1.3.) (ZWAAL u. BEVERS 1983).
1.5.3. Propagation
Die Degranulation der Thrombozyten führt zur Rekrutierung weiterer Blutplättchen,
auf deren Oberfläche Liganden exprimiert werden, die die Aggregation induzieren (SMITH
2009). Durch Aktivierung weiterer Faktoren auf der Thrombozytenoberfläche kommt es zur
Generierung größerer Mengen Thrombin, das letztendlich durch Abspaltung von Peptiden aus
Fibrinogen Fibrin bildet (BECKER 2005).
2. Agonisten und ihre Thrombozytenoberflächenrezeptoren
Die Aktivierung der Thrombozyten wird durch verschiedene lösliche Substanzen
induziert, den Agonisten. Über verschiedene Signaltransduktionswege führen sie letztendlich
alle zu einer Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors und damit der Freilegung der Fibrinogen-
Bindungsstellen. Es existiert eine Vielzahl von Plättchen-aktivierenden Substanzen, darunter
Kollagen, Thrombin, Adenosindiphosphat (ADP), AS, Ristocetin, Serotonin und Epinephrine,
die je nach Spezies unterschiedlich potent sind. Alle bisher bekannten Agonist-spezifischen
Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche gehören zur Gruppe der G-Proteine (GENTRY
2000).
2.1. Kollagen und Kollagenrezeptoren
Das Subendothel der Gefäße enthält hauptsächlich Kollagen vom Typ I, III und VI
(SAVAGE et al. 2001). Kommt es zu einer Verletzung des Endothels, werden
II Literaturübersicht
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Kollagenfibrillen freigelegt und können in Kontakt mit den Thrombozyten treten. Dabei
binden sie direkt an spezifische Kollagenrezeptoren auf der Plättchenoberfläche und dienen
somit sowohl der Adhäsion als auch der Aktivierung. Thrombozyten besitzen drei
verschiedene Kollagenrezeptoren: das Integrin GPIb/IIa, den zur Immunoglobulin-
Superfamilie gehörenden GPVI-Rezeptor und den von-Willebrand-Rezeptor (GPIb/IX/V)
(FARNDALE 2006). Bindet Kollagen nun an einen entsprechenden Rezeptor, kommt es zur
Freisetzung von AS aus der Plättchenmembran. Diese wird mit Hilfe der thrombozytären
Zyklooxygenase (COX-1) in Thromboxan A2 umgewandelt, welches wiederum ein potenter
Plättchenaktivator ist (YARDUMIAN et al. 1986).
2.2. Thrombin und Protease-aktivierte Rezeptoren
Thrombin ist eine Serinprotease, die Fibrinogen zu Fibrin spalten kann und einen der
potentesten aggregationsinduzierenden Agonisten darstellt (SAVAGE et al. 2001). Es wird
aus seinem inaktiven Vorläufer Prothrombin im Rahmen der Gerinnungskaskade generiert.
Dieser Vorgang wird maßgeblich durch die Anwesenheit aktivierter Thrombozyten gefördert,
deren negativ geladene Membranphospholipide die Bildung des Prothrombinasekomplexes
ermöglichen (QUINN 2005). Thrombozyten produzieren darüber hinaus selbst Thrombin,
was einen amplifizierenden Effekt auf die Aggregation hat.
Thrombin bindet an thrombozytäre Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR), die G-
Protein gekoppelt sind (MOLINO et al. 1997). Insgesamt sind vier dieser Rezeptoren bekannt:
PAR-1, PAR-2, PAR-3 und PAR-4. Während PAR-2 nicht thrombin-sensitiv ist, wird PAR-3
nur auf Mäuse-Blutplättchen exprimiert (P. J. O'BRIEN et al. 2001). Humane Thrombozyten
besitzen demnach PAR-1 und PAR-4, wobei sich die zwei Rezeptoren in ihrer Affinität für
Thrombin unterscheiden (KAHN et al. 1999). PAR-1 wird bereits durch geringe
Konzentrationen von Thrombin stimuliert und führt zu einer schnellen und kurzen
Aktivierung, für die Stimulierung von PAR-4 sind höhere Konzentrationen erforderlich
(SHAPIRO et al. 2000). Da Studien gezeigt haben, dass Thrombozyten von Hunden nicht in
gleichem Maße auf humanes Thrombin reagieren wie menschliche Thrombozyten (DERIAN
et al. 1995), scheint es Unterschiede in der Verteilung oder Sensitivität der PAR zu geben, die
aber noch nicht hinreichend geklärt sind.
II Literaturübersicht
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Neben den mäßig affinen PA-Rezeptoren existiert noch ein weiterer, hochaffiner
Rezeptor für Thrombin: der GPIb-Rezeptor, welcher Bestandteil des vWF-Rezeptors
(GPIb/IX/V) ist (SOSLAU et al. 2001). Die Aktivierung dieses Rezeptors führt zu einer
Hemmung der Fibrinogenspaltung durch Thrombin, steigert aber gleichzeitig die Aktivierung
von PAR-1 (DE CANDIA et al. 2001; LI et al. 2001).
2.3. ADP und ADP-Rezeptoren
ADP ist ein Purinnukleotid, das in den dichten Granula der Thrombozyten gespeichert
und von Erythrozyten und beschädigtem Endothel freigesetzt wird (GAARDER et al. 1961;
MEYERS et al. 1982). Canine Thrombozyten weisen eine sehr unterschiedliche Sensitivität
gegenüber ADP auf, die im Verdacht steht rasseabhängig zu sein (NIELSEN et al. 2007), aber
dennoch wesentlich höher ist als die humaner Blutplättchen (SOLOVIEV et al. 1999).
Auf der Thrombozytenoberfläche befinden sich drei verschiedene Bindungsstellen für
ADP. P2Y1 und P2Y12 sind G-Protein-gekoppelte, purinerge Rezeptoren (JIN et al. 1998).
P2Y1 induziert einen „shape change“, Ca2+-Freisetzung und aktiviert die Phospholipase C,
während P2Y12 die Adenylatzyklase hemmt (DANIEL et al. 1998). Die Bindung an beide
Rezeptoren induziert letztendlich die Aggregation. Der P2X1-Rezeptor hingegen ist ein
Ionenkanal, an den sowohl ADP als auch ATP binden kann. Er ermöglicht den Influx von
Ca2+, scheint aber keine bedeutende Rolle für die Aggregation zu spielen (SAVI et al. 1997).
Seine genaue Funktion ist noch nicht hinreichend geklärt.
2.4. Eicosanoide
Eicosanoide sind hormonähnliche Signalstoffe, die von einer Vielzahl von Zellarten
und Geweben produziert werden. Dabei handelt es sich um Abkömmlinge mehrfach
ungesättigter C20-Fettsäuren, insbesondere der AS.
Die aktivierte Phospholipase A2 setzt aus der Plasmamembran AS frei (QUINN 2005).
Diese dient als Substrat für die thrombozytäre COX-1, welche daraus als Zwischenmetabolit
Prostaglandin (PG) H2 produziert. PGH2 wird mit Hilfe der Thromboxan-Synthetase in TxA2
umgewandelt (REILLY u. FITZGERALD 1993). TxA2 ist eine labile Substanz, die eine kurze
Halbwertszeit von nur ca. 30 s hat und schnell in das inaktive Thromboxan B2 (TB2)
hydrolysiert wird (HALUSHKA et al. 1989).
II Literaturübersicht
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Es existieren zwei Isoformen von TxA2-Rezeptoren: TxRα und TxRβ, die beide G-
Protein-gekoppelt sind (PAUL et al. 1999). Während TxRα die Phospholipase C aktiviert,
führt TxRβ zu einer Hemmung der Adenylatzyklase. Auch der TxA2-Vorläufer PGH2 ist in
der Lage, die Rezeptoren zu stimulieren (HALUSHKA et al. 1995). In niedrigen
Konzentrationen hat PGH2 einen amplifizierenden Effekt, während es in hohen
Konzentrationen inhibitorisch wirkt (QUINN 2005).
Nicht alle Spezies sprechen in gleichem Ausmaß auf AS und TxA2 an. Humane
Thrombozyten reagieren insgesamt stärker als Thrombozyten domestizierter Tiere (GENTRY
2000) und auch innerhalb der Spezies Hund existieren Unterschiede, die erblich bedingt zu
sein scheinen und evtl. rasseabhängig sind (NIELSEN et al. 2007; KALBANTNER et al.
2010). Auch der primäre Agonist hat einen Einfluss auf die TxA2-Produktion: eine
Aktivierung der Thrombozyten durch Kollagen oder Thrombin verursacht eine höhere TxA2-
Synthese als durch ADP (GENTRY 2000).
2.5. Epinephrin
Das Hormon Epinephrin (Adrenalin) wird im Nebennierenmark gebildet und in
Stresssituationen freigesetzt. Neben einer Vielzahl anderer lebenswichtiger Funktionen spielt
es auch eine Rolle im Rahmen der Thrombozytenaktivierung. Epinephrin bindet sowohl an
thrombozytäre stimulierende α-Rezeptoren, die zur Hemmung der Adenylatzyklase führen,
als auch an inhibitorische β-Rezeptoren (SOLOVIEV et al. 1999). Dies erklärt die
unterschiedliche Sensitivität verschiedener Spezies gegenüber Epinephrin, da die
Rezeptorendichte (α/β-Verhältnis) speziesabhängig ist (KERRY et al. 1984). Canine
Thrombozyten sprechen nur sehr schlecht auf Epinephrine an (FEINGOLD et al. 1986), es
kann lediglich den Effekt anderer Agonsiten amplifizieren (GENTRY 2000).
3. Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel
Clopidogrel ist ein Thienopyridin, das den P2Y12-ADP-Rezeptor blockiert. Dieses,
zurzeit nur in Tablettenform verfügbare Medikament, stellt eine „prodrug“ dar, welche
zunächst durch Cytochrom P450 in der Leber in ihren aktiven Metaboliten verstoffwechselt
II Literaturübersicht
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werden muss (SAVI et al. 1994). Die dabei entstehenden Metaboliten sind beim Menschen
bereits eingehend untersucht worden, beim Hund hingegen noch relativ unbekannt. Beim
Menschen entstehen der aktive Metabolit R-130964, ein Thiolderivat, und der inaktive
Metabolit SR 26334 (PEREILLO et al. 2002). Letzterer konnte auch bei mit Clopidogrel
behandelten Hunden nachgewiesen werden, wenn auch in etwas niedrigeren Konzentrationen
(BRAINARD et al. 2010).
Der aktive Metabolit des Clopidogrels bindet irreversibel an den P2Y12-Rezeptor und
führt zu dessen Inaktivierung (MUELLER et al. 2007). Dadurch wird die Hemmung der
Adenylatzyklase antagonisiert, was zu einem erhöhten cAMP-Spiegel im Thrombozyten führt
(SAVI et al. 2001). Clopidogrel hemmt die ADP-induzierte Sekretion der α-Granula und die
Adhäsion am Subentdothel (GAWAZ 1999). Letztendlich führt all dies indirekt zur
Hemmung der GPIIb/IIIa-Rezeptor-Aktivierung. Außerdem scheint Clopidogrel die
Fibrinolyse zu steigern (GAWAZ 1999).
Die in der Humanmedizin gängige Dosierung von 75 mg/Tag führt nach 3–7 Tagen zu
einem steady state (SAVCIC et al. 1999). In einer Studie von BRAINARD et al. (2010)
wurde die Pharmakodynamik von Clopidogrel bei Hunden mittels Thrombelastografie,
turbidimetrischer und Impedanzaggregometrie untersucht. Die Hunde erhielten Clopidogrel in
einer Dosierung von 0,32–1,3 mg/kg/Tag über 3–5 Tage. Dabei zeigte sich, dass es bereits
drei Stunden nach Therapiebeginn zu einer signifikanten Hemmung der ADP-induzierten
Thrombozytenaggregation kommt und dass die Wirkdauer auch beim Hund ca. 24 Stunden
beträgt, wobei eine vollständige Wiederherstellung der Plättchenfunktion ca. 7 Tage nach
Absetzen des Medikaments erfolgte.
4. Thrombozytenfunktionsdiagnostik
Es existiert eine Vielzahl verschiedener Analyseverfahren zur Messung der
Thrombozytenfunktion, aber nur wenige konnten sich bisher in der Routinediagnostik
durchsetzen. Dies liegt u.a. daran, dass viele der Verfahren sehr aufwendig sind und eine
schlechte Standardisierbarkeit aufweisen. Zu den am häufigsten verwendeten Verfahren
gehören die kapilläre in-vivo Blutungszeit, die automatische Thrombozytenfunktionsanalyse
II Literaturübersicht
13
mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100, die turbidimetrische
Thrombozytenaggregationsmessung nach Born und die Impedanzaggregometrie.
4.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit
Die Messung der kapillären Blutungszeit gehört zu den ältesten Verfahren der
Thrombozytenfunktionsdiagnostik in der Humanmedizin (RAND et al. 2003). Der Test dient
als Screeningverfahren zur Feststellung von Störungen der primären Hämostase aufgrund
einer Thrombozytopenie, Thrombozytendysfunktion oder eines Mangels an vWF (MISCHKE
u. KEIDEL 2003).
Beim Hund wird die Blutungszeit zumeist an der bukkalen Maulschleimhaut getestet,
indem eine Inzision an der Innenseite der Lefze durchgeführt und die Zeit bis zum Stillstand
der Blutung gemessen wird. Im Rahmen der Evaluierung der Methode durch JERGENS et al.
(1987) konnten verlängerte Blutungszeiten bei Hunden mit Thrombozytopenie, von-
Willebrand-Erkrankung und Urämie, sowie nach Acetylsalizylsäure (ASS)-Verabreichung
gemessen werden. Von Nachteil bei dieser relativ weit verbreiteten Methode ist die in der
Regel erforderliche Sedation, da die Inzision schmerzhaft ist und demnach schlecht toleriert
wird (FORSYTHE u. WILLIS 1989; BRASSARD u. MEYERS 1991) und die
Schwierigkeiten, die sich beim Stoppen der Blutung im Fall einer ernsthaften
Hämostasestörung ergeben.
In den 90er Jahren stellten NOLTE et al. (1997) eine Methode zur Messung der
kapillären Blutungszeit an der Zehe von nicht-anästhesierten Hunden vor. Zur Evaluierung
der Methode erfolgten Messungen der kapillären Blutungszeit und der Kollagen-induzierten
maximalen Thrombozytenaggregation bei 11 klinisch gesunden Hunden, die zuvor intravenös
ASS appliziert bekommen hatten. Dabei konnte eine reproduzierbare Verlängerung der
Blutungszeit beobachtet werden. Die Vorteile dieser Methode sind die nicht erforderliche
Narkose und die bessere, wenn auch nicht vollständige Standardisierbarkeit (zur
Durchführung s. S. 34).
4.2. Plättchenfunktionsanalysator PFA-100
Die automatische Plättchenfunktionsanalyse mittels PFA-100 kann als ein Globaltest
der primären Hämostase angesehen werden. 1985 stellten KRATZER und BORN erstmals ein
II Literaturübersicht
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Verfahren zur in vitro Messung der Blutungszeit vor (KRATZER u. BORN 1985), auf dessen
Prinzip auch der PFA-100 basiert. Dabei wird Vollblut unter einem Vakuum durch eine
Kapillare gesaugt, an deren Ende sich eine Agonisten-beschichtete Membran befindet, die
eine zentrale Öffnung aufweist und die Zeit bis zu deren Verschluss durch die Thrombozyten
gemessen wird (s. S. 34). Aufgrund der Einbeziehung von hohen Scherkräften ist der PFA-
100 besonders sensitiv gegenüber Störungen des vWF (CALATZIS 2007). Der Vorteil
gegenüber der in vivo Blutungszeit besteht in der besseren Standardisierbarkeit und einem
geringeren Aufwand (MUELLER et al. 2009).
Da das Gerät ursprünglich für den Einsatz in der Humanmedizin konzipiert wurde,
prüften verschiedene Studien seine Eignung für die Untersuchung von Hundeblut (CALLAN
u. GIGER 2001; KEIDEL 2001). Dabei stellte sich heraus, dass der PFA-100 durchaus auch
für die Untersuchung von Hundeblut geeignet ist, wobei eine der zwei verschiedenen
Messzelltypen zu bevorzugen ist (Kollagen/ADP-Messzelle). CALLAN u. GIGER (2001)
untersuchten im Einzelnen die Anwendbarkeit des Gerätes bei Hunden mit
Thrombozytopenie, Thrombopathie und von-Willebrand-Erkrankung und konnten verlängerte
Verschlusszeiten bei diesen Hunden feststellen. Aufgrund des signifikanten Einflusses des
Hämatokrits auf die Messergebnisse ist der klinische Anwendbarkeit jedoch begrenzt
(MISCHKE u. KEIDEL 2003).
4.3. Turbidimetrische Aggregometrie nach BORN
Die von BORN im Jahre 1962 vorgestellte turbidimetrische Aggregometrie basiert auf
der Änderung der optischen Dichte von plättchenreichem Plasma (PRP) nach Zugabe eines
aggregationsinduzierenden Agonisten. Diese Methode galt lange Zeit als „Goldener Standard“
in der Thrombozytenfunktionsdiagnostik, was insbesondere an der guten Standardisierbarkeit
lag (HARRISON 2005). So kann die Thrombozytenzahl im PRP problemlos durch
Verdünnung oder Aufkonzentrieren eingestellt werden, was es ermöglicht, die
Thrombozytenfunktion unabhängig von quantitativen Einflüssen zu untersuchen. Nachteil
dieser Methode ist die relativ aufwendige Probenaufbereitungszeit, die mehrere
Zentrifugationsschritte umfasst und einige unerwünschte Nebeneffekte mit sich bringt. So
werden größere Thrombozyten, die in der Regel besonders aktiv sind, häufig mit
abzentrifugiert und es kann während der Zentrifugation zu Zellschädigungen kommen
II Literaturübersicht
15
(DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Studien haben gezeigt, dass je nach
Separationsmethode im Durchschnitt nur 61–90% der gesamten Thrombozyten in die
Messung mit eingehen (PERSIDSKY u. LING 1982). Des Weiteren ist die Messung in
lipämischem oder ikterischem Plasma nicht möglich (RAND et al. 2003). In einer Studie von
MISCHKE et al. (2004), in der die Plättchenaggregation einer großen Anzahl klinisch
gesunder Hunde gemessen wurde, zeigte sich, dass die turbidimetrische Methode besonders
sensitiv gegenüber verminderter Aggregation ist. Dabei erwiesen sich Konzentrationen von >
25 µmol/L ADP, 10 µg/mL Kollagen und 1 IU/mL Thrombin als besonders geeignet,
wohingegen die Agonisten Ristocetin und Epinephrin für die Untersuchung von caninem
Plasma ungeeignet sind. Dies bestätigen Ergebnisse aus verschiedenen früheren Studien, die
ebenfalls ein schlechtes Ansprechen caniner Thrombozyten auf Ristocetin (LEIS et al. 1980)
und Epinephrin (CLEMMONS u. MEYERS 1984; FEINGOLD et al. 1986) im PRP
beobachten konnten.
4.4. Vollblutaggregometrie
In den letzten 25 Jahren wurden immer wieder Methoden entwickelt, die die
Aggregation im Vollblut messen (CALATZIS 2007). Der Vorteil gegenüber der Messung im
PRP besteht, neben dem Wegfall der Zentrifugation und der damit einhergehenden
Zeitersparnis, vor allem im Vorherrschen eines physiologischen Milieus. Studien haben den
Einfluss von roten und weißen Blutzellen auf die Thrombozytenfunktion aufgezeigt. So
konnten GAARDER et al. (1961) das Vorhandensein von ADP in roten Blutzellen und dessen
Effekt auf die Plättchenadhäsion belegen. SANTOS et al. (1991) konnten in ihrer Studie an
klinisch gesunden Menschen zeigen, dass Erythrozyten einen modulierenden Effekt auf die
Thrombozytenreaktivität haben, indem sie zu einer gesteigerten Plättchenaktivierung, einer
erhöhten Mobilisierung von AS aus dem Thrombozyten und einer vermehrten Ansammlung
von AS in der zellulären Umgebung führen. Dies erklärt, warum beim Vollblutverfahren im
Vergleich zum PRP eine höhere Menge an ADP zugesetzt werden muss, um eine Aggregation
zu induzieren und auf der anderen Seite weniger AS nötig ist (SIESS 1989). Ebenso haben
Leukozyten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion: über ihren P-Selektin Glykoprotein
Liganden (PSGL) binden sie an das auf der Oberfläche aktiver Thrombozyten exprimierte P-
Selektin, was zu einer zusätzlichen Thrombingenerierung führt (BOUCHARD u. TRACY
II Literaturübersicht
16
2001). Ein weiterer Vorteil der Vollblutaggregometrie ist die Möglichkeit, auch ikterische
oder lipämische Proben untersuchen zu können (INGERMAN-WOJENSKI et al. 1983).
Eine Studie von DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. (2005) verglich beim Menschen
die turbidimetrische mit der Vollblutimpedanz-Aggregometrie. Dabei stellte sich die
Aggregationsmessung im Vollblut als überlegen heraus, konnte doch anhand mehrerer
Fallstudien eine verminderte Thrombozytenaggregation im Vollblut bei Patienten mit
Thrombozytendysfunktionen bzw. unter Therapie mit Plättchenhemmern festgestellt werden,
die bei der Untersuchung im PRP im Normalbereich lag. Insbesondere die Sensitivität
gegenüber Plättchenhemmern, aber auch gegenüber erblichen und erworbenen
Thrombozytendysfunktionen war im Vollblutverfahren höher.
Den ersten, erfolgversprechenden Ansatz zur Messung der Thrombozytenfunktion im
Vollblut lieferten 1979 Cardinal und Flower mit der Impedanzaggregometrie. Das Prinzip
dieser Methode basiert auf der elektrischen Widerstandserhöhung zwischen zwei Elektroden
(CARDINAL u. FLOWER 1980). Kommen die Thrombozyten in Kontakt mit der
thrombogenen Metalloberfläche der Elektroden, bilden sie eine Monoschicht auf diesen.
Durch Zugabe eines aggregationsinduzierenden Agonisten (z.B. ADP oder Kollagen) zu der
mit Kochsalzlösung verdünnten Vollblutprobe kommt es zur Anlagerung weiterer
Thrombozyten an die Monoschicht. Der sich dadurch ändernde Widerstand wird mit einem
Schreiber grafisch dargestellt (CARDINAL u. FLOWER 1980).
Eines der neuesten Verfahren basierend auf der Impedanzaggregometrie ist die
„multiple electrode aggregometry“ (MEA). Alle vorherigen Verfahren bedienten sich
wiederverwendbarer Elektroden, die nach jeder Messung gereinigt werden mussten, was eine
potentielle Fehlerquelle darstellt (TOTH et al. 2006). Bei der MEA kommen Einweg-
Messzellen zum Einsatz, die zwei Elektrodenpaare beinhalten. TÓTH et al. (2006)
untersuchten in ihrer Studie u.a. den Einfluss der Thrombozytenzahl auf die detektierte
maximale Aggregation und konnten keine Abhängigkeit feststellen, wobei allerdings alle
gemessenen Proben eine Plättchenzahl aufwiesen, die nur innerhalb des Referenzbereichs
schwankte. Des Weiteren konnte eine geringgradige spontane Thrombozytenaggregation,
evtl. durch den Rührmagneten verursacht, beobachtet werden, die bei Verwendung von
Hirudin als Antikoagulanz deutlich niedriger ausfiel als bei Citrat. Messungen mit der MEA
wiesen eine relativ hohe interindividuelle Variabilität auf, die für den Agonisten ADP
II Literaturübersicht
17
besonders ausgeprägt war. Die Thrombozytenaggregation war bei Hirudin-antikoagulierten
Proben signifikant höher als bei Citrat-antikoagulierten, was im Konsens mit einer anderen
Studie steht, die den Einfluss von Antikoagulantien auf die Aggregationsmessung im Vollblut
untersuchte (WALLEN et al. 1997).
In einer Studie von KALBANTNER et al. (2010) wurde erstmals systematisch die
Eignung eines Impedanzaggregometers (Multiplate® Aggregometer) für die Messung von
Hundeblut geprüft. Dabei wurden Referenzwerte etabliert (Tab. 1), verschiedene
Antikoagulantien getestet und optimale Konzentrationen verschiedener
aggregationsinduzierender Agonisten ausgearbeitet. Es stellte sich heraus, dass die Agonisten
Ristocetin und „Thrombin-Rezeptor aktivierendes Peptid 6“ (TRAP-6) keine zuverlässige
Aggregation beim Hund induzieren konnten. Für die weiteren Agonisten konnten optimale
Konzentrationen von 10 µmol/L ADP, 5 µg/mL Kollagen und 1 mmol/L AS eruiert werden,
die damit etwas höher als die für humanes Blut empfohlenen Konzentrationen liegen.
Hirudin erwies sich als Anitkoagulanz gegenüber Citrat und Citratpuffer überlegen, was mit
Beobachtungen bei humanem Blut übereinstimmt. Die für humanes Blut empfohlene
Messzeit von 6 min wurde in der Studie auf 12 min verlängert, um der Aggregationskurve das
Erreichen eines Plateaus zu ermöglichen, sodass die tatsächliche, maximale Aggregation
erfasst werden konnte.
Tabelle 1: Referenzbereiche der „area under the curve“ (AUC) und der maximalen
Aggregation für die Messung von Hundeblut für verschiedene Agonisten in ihren optimalen
Konzentrationen (KALBANTNER et al. 2010).
Agonist Referenzbereich
AUC (AU*min) max. Aggregation (AU)
ADP (10 µmol/L) 1481–3448 105–234
Kollagen (5µg/mL) 2017–3460 155–246
Arachidonsäure (1 mmol/L) 1011–3457 73,9–228
II Literaturübersicht
18
5. Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion
5.1. Übersicht vorhandener Studien
In der Veterinärmedizin existieren einige wenige Studien, die den Einfluss
entzündlicher Erkrankungen auf die primäre Hämostase beim Hund untersucht haben. Zur
Messung der Thrombozytenaggregation wurde dazu in der Mehrzahl der Studien die
turbidimetrische Aggregometrie verwendet (Tab. 2). Dabei ergaben die meisten Studien eine
signifikant herabgesetzte Aggregation, die unabhängig vom eingesetzten Agonisten zu sein
schien. So konnte bei Hunden mit Leishmaniose (VALLADARES et al. 1998; CORONA et
al. 2004) und Ehrlichiose (HARRUS et al. 1996a; BRANDAO et al. 2006) eine im Vergleich
zur Kontrollgruppe signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation beobachtete werden.
Lediglich bei Herzwurminfektionen (BOUDREAUX et al. 1989) und in der frühen Phase der
experimentell induzierten akuten Pankreatitis (LUKASZYK et al. 1989) war die
Thrombozytenaggregation erhöht. Der Stichprobenumfang war bei vielen Untersuchungen
relativ klein und bei dem untersuchten Krankheitsgeschehen handelte es sich zumeist um
Infektionskrankheiten.
Hinsichtlich des Einflusses entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenzahl
existieren unterschiedliche Ergebnisse (Tab. 3). Die Mehrzahl der Studien konnte eine
signifikant erniedrigte Plättchenzahl beobachten (NAVARRO u. KOCIBA 1982;
HAUPTMAN et al. 1997; SCHETTERS et al. 2009), es wird jedoch auch vom Fehlen
signifikanter Unterschiede berichtet (BOUDREAUX et al. 1989; MORENO et al. 1998; DE
LAFORCADE et al. 2003; MORITZ et al. 2005).
Neben der turbidimetrischen Aggregometrie kamen weitere Untersuchungsverfahren
zur Beurteilung der Plättchenfunktion beim Hund zum Einsatz (Tab. 4). Dies waren die
kapilläre Blutungszeit, die bei Hunden mit Leishmaniose verlängert war (MORENO et al.
1998), der PFA-100, bei dem eine verlängerte Verschlusszeit bei Hunden mit Endotoxämie
beobachtet werden konnte (YILMAZ et al. 2005), die Durchflusszytometrie, die eine erhöhte
Expression von P-Selektin auf der Thrombozytenoberfläche von Hunden mit entzündlichen
Erkrankungen detektierte (MORITZ et al. 2005) und die Thrombelastografie, deren
II Literaturübersicht
19
Messungen eine höhere Amplitude bei Hunden mit Parvovirose aufzeigten (OTTO et al.
2000).
Studien aus der Humanmedizin, die die Thrombozytenaggregation mittels
turbidimetrischer Aggregometrie untersuchten (Tab. 5), konnten in Übereinstimmung mit den
Ergebnissen bei Hunden eine verminderte Aggregation bei Menschen mit Endotoxämie bzw.
Sepsis nachweisen (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al. 2004; WOTH et al. 2011). Die
beobachtete verkürzte Verschlusszeit bei Untersuchungen mit dem PFA-100 von Menschen
mit Sepsis und spontaner akuter Pankreatitis hingegen weicht von den Ergebnissen beim
Hund ab (HOMONCIK et al. 2000; MIMIDIS et al. 2004).
II Literaturübersicht
20
Tabelle 2: Übersicht der Studien zur Messung der Thrombozytenfunktion mittels turbidimetrischer Aggregometrie bei Hunden mit
entzündlichen Erkrankungen.
ADP = Adenosindiphosphat, AS = Arachidonsäure, Epi = Epinephrin, exp. = experimentell, klin. = klinisch, Kol = Kollagen
Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Agonisten Ergebnisse
Boudreaux et al. (1989) 28 (34) X Herzwurm-
infektion ADP, Kol signifikant höhere ADP- und kollagen-induzierte maximale Aggregation im Vergleich zur Kontrollgruppe
Brandão et al. (2006) 7 (3) X Ehrlichiose ADP/Epi,
Kol/Epi signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei beiden Agonistenkombinationen
Corona et al. (2004) 30 (10) X Leishmaniose ADP, Kol signifikant niedrigere maximale Aggregation
(Kollagen > ADP) Harrus et al.
(1996a) 6 X Ehrlichiose ADP, Kol, Epi Hemmung der Plättchenaggregation bei 5 von 6 Hunden bei mindestens einem Agonisten
Jacobs et al. (1986) 4 (3) X akute
Pankreatitis ADP, Kol, AS signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten
Lukaszyk et al. (1989) 10 X akute
Pankreatitis ADP, AS
erhöhte Sensitivität der Thrombozyten für ADP bis 60 min nach Induktion, signifikant niedrigere Sensitivität nach 2h und 4h; keine Unterschiede bzgl. AS-induzierter Aggregation
Valladares et al. (1998) 6 (2) X Leishmaniose Kol signifikant niederigere kollagen-induzierte
Thrombozytenaggregation
II Literaturübersicht
21
Tabelle 3: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf
die Thrombozytenzahl beim Hund.
exp. = experimentell, klin. = klinisch
Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Ergebnisse
Boudreaux et al. (1989) 28 (34) X Herzwurm-
infektion keine signifikanten Unterschiede
de Larforcade et al. (2003) 20 (28) X Sepsis keine signifikanten Unterschiede
Harrus et al. (1996a) 6 X Ehrlichiose
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit Tiefpunkt zwischen Tag 17 + 24 nach der Infektion
Hauptman et al. (1997) 30 (320) X Sepsis
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bei septischen Hunden im Vergleich zu nicht-septischen
Jacobs et al. (1986) 4 (3) X akute
Pankreatitis
keine signifikanten Unterschiede, aber signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bei erkrankten Hunden und Kontrollgruppe post OP
Lukaszyk et al. (1989) 10 X akute
Pankreatitis
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bis 4 h nach Induktion
Moreno et al. (1998) 26 (10) X Leishmaniose keine signifikanten Unterschiede
Moritz et al. (2005) 20 (20) X Entzündung keine signifikanten Unterschiede
Navarro et al. (1982) 5 (5) X Leptospirose
signifikant niedrigere Thromobozytenzahl, niedrigste Konzentrationen an Tag 2 + 4 nach Infektion, Ausgangsniveau an Tag 10 wieder erreicht
Schetters et al. (2009) 10 X Babesiose
dramatische Abnahme der Thrombozytenzahl proportional zur Infektionsdosis.
Valladares et al. ( 1998) 6 (2) X Leishmaniose
signifikant, fortschreitend niedrigere Thrombozytentzahl, Ausgangsniveau innerhalb von 6 Monaten nach Therapie erreicht
Yilmaz et al. (2005) 17 (8) X Endotoxämie
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit Tiefpunkt 0,5 h nach Infektion
II Literaturübersicht
22
Tabelle 4: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion (außer
Studie n (n Kontrolle) Klin. Exp. Erkrankung Tests Ergebnisse
Moreno et al. (1998) 26 (10) X Leishmaniose kapilläre Blutungszeit
signifikante Verlängerung der Blutungszeit, insbesondere bei erkrankten Hunden mit hohen Kreatininwerten
Moritz et al. (2005) 20/20 X
gemischtes Kollektiv an
entzündl. Erkrankungen
Durchflusszytometrie (P-Selektin), MPC
zirkulierende, aktivierte Thrombozyten bei 60% der Hunde mit entzündlichen Erkrankungen; MPC sensitiver als P-Selektin zur Detektion von aktiverten Plättchen
Otto et al. (2000) 9/9 X Parvovirose Thrombelastografie signifikant höhere maximale Amplitude im
Vergleich zur Kontrollgruppe
Yilmaz et al. (2005) 17 (8) X Endotoxämie
(E.coli) PFA-100,
Hämatokrit
verkürzte VZ 0,5 h (CADP + CEPI) und verlängerte VZ 1 h (CEPI) bzw. 2 h (CADP) nach Endotoxin-Applikation; bei hochdosiertem Endotoxin VZ auch nach 48 h noch verlängert; keine signifikanten Veränderungen hinsichtlich Htk.
II Literaturübersicht
23
Tabelle 5: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion beim
signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten
Yaguchi et al. (2004) 47 (15) X Sepsis
turbidimetrische Aggregometrie
(ADP, Kol, AS)
signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei allen septischen Patienten, unabhängig vom verwendeten Agonisten; AS-induzierte Aggregation am deutlichsten erniedrigt
necessary, diluted or concentrated to 150 x 10³ platelets/µL. Part of the plasma was converted
in 1.3 ml plastic tubes and centrifugated again for ten min at 16,000 x g to achieve platelet
free plasma (PFP).
Capillary bleeding time
Capillary bleeding time (CBT) was measured according to the method described by
Nolte et al. (1997). The non-anaesthetized dogs were brought in lateral position and two
punctures were set on the lateral side of a front toe close to the edge of the horny skin of the
pad using a sterile semi-automatic blood lancet (Softclix II, Roche Diagnostics). While steady
pressure was maintained, the occurring blood drops were dabbed off carefully every 15 s until
the bleeding stopped and average bleeding time was calculated from the two parallel
punctures.
V Manuskript II
65
Platelet function analyzer (PFA-100)
The platelet function analyzer PFA-100 (Siemens Healthcare Diagnostics) aspirates
whole blood under constant vacuum (40 mmHg) through a capillary to a membrane coated
with collagen and adenosine-5’-diphosphate (CADP cartridge) or collagen and epinephrine
(CEPI cartridge). This membrane has a central aperture on which the platelets form a
thrombus. The time required to completely close this aperture is reported as ‘closure time’ (in
s; maximal testing time: 300 s) and the consumption of blood as ‘total volume’ (in µL).
Measurements were performed as recommended by the manufacturer.
Turbidimetric platelet aggregation
The turbidimetric method according to Born (1962) was measured using an
aggregometer with four channels and computer-based curve analysis (APACT 4, Rolf Greiner
Biochemica) and is based on the recording of the changes in optical density after adding
agonists to PRP with a standardized platelet count (in this study: 150 x10³/µL). Every
channel was calibrated by using two standards. The first standard (100% aggregation,
corresponding to the light transmission of PFP) was achieved by adding 20 µL isotonic NaCl
to 200 µL PFP, the second standard (0% aggregation) was prepared by adding 20 µL isotonic
NaCl to 200 µL PRP. After incubation of 200 µL PRP for 2 min at 37 °C, aggregation was
induced by adding 20 µL platelet agonist containing solutions (Dynabyte) to achieve final
concentrations of 10, 20 or 40 µmol/L adenosine-5’-diphosphate (ADP) or 10, 20, 40 µg/mL
collagen. The maximum aggregation was recorded over 12 min and calculated automatically.
V Manuskript II
66
Impedance aggregometry
Impedance aggregometry measured with the Multiplate® analyser (Dynabyte GmbH)
was performed as recommended by the manufacturer (i.e., incubation of 300 µl isotonic
sodium chloride solution and 300 µl blood over 3 min and addition of 20 µl agonist solution)
with exception of the test time (12 min instead of 6 min). Three different aggregation
inducing agonists (Dynabyte GmbH) were used in the following final concentrations: 5, 10
and 20 µmol/L ADP, 3, 5 and 10 µg/mL collagen and 0.5 and 1 mmol/L arachidonic acid
(AA). Of the different parameters provided by the machine, the ‘area under the curve’ (AUC)
value (in aggregation units [AU]*min) was reported.
Haematocrit and platelet count
Haematocrit, whole blood and PRP platelet counts were measured automatically using
a blood cell counter (ADVIA120, Siemens Healthcare Diagnostics). The instrument detects
platelets and red blood cells using a double angle laser light scattering procedure after
isovolumetric sphering and calculates haematocrit based on red blood cell count and mean
cell volume.
Statistical analysis
Data were tested for standard normal distribution using Kolmogorov-Smirnov test.
Reference values were calculated based on 2.5% and 97.5% quantiles of the control group.
Group comparisons of parameters with normal distribution (impedance aggregometry, the
V Manuskript II
67
turbidometric method, capillary bleeding time, haematocrit and platelet count) were
performed with unpaired Student’s t tests. Owing to the censored data delivered by the
platelet function analyzer PFA-100, normal distribution could not be tested/was not present
and Mann-Whitney U test was used for group comparison. Measurements with a result of >
300 s were set to 301 s for statistical analysis. P–values < 0.05 were considered significant.
Statistical analysis was performed using SPSS 16.0 German (SPSS Inc.).
Results
There was no significant difference between the capillary bleeding time of the dogs
with inflammatory diseases and healthy dogs (Table 1). When compared to the reference
values, more dogs (6/25) had a shorter CBT than prolonged (3/25). Dogs with shortened CBT
included 2 patients with abscesses, two with prostatitis, one with pyometra and one with
bronchopneumonia, dogs with prolonged CBT included both dogs with pancreatitis and one
with leptospirosis.
A significantly prolonged PFA-100 closure time compared to the control group
measured with both CADP and CEPI cartridges was observed in dogs with inflammatory
diseases. Total volume was only significantly increased when using the CADP test cells. In
nearly half of the dogs (12/25), results (closure time and total volume) obtained with the
collagen/ADP cartridge exceeded the reference range. The 12 dogs with prolonged closure
time (CADP cartridge) included all 3 dogs with leishmaniosis, 2/3 dogs with leptospirosis, the
two dogs with pancreatitis, the dog with sepsis and the dog with peritonitis, but only 1/6 dogs
with abscesses, 1/3 dogs with prostatitis, and 1/3 dogs with pyometra. 7/12 patients with
V Manuskript II
68
prolonged closure time (CADP cartridge) had anaemia and/or thrombocytopenia. Dogs with
prolonged closure time (CADP cartridge) and normal haematocrit and platelet count included
one dog each with the following diagnoses: leptospirosis, leishmaniosis, pyometra, prostatitis,
and peritonitis.
Dogs with inflammatory diseases also showed a significantly reduced maximal
aggregation of turbidimetric platelet aggregation using different concentrations of ADP and
collagen. In addition, AUC values of AA-induced whole blood aggregation were significantly
lower in dogs with inflammatory diseases. Only whole blood aggregation induced by 5 µg/mL
collagen showed a slightly higher AUC values in dogs with inflammatory diseases. Platelet
count was not different between normal dogs and dogs with inflammatory disorders, but
haematocrit values were considerably lower.
In view of platelet function tests, the only significant difference between the
subgroups was a higher AUC value in whole blood aggregometry induced with 5 µg/ml
collagen in dogs with SIRS. Dogs with SIRS had also significantly lower platelet counts and
haematocrit values (Table 1).
Discussion
The results of our study indicate that dogs with inflammatory diseases have a
moderately impaired platelet function although individual tests (collagen-induced impedance
aggregometry) indicate hyperaggregability. The minor to moderate changes are not expressed
by changes of the capillary bleeding time that can be regarded as a global test of primary
V Manuskript II
69
haemostasis and may be a consequence of the heterogeneous patients and low sensitivity of
the test. Although the method undertakes some effort to standardize blood flow in the
puncture area (Nolte et al., 1997), the result is influenced by a wide range of possible
influencing factors resulting in a high inaccuracy of the method. Factors influencing the result
include factors of the animals (blood pressure, thickness of skin, vessel-wall structure and
distribution of capillaries) as well as technical aspects (amount of circulation promoting salve,
pressure applied when performing the puncture). The animal-derived factors can vary
between different breeds and individuals (Thomas et al., 1979; Forsythe et al., 1989).
In contrast to our study, Moreno et al. (1998) found a prolonged CBT in dogs naturally
infected with leishmania. In this study, dogs naturally infected with leishmania showed a
prolonged capillary bleeding time (mean 93.0 sec) when compared to healthy control dogs
(mean 143.0 sec; p = 0.02) (Moreno et al., 1998). However, the result that dogs with
leishmaniosis with increased creatinine values (> 1.5 mg/dL) had significantly longer CBTs
when compared to patients with normal creatinine values might indicate that the prolongation
is partially due to renal failure. This can also explain the discrepancy to the present study on a
heterogenous group of inflammatory diseases, because renal failure is a common finding in
leishmaniasis but does not obligatorily occur in other inflammatory diseases.
Closure times of PFA-100 were prolonged in dogs with inflammatory diseases,
regardless of the presence of SIRS, using the CADP and CEPI cartridge. This indicates a
reduced function of platelets to form an aggregate under high shear rates and is well in
confirmation with the results of platelet aggregation (under low shear rates). In confirmation
with these results, after a shortened closure time in the initial phase of 30 minutes, prolonged
V Manuskript II
70
closure times of CADP and CEPI cartridges were found in dogs suffering from
experimentally induced endotoxemia (Yilmaz et al., 2005). Whereas our two dogs with
pancreatitis had prolonged closure times, a human study on mild acute pancreatitis patients
detected shortened closure times for both cartridge types and concluded a an increased
adhesiveness and aggregation (Mimidis et al., 2004). This discrepancy can probably be
explained by a difference in the severity of the disease and possibly by a difference in the
stage of disease.
Significance of measurements using the CEPI cartridge are limited in individual
canine blood samples, because the reference range exceeds the upper measurement range of
300 s as a consequence of the limited sensitivity of canine platelets towards epinephrine
(Callan and Giger, 2001; Mischke and Keidel, 2003; Nielsen et al., 2007), that is confirmed
in the present study. Nevertheless, group comparison revealed a significant increase of the CT
measured with the CEPI cartridge in dogs with inflammatory diseases.
Interpretation of the test results of the platelet function analyser have always to be
performed with additional consideration of the platelet count and haematocrit values. Both
parameters influence significantly the test result (Callan and Giger, 2001; Mischke and
Keidel, 2003). Therefore the changes of the platelet function analyser which were found by
Yilmaz et al. (2005) following experimentally induced endotoxemia do not necessarily reflect
the damaging properties of endotoxin on platelet function, but may be mainly a consequence
of the remarkable parallel decrease of platelet count.
V Manuskript II
71
Our dogs with inflammatory diseases had significantly lower haematocrit values (39.7
± 8.3 % vs. 47.9 ± 4.1) and the tendency towards lower platelet counts (242 ± 117 vs. 294 ±
88 x 103/µL). Nevertheless, the influence of the haematocrit in our study seems to be limited,
because only minor changes were observed between haematocrit values of 40 and 48 %
(Callan and Giger, 2001), which represent the lower reference range of haematocrit in dogs.
These values are probably associated with very similar blood flow conditions and blood cell
distribution within the vessel, these factors are regarded as pathomechanisms for the
alterations of the results of the platelet function analyser in anaemic individuals (Dietrich et
al., 1995; Mischke and Keidel, 2003). The influence of platelet count seems also limited,
because only 6/25 dogs with inflammation had platelet counts below the reference range,
whereas changes of the platelet count within the reference range do not significantly influence
the test result (Mischke and Keidel, 2003).
In addition, increase of von Willebrand factor (vWF) concentration, which was not
measured in our patients but was probably increased in most of our dogs due to its role as an
acute phase reactant, adversely affects (i.e. shortens) closure time of the platelet function
analyser and, thereby, can mask impaired platelet function. Homoncik et al. (2000) detected
an 85 % increase of the vWF level after endotoxin injection to healthy humans which was
associated with a 38 and 47 % decrease of the CT measured by the CADP and CEPI cartridge,
respectively.
Decreased measurement signals of turbidimetric platelet aggregometry in dogs with
inflammatory diseases using agonists ADP and collagen are well in confirmation with the
results of several studies examining the influence of certain infections including leishmaniosis
V Manuskript II
72
and ehrlichiosis on platelet aggregation (Harrus et al., 1996; Corona et al., 2004; Brandão et
al., 2006). Similarly, dogs with experimentally induced acute pancreatitis showed a reduced
platelet aggregation using the turbidimetric method (Jacobs et al., 1986; Lukaszyk et al.,
1989). An increased platelet aggregation was only observed in the early phase after induction
of pancreatitis (Lukaszyk et al., 1989). Studies on human patients with sepsis mainly revealed
concordant results, i.e. decreased platelet aggregability (Saba et al., 1984; Yaguchi et al.,
2004; Woth et al., 2011). Yaguchi et al. (2004), for example, observed a decrease in platelet
aggregation in all septic patients (n=47) compared to controls, regardless of the agonist used.
Variable causes for platelet functional disorders in dogs with infectious diseases in
general and for decreased platelet aggregation in particular include damage of platelet
membrane receptors by infectious agents such as Leishmania, which also causes an immune-
mediated process (Corona et al., 2004). Anti-platelet antibodies could be identified in dogs
with infectious diseases such as leishmaniosis and ehrlichiosis and are supposed to interact
with platelet membrane glycoproteins (Harrus et al., 1996; Terrazzano et al., 2005; Dircks et
al. 2009).
Measurements of P-selectin expression indicate increased expression under
inflammatory conditions (Yeo et al., 1993; Moritz et al., 2005). P-selectin is a component of
α-granules and is expressed on the platelet surface after granule secretion (Mickelson, 1996).
This activation may lead to a refractory state regarding in vitro induction of platelet
aggregation by agonists (Moritz et al., 2005). These platelets appear to be hypofunctional in
in vitro aggregation assays and may contribute to the decreased signals of agonist-induced
platelet aggregation. Other authors also mention “exhausted platelets”, which represent
V Manuskript II
73
platelets after reversible interaction with vascular or intravascular substances in or near the
pancreas, or interaction of platelets with some circulating inhibit remain in the circulation
(O’Brien, 1978; Jacobs et al., 1986).
Endotoxin binding to platelets can impair platelet function via different
pathomechanisms including reduced mean adrenoreceptor density on the platelet membrane
causing reduced platelet responsiveness by epinephrine, reduced platelet conformational
changes, and an impaired calcium metabolism (Saba et al., 1984 ; Nystrom et al., 1994).
Gram positive bacteria also influence platelets, because adhesive matrix molecules such as
clotting factor A forms complexes with fibrinogen and antibodies which induce platelet
agglutination (Loughman et al., 2005).
Low platelet count can not only affect the analysis of the platelet function analyser,
but may also cause reduced agonist-induced platelet aggregation (Hanke et al., 2010). The
adjustment of platelet count in the turidimetric assay excludes a significant contribution of
platelet count to the significantly reduced test results of the turbidimetric assay in the present
study. In contrast, platelet count may have influenced the results of the impedance method,
but these differed significantly dependent on the agonist used making a significant influence
unlikely. In addition, thrombocytopenia was rare among the patients in the current study.
It has been suggested that there may be a general shift of platelet functionality under
inflammatory conditions/sepsis from haemostasis towards other functions (esp. within
inflammation) like vascular healing (Yaguchi et al., 2004). α-granules contain, beside
coagulation factors and adhesion proteins, growth factors, one of them is the vascular
endothelial growth factor (VEGF) (Maloney et al., 1998). Sepsis causes an alteration in α-
V Manuskript II
74
granule content manifested in an increased release of VEGF. That suggests a redistribution of
platelet function from hemostasis to tissue repair and vascular healing (Yaguchi et al., 2004).
The remarkable decrease of AA-induced whole blood aggregation, which we detected
in dogs with inflammatory diseases, regardless of the presence of SIRS is well in
confirmation with the observations made in a study by Lundahl et al. (1996) which revealed a
decreased capability of fibrinogen binding in response to AA in human intensive care patients
(among others patient with sepsis) and with observations made in a study by Yaguchi et al.
(2004) in human septic patients. In this study, the most severe sepsis-induced inhibition of the
turbidimetric platelet aggregation of approximately 50 % from the values of the reference
group, was seen for cycclooxygenase pathway induced with AA. AA is metabolized by COX-
1 to PGH2 which in high concentrations has inhibitory effects on platelet function (Quinn,
2005). Because inflammation is associated with an increased release of AA followed by an
increased production of prostaglandins, the further addition of AA may lead to much higher
concentration of PGH2 in the platelet than under physiological conditions.
Interestingly, collagen-induced whole blood aggregation, in contrast to collagen-
induced turbidimetric aggregation, was partly increased in dogs with inflammatory diseases
and in dogs with SIRS. Our observation is, however, in accordance with observations made in
a human study by Whitworth et al. (1989), who used ADP and collagen for inducing
aggregation in both turbidimetric and impedance measurements in patients with endotoxemia.
While collagen-induced aggregation was increased in impedance aggregometry, it was
decreased in the turbidimetric method. The discrepancy to other agonists may reflect the
specific activation mechanism of collagen after binding to the platelet collagen receptor
V Manuskript II
75
(adhesion). The fact that this phenomenon was only observed in impedance aggregometry
may indicate the role of other blood cells that are also influenced by inflammatory processes
and interaction between platelets and leukocytes or red blood cells, that are probably the main
reason for the discrepancies between the results of the turbidimetric method on PRP and
whole blood aggregometry on whole blood. In a current study, an increased number of
platelet-neutrophil aggregates were observed in dogs with SIRS (Dircks et al., 2011).
Unexpectedly, SIRS and Non-SIRS animals did not have systematic significant
differences which may be possible due to the heterogenous composition of patients included
in both groups. In a human study, platelet aggregation was more severely altered in patients
with severe sepsis than in those with uncomplicated sepsis (Yaguchi et al., 2004).
Conclusion
The results of the present study indicate that inflammatory diseases caused by bacterial
and protozoal infections have an inhibitory effect on platelet function in dogs. Significant
alterations of primary haemostasis are mainly associated with systemic infectious diseases
and less frequently observed in local processes (abscesses), but the presence of SIRS does not
seem to have a significant impact on the severity of the alterations.
Conflict of interest statement
None of the authors has any financial or personal relationships that could
inappropriately influence or bias the content of the paper.
V Manuskript II
76
References
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V Manuskript II
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Table 1 Different parameters of primary haemostasis (mean ± standard deviation or median, minimum-maximum) in dogs with various inflammatory diseases (n=25) in comparison to a healthy controls (n =27–65). Additional comparison of the dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (n=15) and dogs without SIRS (n=10).
Parameter Units Reference range
1 Control Group
2 Inflam. diseases
Stat. com- parison
(1,2)
3 SIRS
4 NonSIRS
Stat. com- parison
(3,4)
Capillary bleeding time sec 45–124.5 74.4 ± 21.3
74.5 ± 46.5 0.988 74.6
± 52.7 74.5
± 41.5 0.998
Platelet function analysis
(PFA-100)
CADPa
CTb sec 47–98 65 (47–99)
83 (55–301) < 0.001 75
(55–301) 123
(57–301) 0.255
CADP TVc µL 231–303 263
(231–303) 300
(161–870) 0.025 297 (230–870)
314 (161–870) 0.846
CEPId
CT sec 73–301 152 (73–301)
301 (92–301) 0.013 301
(108–301) 301
(92–301) 0.531
CEPI TV µL 279–871 474
(278–871) 618
(140–872) 0.355 757 (300–872)
582 (140–871) 0.505
Maximum aggregation
(Turbidimetric aggregometry)
ADPe
40 µmol/L % 32.8 –118 67.3 ± 21.8
45.2 ± 26.8 0.003 41.0
± 19.5 51.6
± 35.8 0.461
ADP 20 µmol/L % 24.6–95.9 59.1
± 21.9 46.4
± 24.2 0.066 42.6 ± 17.5
52.1 ± 32.3 0.466
ADP 10 µmol/L % 19.7–78.7 49.0
± 16.5 36.3
± 21.1 0.025 32.7 ± 17.2
41.8 ± 26.3 0.358
Collagen 40 µg/mL % 36.2–92.9 75.4
± 15.4 58.2
± 23.3 0.004 51.6 ± 13.3
67.3 ± 31.2 0.213
Collagen 20 µg/mL % 43.8– 119 80.9
± 19.2 66.9
± 23.8 0.034 62.7 ± 11.9
72.8 ± 34.5 0.448
Collagen 10 µg/mL % 51.8 - 111 79.4
± 14.0 70.7
± 24.3 0.131 69.2 ± 14.4
72.8 ± 34.9 0.785
Area under the curve
(Impedance aggregometry)
ADP 20 µmol/L AU*min 1248–3380 2240
± 473 2221
± 1033 0.932 2221 ± 1177
2220 ± 831 0.997
ADP 10 µmol/L AU*min 1492–3483 2380
± 498 2285
± 1103 0.683 2301 ± 1319
2261 ± 735 0.931
ADP 5 µmol/L AU*min 662–3502 2193
± 623 2095 ± 983 0.644 2251
± 1147 1860 ± 653 0.290
Collagen 10 µg/mL AU*min 1568–3821 2650
± 482 3003
± 1200 0.165 3374 ± 1144
2446 ± 1108 0.056
Collagen 5 µg/mL AU*min 1691–3480 2750
± 416 3236
± 1113 0.043 3640 ± 1077
2630 ± 905 0.023
Collagen 3 µg/mL AU*min 1234–3622 2619
± 563 3066
± 1111 0.065 3279 ± 1192
2746 ± 945 0.248
AAf
1 mmol/L AU*min 1005–3493 2103 ± 654
1495 ± 848 < 0.001 1545
± 929 1419 ± 751 0.725
AA 0,5 mmol/L AU*min 727–2973 1975
± 650 1334 ± 778 < 0.001 1349
± 758 1311 ± 849 0.907
V Manuskript II
81
Continuation Table 1
Parameter Units Reference range
1 Control Group
2 Inflam. diseases
Stat. com- parison
(1,2)
3 SIRS
4 NonSIRS
Stat. com- parison
(3,4)
Platelet count 10³/µL 139–580 294 ± 88
242 ± 117 0.051 217
± 124 279
± 101 0.199
Haematocrit (%) 40.2–55.6 47.9 ± 4.1
39.7 ± 8.3 < 0.001 37.8
± 7.6 42.6 ± 8.8 0.159
a collagen/ADP cartridge; b closure time; c total volume; d collagen/epinephrine cartridge; e adenosine diphosphate; f arachidonic acid; g Kruskal-Wallis test; h significant t-test between groups
V Manuskript II
82
Table 2 Numer of decreased, normal (within reference values), and increased values of different parameters of primary haemostasis in dogs with various inflammatory diseases (n=25). Additional comparison of the dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (n=15) and dogs without SIRS (n=10).
a collagen/ADP cartridge; b closure time; c total volume; d collagen/epinephrine cartridge; e adenosine diphosphate; f arachidonic acid
Parameter
Inflammatory diseases (n=25)
SIRS (n=15)
NonSIRS (n=10)
↓ = ↑ ↓ = ↑ ↓ = ↑
Capillary bleeding time 6 12 3 3 6 2 3 6 1
Platelet function analysis
(PFA-100)
CADPa
CTb 0 13 12 0 10 5 0 3 7
CADP TVc 2 11 12 1 8 6 1 3 6
CEPId
CT 0 25 0 0 15 0 0 10 0
CEPI TV 1 23 1 0 14 1 1 9 0
Maximum aggregation
(Turbidimetric aggregometry)
ADPe
40 µmol/L 6 14 0 3 9 0 3 5 0
ADP 20 µmol/L 5 15 0 3 9 0 2 6 0
ADP 10 µmol/L 4 15 1 3 9 0 1 6 1
Collagen 40 µg/mL 3 15 1 1 10 0 2 5 1
Collagen 20 µg/mL 3 16 0 1 10 0 2 6 0
Collagen 10 µg/mL 3 15 1 1 10 0 2 5 1
Area under the curve
(Impedance aggregometry)
ADP 20 µmol/L 6 17 2 5 8 2 1 9 0
ADP 10 µmol/L 6 16 3 5 7 3 1 9 0
ADP 5 µmol/L 2 21 2 2 11 2 0 10 0
Collagen 10 µg/mL 4 14 7 1 9 5 3 5 2
Collagen 5 µg/mL 2 12 11 1 5 9 1 7 2
Collagen 3 µg/mL 0 16 9 0 8 7 0 8 2
AAf
1 mmol/L 9 16 0 5 10 0 4 6 0
AA 0,5 mmol/L 6 18 1 3 11 1 3 7 0
Platelet count 6 19 0 6 9 0 0 10 0
Haematocrit 11 14 0 8 7 0 3 7 0
VI Übergreifende Diskussion
83
VI Übergreifende Diskussion
Mit der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Beitrag zur Optimierung des
Multiplate® Aggregometers für seinen Einsatz in der Veterinärmedizin geleistet werden. Dies
ist insofern von klinischem Interesse, als dass die Vollblutaggregometrie entscheidende
Vorteile gegenüber der bisher gängigen Messung der Thrombozytenfunktion im PRP hat. So
entfällt die mit der Zentrifugation einhergehende Zellschädigung und artifizielle Veränderung
der Plättchenvolumen-Verteilung. Neben der damit verbundenen Zeitersparnis kann die
Aggregation außerdem in einem physiologischen Milieu stattfinden, da alle Blutbestandteile
vorhanden sind (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Auch die Messung von
ikterischen und lipämischen Proben, die im PRP zu erheblichen Problemen führt, ist mit dem
Impedanzaggregometer ohne Weiteres möglich (RAND et al. 2003).
Bereits zuvor wurde von KALBANTNER et al. (2010) die Eignung des Gerätes zur
Messung von Hundeblut geprüft. Dabei wurden Referenzwerte etabliert, verschiedene
Antikoagulantien getestet und optimale Konzentrationen der verschiedenen Agonisten
ausgearbeitet. Im methodischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus der
Parameter „Messzeit“ überprüft. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Messzeit einen
signifikanten Einfluss auf die Messergebnisse des Multiplate® Aggregometers hat. Dies gilt
sowohl für die AUC als auch für die maximale Aggregation sowie für alle verwendeten
Agonisten. Die in dieser Studie verwendeten Agonisten wurden in den zuvor in der Studie
von KALBANTNER et al. (2010) eruierten optimalen Konzentrationen von 10 µmol/L ADP,
5 µg/mL Kollagen und 1 mmol/L AS verwendet. Diese Konzentrationen induzierten eine
maximale Aggregation bei minimalen interindividuellen Schwankungen. Da sich in der
Studie zeigte, dass die Agonisten Ristocetin und „Thrombin-Rezeptor aktivierendes Peptid 6“
(TRAP-6) keine zuverlässige Aggregation beim Hund induzieren konnten, wurde auf den
Einsatz dieser Agonisten verzichtet.
Aufgrund des Einflusses der Messzeit auf die Ergebnisse ist es notwendig,
Referenzwerte für die jeweilige Messzeit und den jeweiligen Parameter zu erstellen. Beim
Einsatz von an die Messzeit angepassten Referenzwerten scheint die Messzeit dann keinen
signifikanten Einfluss auf die Sensititvität und Spezifität der Messungen zu haben. Daher
VI Übergreifende Diskussion
84
kann eine kurze Messzeit von 6 min als ausreichend angesehen werden und weist offenbar
sogar eine geringfügig höhere Sensitivität auf.
Der Hersteller empfiehlt eine Messzeit von 6 min für humane Blutproben und dieser
Empfehlung wird in den meisten der humanmedizinischen Studien auch nachgekommen
(CALATZIS 2007; MUELLER et al. 2007; VON PAPE et al. 2007; CAN et al. 2010).
Abweichend davon wählten TÓTH et al. (2006) in ihrer Studie eine Messzeit von 5 min. Es
konnten weder in der human- noch in der veterinärmedizinischen verfügbaren Literatur
Studien gefunden werden, die systematisch verschiedene Messzeiten im Hinblick auf die
diagnostische Genauigkeit verglichen haben. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie
scheinen demnach auch für die Humanmedizin von Interesse.
Die in der früheren Studie von KALBANTNER et al. (2010) verwendete Messzeit von
12 min für canine Blutproben diente dazu, den Aggregationskurven das Erreichen eines
Plateaus zu ermöglichen. Dies macht es u.a. möglich, die wahre maximale Aggregation zu
ermitteln. Ein reduzierter Zeitaufwand scheint der Hauptgrund für die Anwendung einer 6-
minütigen Messzeit zu sein, die in der Regel die Aggregationsreaktion nicht zum Abschluss
kommen lässt.
Eine Einschränkung unserer methodischen Studie ist das Fehlen einer
Referenzmethode im ersten Teil des Experiments. Dadurch konnte nicht abschließend geklärt
werden, ob die ober- oder unterhalb des Referenzbereiches liegenden Ergebnisse wahr oder
falsch positiv sind. Aus diesem Grund haben wir ein zweites Experiment basierend auf
Probenmaterial von Clopidogrel-behandelten Hunden durchgeführt. Clopidogrel ist ein
potenter, nicht-kompetitiver Antagonist des thrombozytären ADP-Rezeptors P2Y12, der die
Bindung von ADP an seinen Plättchenmembranrezeptor irreversibel hemmt (MUELLER et
al. 2007).
Bereits zuvor wurde eine signifikant reduzierte ADP-induzierte
Thrombozytenaggregation bei Hunden beschrieben, die Clopidogrel in der von uns
verabreichten Dosierung erhielten (BRAINARD et al. 2010). Daher war anzunehmen, dass
alle Proben der behandelten Hunde, die mit dem Agonisten ADP gemessen wurden, unterhalb
des Referenzbereichs liegen, wie es auch in unserer Studie der Fall war. Die verminderte AS-
induzierte Aggregation der Clopidogrel-behandelten Hunde mag auf den ersten Blick
VI Übergreifende Diskussion
85
überraschend erscheinen, doch konnte derselbe Effekt auch bei humanen Thrombozyten
beobachtet werden (EDER et al. 2007; PENZ et al. 2010).
Obwohl die Hemmung der Aggregation durch Clopidogrel rezeptorspezifisch ist und
sich nicht deutlich auf die COX oder den AS-Metabolismus auswirkt, kann Clopidogrel
indirekt auch die durch andere Agonisten induzierte Aggregation hemmen, indem es die
Amplifikation der Thrombozytenaktivierung durch freigesetztes ADP blockiert. Die Bindung
von ADP ist notwendig, um die Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors zu induzieren, der die
Vernetzung der Thrombozyten untereinander durch Fibrinogenbrücken ermöglicht (SIESS
1989).
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse des ersten methodischen Teils unserer
Studie, dass der Einfluss der Messzeit auf die Aussagekraft der Messergebnisse der
Vollblutimpedanzaggregometrie bei Hunden gering ist, sofern die Interpretation der
Ergebnisse basierend auf Referenzwerten erfolgt, die spezifisch für die einzelne Messzeit
etabliert wurden. Die Verkürzung der Messzeit für Hundeblut auf 6 min – wie für humanes
Blut empfohlen - scheint daher möglich und geht mit einer mindestens gleichwertigen
Aussagekraft gegenüber längeren Messzeiten einher.
Das Multiplate® Aggregometer war auch Bestandteil des zweiten Teils der
vorliegenden Arbeit. Da die Untersuchungen zur Optimierung der Messzeit und zum Einfluss
entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion parallel stattfanden, wurde im
klinischen Teil eine Messzeit von 12 min vorerst beibehalten. Die Ergebnisse des zweiten
Teils dieser Arbeit zeigen, dass Hunde mit entzündlichen Erkrankungen oft eine mäßig
beeinträchtigte Thrombozytenfunktion aufweisen, auch wenn einzelne Tests ein gesteigertes
Aggregationsvermögen aufzeigten (Kollagen-induzierte Impedanzaggregometrie). Diese
geringfügigen bis moderaten Veränderungen wurden jedoch nicht im Rahmen der kapillären
Blutungszeit erfasst, die als Globaltest der primären Hämostase angesehen werden kann. Dies
ist vermutlich auf die Heterogenität der Patienten und die niedrige Sensitivität des Tests
zurückzuführen. Zwar erfolgt bei der Methode eine weitestgehende Standardisierung des
Blutflusses im Punktionsgebiet (NOLTE et al. 1997), doch werden die Ergebnisse durch eine
Bandbreite weiterer möglicher Faktoren beeinflusst, die zu einer relativ hohen
Messungenauigkeit der Methode führen. Zu diesen Faktoren gehören zum einen Tier-
abhängige Faktoren (Blutdruck, Hautdicke, Gefäßwandbeschaffenheit und Verteilung der
VI Übergreifende Diskussion
86
Kapillaren), die von Rasse zu Rasse und Hund zu Hund variieren können (THOMAS et al.
1979; FORSYTHE u. WILLIS 1989), und zum anderen technische Aspekte (Menge an
hyperämisierender Salbe, angewendeter Druck beim Setzen der Punktionen).
MORENO et al. (1998) beobachteten im Gegensatz zu unserer Studie eine verlängerte
kapilläre Blutungszeit bei Hunden mit Leishmaniose. Natürlich infizierte Hunde zeigten dabei
eine signifikant längere Blutungszeit (Mittelwert 93,0 sec) im Vergleich zur Kontrollgruppe
(143,0 sec, p = 0,02). Die signifikant längere Blutungszeit bei an Leishmaniose erkrankten
Hunden mit erhöhten Kreatininwerten (> 1,5 mg/dL) verglichen mit Patienten mit normalen
Kreatininwerten lässt jedoch vermuten, dass die Verlängerung zumindest teilweise durch ein
Nierenversagen bedingt war. Während Nierenversagen eine häufige Begleiterscheinung der
Leishmaniose ist, tritt es nicht zwangsläufig auch im Rahmen anderer entzündlicher
Erkrankungen auf. Dies erklärt die abweichenden Resultate unserer Studie, in der eine
größere Bandbreite an inflammatorischen Erkrankungen vertreten war.
Die Verschlusszeiten des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100 waren bei den
Hunden mit entzündlichen Erkrankungen für beide Messzelltypen verlängert, was eine
beeinträchtigte Fähigkeit der Thrombozyten zur Bildung eines Aggregates unter hohen
Scherkräften nahelegt. Dies steht in Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen der
Thrombozytenaggregation (unter niedrigen Scherkräften) und den Ergebnissen einer Studie,
die nach einer verkürzten Verschlusszeit (in den ersten 30 min) eine verlängerte
Verschlusszeit der CADP- und CEPI-Messzellen bei Hunden mit experimentell induzierter
Endotoxämie darlegen (YILMAZ et al. 2005). Während die zwei Hunde mit Pankreatitis in
unserer Studie eine verlängerte Verschlusszeit aufwiesen, konnte bei Patienten mit einer
milden akuten Pankreatitis in einer humanmedizinischen Studie eine verkürzte Verschlusszeit
für beide Messzelltypen festgestellt werden, die auf ein erhöhtes Adhäsion- und
Aggregationsvermögen der Plättchen zurückgeführt wurde (MIMIDIS et al. 2004). Diese
abweichenden Resultate können wahrscheinlich durch den unterschiedlichen Schweregrad
und möglicherweise auch durch ein unterschiedliches Stadium der Erkrankung erklärt
werden.
Die Aussagekraft der Ergebnisse von einzelnen Hundeblutproben bei Messungen mit
der CEPI-Messzelle ist eingeschränkt, da der Referenzbereich für Hundeblut die maximale
Messzeit von 300 s aufgrund der geringen Sensitivität caniner Thrombozyten für Epinephrin
VI Übergreifende Diskussion
87
überschreitet (CALLAN u. GIGER 2001; MISCHKE u. KEIDEL 2003; NIELSEN et al.
2007), was in unserer Studie bestätigt werden konnte. Dennoch zeigte der Gruppenvergleich
eine signifikant verlängerte Verschlusszeit bei Hunden mit entzündlichen Erkrankungen im
Fall der CEPI-Messzelle.
Bei der Interpretation der Messergebnisse des PFA-100 müssen immer auch der
Hämatokrit und die Thrombozytenzahl der Probe berücksichtigt werden. Beide Parameter
haben einen signifikanten Einfluss auf die Messergebnisse. So konnten CALLAN und GIGER
(2001) bei Hundeblutproben mit einer Thrombozytenzahl von < 100 x103/µL eine
Verlängerung der Verschlusszeit bei beiden Messzelltypen beobachten, die bei < 50 x103/µL
besonders deutlich ausgeprägt war. Eine Studie von MISCHKE und KEIDEL (2003) zeigte,
dass bereits ein Abfall des Hämatokrits von 40 % auf 30 % eine signifikante Verlängerung
der Verschlusszeit und Erhöhung des Gesamtvolumens verursacht. Aus diesem Grund
spiegeln die in der Studie von YILMAZ et al. (2005) beobachteten verlängerten
Verschlusszeiten bei Hunden mit experimentell induzierter Endotoxämie nicht zwangsläufig
die Schädigung der Thrombozytenfunktion durch Endotoxine wider, sondern sind wohl
hauptsächlich auf den deutlichen, zeitgleichen Abfall der Thrombozytenzahl zurückzuführen.
Die Hunde mit entzündlichen Erkrankungen in unserer Studie hatten einen signifikant
erniedrigten Hämatokrit (39,7 ± 8.3 % vs. 47,9 ± 4,1 % bei der gesunden Kontrolle) und eine
tendenziell erniedrigte Thrombozytenzahl (242 ± 117 vs. 294 ± 88 x 103/µL). Dennoch
scheint der Einfluss des Hämatokrits in unserer Studie begrenzt zu sein, da nur geringe
Unterschiede der PFA-100-Ergebnisse zwischen Hämatokritwerten von 40 und 48 %
beobachtet werden konnten (CALLAN u. GIGER 2001), die sich im unteren Referenzbereich
für Hunde bewegen. Diese Werte führen wahrscheinlich zu keinen bedeutenden
Veränderungen der Blutflussbedingungen und Verteilung der Blutzellen im Gefäß, welche als
entscheidende Faktoren der Pathomechanismen anzusehen sind, die eine Änderung der
Ergebnisse des PFA-100 bei anämischen Patienten verursachen (DIETRICH et al. 1995;
MISCHKE u. KEIDEL 2003). Auch die Thrombozytenzahl scheint in unserer Studie nur
einen begrenzten Einfluss gehabt zu haben, da lediglich 6 von 25 Hunden mit Entzündungen
eine Thrombozytenzahl unterhalb des Referenzbereichs aufwiesen und Schwankungen der
Thrombozytenzahl innerhalb des Referenzbereichs keinen signifikanten Einfluss auf die
Messergebnisse haben (MISCHKE u. KEIDEL 2003).
VI Übergreifende Diskussion
88
Ein weiterer Faktor, der im Rahmen der automatischen Plättchenfunktionsanalyse von
Interesse ist, ist die vWF-Konzentration, die bei unseren Patienten zwar nicht erfasst wurde,
aber wahrscheinlich aufgrund der Rolle des vWF als Akute-Phase-Protein bei den meisten
Hunden erhöht war. Die damit verbundene Verkürzung der Verschlusszeit kann – umgekehrt
zur Thrombozytopenie und Anämie – zur Maskierung einer beeinträchtigten
Thrombozytenfunktion führen, d.h. zu falsch negativen/normalen Werte trotz erworbener
Thrombozytenfunktionsstörung. So konnten HOMONCIK et al. (2000) nach einer Endotoxin-
Injektion bei gesunden Menschen einen 85 %igen Anstieg der vWF-Konzentration feststellen,
der mit einer 38 bzw. 47–%igen Verkürzung der Verschlusszeit bei der CADP- bzw. CEPI-
Messzelle einherging.
Die von uns gemessene erniedrigte ADP- und Kollagen-induzierte maximale
Aggregation der turbidimetrischen Aggregometrie bei Hunden mit entzündlichen
Erkrankungen bestätigt die Ergebnisse verschiedener Studien, die den Einfluss bestimmter
Infektionserkrankungen wie Leishmaniose und Ehrlichiose auf die Thrombozytenaggregation
untersucht haben (HARRUS et al. 1996a; CORONA et al. 2004; BRANDAO et al. 2006).
Ebenso zeigten Hunde mit experimentell induzierter akuter Pankreatitis eine reduzierte
Thrombozytenaggregation im Rahmen der turbidimetrischen Aggregometrie (JACOBS et al.
1986; LUKASZYK et al. 1989). Lediglich in der frühen Phase nach der induzierten
Pankreatitis konnte eine erhöhte Plättchenaggregation beobachtet werden (LUKASZYK et al.
1989). Auch Studien aus der Humanmedizin berichten von übereinstimmenden Ergebnissen
im Sinne eines beeinträchtigten Aggregationsvermögen der Thrombozyten bei Patienten mit
Sepsis (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al. 2004; WOTH et al. 2011). So konnten
YAGUCHI et al. (2004) beispielsweise eine im Vergleich zur Kontrollgruppe erniedrigte
Thrombozytenaggregation bei allen septischen Patienten (n=47), unabhängig vom
verwendeten Agonisten beobachten.
Eine mögliche Ursache für die Thrombozytenfunktionsstörung bei Hunden mit
Infektionserkrankungen im Allgemeinen und eine beeinträchtigte Thrombozytenaggregation
im Speziellen ist die Beschädigung der thrombozytären Membranrezeptoren durch infektiöse
Erreger wie Leishmanien, die darüber hinaus einen immunvermittelten Prozess induzieren
(CORONA et al. 2004). Anti-Plättchen-Antikörper konnten bei Hunden mit
Infektionskrankheiten wie Leishmaniose und Ehrlichiose identifiziert werden und stehen im
VI Übergreifende Diskussion
89
Verdacht mit den Membranglykoproteinen der Thrombozyten zu interagieren (HARRUS et
al. 1996; TERRAZZANO et al. 2006; DIRCKS et al. 2009).
Messungen der P-Selektin-Expression auf der Thrombozytenoberfläche zeigten eine
erhöhte Expression unter inflammatorischen Bedingungen (YEO et al. 1993; MORITZ et al.
2005). P-Selektin ist ein Bestandteil der α-Granula und wird nach der Degranulation auf der
Thrombozytenoberfläche exprimiert (MICHELSON 1996) und somit ein Marker für die
Plättchenaktivierung. Die im Rahmen entzündlicher Prozesse gesteigerte Aktivierung der
Thrombozyten führt wohlmöglich zu einem refraktären Zustand bezüglich einer Induktion der
Thrombozytenaggregation durch Agonisten in vitro (MORITZ et al. 2005). Diese
Thrombozyten erscheinen bei in vitro Aggregationsmessungen hypofunktional und könnten
dadurch für die erniedrigten Ergebnisse der Agonist-induzierten
Thrombozytenaggregationsmessung verantwortlich sein. Andere Autoren berichten von
„erschöpften Thrombozyten“, bei denen es sich um Plättchen handelt, die nach einer
reversiblen Interaktion mit vaskulären oder intravaskulären Substanzen im oder in der Nähe
des Pankreas oder nach einer Interaktion mit einem nicht näher definierten zirkulierenden
Inhibitor in der Zirkulation verbleiben (O’BRIEN 1978; JACOBS et al. 1986).
Die Bindung von Endotoxinen kann über verschiedene Pathomechanismen zu einer
Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion führen. So induzieren Endotoxine zum einen
eine reduzierte mittlere Adrenorezeptoren-Dichte auf der Plättchenmembran, die ein
vermindertes Ansprechen der Thrombozyten auf Epinephrin verursacht und zum anderen
bewirken sie eine herabgesetzte Konformationsänderung und einen beeinträchtigten
Kalziummetabolismus (SABA et al. 1984; NYSTROM et al. 1994). Grampositive Bakterien
können Thrombozyten über adhäsive Matrixmoleküle wie den ClF A beeinflussen, indem
dieser Komplexe mit Fibrinogen und spezifischen Antikörpern bildet, die eine
Thrombozytenagglutination induzieren (LOUGHMAN et al. 2005).
Niedrige Thrombozytenzahlen beeinflussen nicht nur die Messungen mit dem PFA-
100, sondern können ebenso eine verminderte Agonist-induzierte Thrombozytenaggregation
verursachen (HANKE et al. 2010). Die Einstellung der Plättchenzahl im PRP für die
turbidimetrische Aggregometrie schließt eine Beteiligung der Thrombozytenzahl an den
signifikant erniedrigten Messergebnissen bei dieser Methode aus. Im Gegensatz dazu kann die
Thrombozytenzahl die Ergebnisse der Impedanzaggregometrie theoretisch zwar durchaus
VI Übergreifende Diskussion
90
beeinflussen (MENGISTU et al. 2009), doch scheint dies unwahrscheinlich, da nicht bei allen
Agonisten signifikante Unterschiede festgestellt werden konnten. Außerdem wiesen nur
wenige Patienten in der vorliegenden Studie eine Thrombozytopenie auf.
YAGUCHI et al. (2004) vermuteten eine allgemeine Verschiebung der
Thrombozytenfunktion unter inflammatorischen bzw. septischen Bedingungen von der
Hämostase in Richtung anderer Funktionen wie z.B. Gefäßheilung. Die α-Granula enthalten
neben Gerinnungsfaktoren und Adhäsionsproteinen, auch Wachstumsfaktoren, zu denen u.a.
auch der vascular endothelial growth factor (VEGF) gehört (MALONEY et al. 1998). Im
Rahmen einer Sepsis kommt es zu Veränderungen in der Zusammensetzung des α-Granula-
Inhaltes, die sich in einer erhöhten Freisetzung von VEGF manifestieren. Dies lässt eine
Umorientierung der Plättchenfunktion von der Hämostase hin zur Gewebereparatur und
Gefäßheilung vermuten (YAGUCHI et al. 2004).
Die auffallende Verminderung der AS-induzierten Vollblutaggregation bei Hunden
mit entzündlichen Erkrankungen bestätigt Beobachtungen, die sowohl in einer Studie von
LUNDAHL et al. (1996) gemacht wurden, bei der ein vermindertes Fibrinogen-
Bindungsvermögen der Plättchen von Intensivpatienten (u.a. mit Sepsis) gezeigt werden
konnten als auch in einer Studie von YAGUCHI et al. (2004) mit septischen Menschen. In
dieser Studie konnte die stärkste Sepsis-induzierte Hemmung der turbidimetrischen
Thrombozytenaggregation um bis zu 50 % bezogen auf die Kontrollgruppe bei der AS-
induzierten Aggregation gemessen werden. AS wird über die COX-1 in PGH2 metabolisiert,
das in hohen Konzentrationen einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombozytenfunktion hat
(QUINN 2005). Da es im Rahmen von Entzündungsprozessen zu einer gesteigerten
Freisetzung von AS gefolgt von einer gesteigerten Prostaglandinproduktion kommt, kann die
weitere Zugabe von AS während der Aggregometrie eine wesentlich höhere PGH2-
Konzentration in der Umgebung des Thrombozyten als unter physiologischen Bedingungen
verursachen.
Interessanterweise war die Kollagen-induzierte Aggregation im Vollblut im Gegensatz
zur Kollagen-induzierten turbidimetrischen Aggregation teilweise bei Hunden mit
entzündlichen Erkrankungen und bei Hunden mit SIRS signifikant erhöht. Diese Beobachtung
steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen einer humanmedizinischen Studie von
WHITWORTH et al. (1989), die für die Messung von Proben endotoxämischer Patienten
VI Übergreifende Diskussion
91
ADP und Kollagen zur Aggregationsinduktion bei beiden Methoden verwendeten. Während
die Kollagen-induzierte Aggregation der Impedanzaggregometrie erhöht war, zeigte sich bei
der turbidimetrischen Aggregometrie eine erniedrigte Aggregation. Die Diskrepanz zu den
anderen Agonisten spiegelt möglicherweise den spezifischen Aktivierungsmechanismus von
Kollagen nach Bindung an den thrombozytären Kollagenrezeptor wider. Die Tatsache, dass
dieser Effekt nur bei der Impedanzaggregometrie beobachtet werden konnte, lässt die
Beteiligung anderer Blutzellen vermuten, die ebenso durch entzündliche Prozesse beeinflusst
werden. Einer der Hauptgründe für die abweichenden Ergebnisse der Messung im PRP und
um Vollblut könnte demnach in der Interaktion der Thrombozyten mit Leukozyten oder
Erythrozyten liegen. In einer aktuellen Studie konnte eine erhöhte Anzahl von Thrombozyten-
Neutrophilen-Aggregaten bei Hunden mit SIRS nachgewiesen werden (DIRCKS et al. 2011).
Überraschenderweise gab es keine systematischen signifikanten Unterschiede
zwischen den Gruppen „SIRS“ und „NonSIRS“, was wohlmöglich auf die heterogene
Zusammensetzung der Patienten in beiden Gruppen zurückzuführen ist. In einer
humanmedizinischen Studie konnte gezeigt werden, dass die
Thrombozytenaggregationhemmung bei Patienten mit ernster Sepsis stärker ausgeprägt war
als bei solchen mit unkomplizierter Sepsis (YAGUCHI et al. 2004).
Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit zeigen zusammenfassend,
dass entzündliche Erkrankungen, die durch bakterielle und protozoische Infektionen
hervorgerufen wurden, einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombozytenfunktion von
Hunden haben. Signifikante Veränderungen der primären Hämostase sind hauptsächlich mit
systemischen Infektionserkrankungen assoziiert und seltener bei lokalen Prozessen, wie z.B.
Abszessen, zu beobachten. Das Vorliegen eines SIRS scheint jedoch keinen signifikanten
Einfluss auf die Ausprägung der Veränderungen zu haben. Weiterführende Untersuchungen
unter Einbeziehung größerer Zahlen von Patienten mit definerten Infektionserkrankungen in
verschiedenen Stadien und zusätzlicher Berücksichtigung von Entzündungsparametern wären
lohnend.
VII Zusammenfassung
92
VII Zusammenfassung
Monia Abid (2011)
Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen
und Optimierung der Messzeit des Multiplate® Aggregometers
Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Einfluss der Messzeit auf die
Referenzwerte und die Aussagekraft der Ergebnisse des Multiplate® Aggregometers, einem
relativ neuen Impedanzaggregometer, bei Hunden untersucht. Da es für den Einsatz in der
Humanmedizin entwickelt wurde, fand kürzlich in einer vorangegangenen Studie eine
Evaluierung des Gerätes für Hundeblut statt, bei der eine Messzeit von 12 min verwendet
wurde, die von der Empfehlung des Herstellers (6 min für humanes Blut) abweicht. Basierend
auf Blutproben von 83 klinisch gesunden Hunden wurden Referenzwerte für verschiedene
Messzeiten (6, 8, 10 und 12 min) für die Parameter „area under the curve“ (AUC) und
maximale Aggregation ermittelt. Die Messergebnisse von 134 Proben von 117 Hunden mit
diversen Erkrankungen und 8 Proben mit verminderter Thrombozytenfunktion aufgrund einer
Behandlung mit dem Plättchenaggregationshemmer Clopidogrel wurden zu den
verschiedenen Messzeiten ausgewertet und in erniedrigt, normal und erhöht eingeteilt. Zum
Einsatz kamen drei verschiedene aggregationsinduzierende Agonisten in ihren optimalen
Konzentrationen: Adenosindiphosphat (ADP, 10 µmol/L), Kollagen (5 µg/mL) und
Arachidonsäure (AS, 1 mmol/L). Es konnte eine signifikante Erhöhung der maximalen
Aggegations- und AUC-Werte bei den gesunden Kontrollen mit steigender Messzeit
beobachtet werden. Mittels Chi-Quadrat Test ergaben sich für keinen Agonisten signifikanten
Unterschiede zwischen den verschiedenen Messzeiten in Bezug auf die Anzahl der erhöhten
und erniedrigten Messergebnisse bei den Patientenproben. Alle Proben der mit Clopidogrel
behandelten Hunde, die mit dem Agonisten ADP gemessen wurden, wiesen erniedrigte AUC-
Werte bei allen Messzeiten auf. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Messzeit einen
signifikanten Einfluss auf die maximalen Aggregations- und AUC-Werte hat, der Einfluss auf
die Sensitivität der Messergebnisse von Hundeblut bei diesem Gerät aber begrenzt ist.
VII Zusammenfassung
93
Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss entzündlicher
Erkrankungen auf die primäre Hämostase beim Hund zu untersuchen. Dazu wurden sechs
verschiedene Parameter zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion bei 25 Hunden mit
bakteriellen und protozoischen Infektionen verwendet: kapilläre Blutungszeit, automatische
Plättchenfunctionsanalyse (PFA 100: Kollagen/ADP [CADP] und Kollagen/Epinephrin
[CEPI] Messzellen), turbidimetrische Thrombozytenaggregation (mit Agonisten ADP und
Kollagen), Impedanzaggregometrie (mit Agonisten ADP, Kollagen und AS) mit einem
multiplen Elektrodenaggregometers, Thrombozytenzahl und Hämatokrit. Die Ergebnisse der
25 erkrankten Hunde wurden mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Darüber hinaus
wurden die erkrankten Tiere basierend auf Kriterien des systemischen inflammatorischen
Response-Syndroms (SIRS) in zwei Untergruppen eingeteilt (Gruppe „SIRS“ und
„NonSIRS“) und miteinander verglichen.
Im Vergleich zur Kontrollgruppe ergab sich bei den Hunden mit entzündlichen
Erkrankungen eine signifikant verlängerte Verschlusszeit der automatischen
Plättchenfunktionsanalyse bei beiden Messzelltypen (z.B. CADP: 83 [55–301] sec vs. 65 [47–
99] sec; Median [Minimum–Maximum]; P < 0,0001). Dabei wiesen 12 der 25 Hunde eine
verlängerte Verschlusszeit auf (Kol/ADP-Messzelle), darunter alle Hunde mit Leishmaniose,
2/3 Hunden mit Leptospirose, alle Hunde mit Pankreatitis, der Hund mit Sepsis und der Hund
mit Peritonitis, aber nur 1/6 Hunden mit Abszessen, 1/3 Hunden mit Prostatitis und 1/3
Hunden mit Pyometra. 7 der 12 Patienten mit verlängerter Verschlusszeit (CADP-Messzelle)
litten unter einer Anämie und/oder eine Thrombozytopenie. Es konnte eine signifikante
Verminderung der maximalen Aggregation der erkrankten Hunde bei der ADP- und
Kollagen-induzierten turbidimetrischen Aggregometrie beobachtet werden (z.B. 40 µmol/L
ADP: 45,2 ± 26,8 % vs. 67,3 ± 21,8; Mittelwert ± Standardabweichung; P = 0,003). Des
Weiteren ergab sich bei den Tieren mit entzündlichen Erkrankungen eine zum Teil signifikant
erhöhte Kollagen-induzierte (5 µg/mL Kollagen) und signifikant erniedrigte AS-induzierte
Aggregation im Rahmen der Impedanzaggregometrie. Der einzige signifikante Unterschied
zwischen den Untergruppen „SIRS“ und „NonSIRS“ zeigte sich in einer höheren Kollagen-
induzierten Impedanzaggregation der „SIRS“-Gruppe.
Die Ergebnisse des zweiten Teils dieser Arbeit zeigen, dass die meisten in vitro
Methoden eine normale oder geringgradige bis moderate Beeinträchtigung der
VII Zusammenfassung
94
Thrombozytenfunktion aufzeigen, auch wenn einzelne Tests eine gesteigerte
Thrombozytenaggregation erkennen lassen. Das reduzierte Aggregationsvermögen könnte
neben schädigenden Einflüssen der Infektionen teilweise auch zum Ausdruck bringen, dass
die Thrombozyten bereits in vivo aktiviert wurden.
VIII Summary
95
VIII Summary
Monia Abid (2011)
Measurement of platelet function in dogs with inflammatory diseases and optimization
of test time of the Multiplate® analyser
In the first part of this study the influence of test time on reference values and on the
validity of measurement results of the Multiplate® analyser, a relatively new impedance
aggregometer, in canine blood was determined. As designed for human medicine, the device
was recently evaluated for canine blood in a previous study using a test time of 12 min which
deviates from the recommendation of the manufacturer (6 min for human blood). Based on
blood samples of 83 healthy dogs, reference values for different test times (6, 8, 10 and 12
min) were established for maximum aggregation and area under the curve (AUC) values. The
results of 134 samples of 117 dogs with various diseases and 8 samples with reduced platelet
function owing to treatment with the platelet aggregation inhibitor clopidogrel were
calculated at the different test times and classified as decreased, normal or increased. Three
different aggregation inducing agonists in their optimal concentrations were used: adenosine
Tab. B1: Signalement, Diagnose und Gruppenzugehörigkeit der 25 Hunde mit entzündlichen
Erkrankungen.
Hund Nr. Rasse
Alter (Jahre; Monate)
Geschlecht Diagnose Gruppe
1 Airedale Terrier 3;9 w Abszess NonSIRS 2 Beagle 1;1 w Leptospirose SIRS 3 Bracke 12;3 m Prostatitis NonSIRS 4 Kleiner Münsterländer 1;5 m Prostatitis SIRS 5 Border Collie 8;2 w Pyometra SIRS 6 Gordon Setter 0;9 w Abszess SIRS 7 Deutscher Schäferhund 2;8 m Abszess SIRS 8 Golden Retriever 7;0 m Leptospirose SIRS 9 Briard 1;1 w Bronchopneumonie SIRS 10 Mischling 1;0 mk Bronchopneumonie SIRS 11 Mischling 5;9 wk Leishmaniose NonSIRS 12 Beagle 3;8 w Abszess SIRS 13 Entlebucher Sennenhund 6;1 w Leishmaniose SIRS 14 Mischling 9;0 m Sepsis SIRS 15 Am. Staffordshire Terrier 1;0 w Leptospirose NonSIRS 16 Alano 8;0 m Abszess SIRS 17 Mischling 7;6 wk Bronchopneumonie SIRS 18 Rhodesian Ridgeback 7;1 wk Leishmaniose NonSIRS 19 Hovawart 0;11 m Abszess NonSIRS 20 Bordeaux-Dogge 7;11 m Prostatitis SIRS 21 Labrador 8;6 w Peritonitis NonSIRS 22 Golden Retriever 9;8 w Pyometra NonSIRS 23 Norfolk Terrier 9;11 m Pankreatitis SIRS 24 Dobermann 1;4 w Pyometra NonSIRS 25 Am. Cocker Spaniel 5;10 w Pankreatitis NonSIRS w = weiblich; m = männlich; wk = weiblich kastriert; mk = männlich kastriert
X Tabellarischer Anhang
136
Tab. B2: Befunde (rektale Körpertemperatur, Leukozytenzahl, Herz- und Atemfrequenz,
Allgemeinbefinden) der 25 an entzündlichen Erkrankungen leidenden Hunde, auf deren
Grundlage die Einteilung in die Gruppen „SIRS“ und „NonSIRS“ stattfand.
AF = Atemfrequenz, FA = Futteraufnahme, HF = Herzfrequenz, na = nicht angegeben, obB = ohne besonderen Befund, T = Temperatur, WBC = white blood cells (Leukozyten)
Tab. B3: Signalement der 69 klinisch gesunden Hunde und deren Verwendung bei den
verschiedenen Methoden.
Hund Nr. Rasse Alter
(Jahre; Monate) Geschlecht Methode
1 Deutsch Langhaar 4;0 w A,E,F 2 Mischling 7;4 mk A,D,E,F 3 Mischling 6;4 wk A,D,E,F 4 Deutsch Kurzhaar 2;2 mk A,D,E,F 5 NSDT-Retriever 2;0 wk A,D,E,F 6 Australian Shepherd 1;11 W A,D,E,F 7 Beagle 8;0 mk A,D,E,F 8 Leonberger 1;10 M A,D,E,F 9 Jack Russel Terrier 5;5 mk A,D,E,F 10 Mischling 2;11 w A,D,E,F 11 Weimaraner 1;0 m D,E,F 12 Franz. Bulldogge 1;1 m A,D,E,F 13 Boxer 6;9 m A,D,E,F 14 Mischling 3;4 m A,D,E,F 15 Mischling 4;10 w A,D,E,F 16 Boxer 1;9 m D,E,F 17 Labrador 2;0 wk A,B,D,C,E,F 18 Labrador 2;10 mk A,B,E,F 19 Mischling 8;0 mk B,C,D,E,F 20 Deutsche Wachtel 7;5 m A,B,C,D,E,F 21 Shar Pei 3;5 mk A,B,C,D,E,F 22 Bolonka Zwetna 1;0 m B,C,D,E,F 23 Dalmatiner 7;7 w B,C,D,E,F 24 Flatcoated Retriever 1;10 m B,C,D,E,F 25 Lagotto Romagnolo 1;9 m B,D,E,F 26 Mischling 5;0 mk B,C,D,E,F 27 Labrador 1;3 w B,C,D,E,F 28 Golden Retriever 3;1 w B,D,E,F 29 Berner Sennenhund 3;4 wk B,C,E,F 30 Mischling 5;0 mk B,C,D,E,F 31 Australian Shepherd 1;0 w B,C,D,E,F 32 Husky 11;11 wk B,C,D,E,F 33 Golden Retriever 7;0 w B,C,D,E,F 34 Husky 9;6 m B,C,D,E,F 35 Labrador 3;4 wk B,C,D,E,F 36 Irish Wolfhound 4;1 wk B,D,E,F 37 Mischling 9;0 mk B,C,D,E,F 38 Flatcoated Retriever 1;1 m B,C,D,E,F
X Tabellarischer Anhang
138
Fortsetzung Tab. B3:
Hund Nr. Rasse Alter
(Jahre; Monate) Geschlecht Methode 39 Mischling 5;4 m B,C,D,E,F 40 Deutsch Drahthaar 1;6 m B,C,D,E,F 41 Rottweiler 1;7 m A,B,D,E,F 42 Beagle 8;0 mk A,D,E,F 43 Labrador 1;6 w A,D,E,F 44 Mischling 4;6 mk A,D,E,F 45 Labrador 3;2 w A,D,E,F 46 Mischling 1;6 mk A,D,E,F 47 Mioritic 4;5 wk A,D,E,F 48 NSDT-Retriever 1;6 wk A,D,E,F 49 Golden Retriever 8;0 m A,D,E,F 50 Australian Shepherd 1;7 wk A,D,E,F 51 Labrador 8;11 m A,B,C,D,E,F 52 Deutsch Drahthaar 1;8 m A,B,C,D,E,F 53 Australian Shepherd 4;4 mk A,B,D,E,F 54 Dobermann 1;2 m A,B,D,E,F 55 Dobermann 5;6 m A,D,E,F 56 Dobermann 1;4 m A,B,D,E,F 57 Malinois 5;0 m A,B,D,E,F 58 Deutscher Schäferhund 1;8 m A,B,D,E,F 59 Dobermann 2;9 wk A,B,D,E,F 60 Dobermann 2;9 w A,B,D,E,F 61 Dobermann 5;6 w A,B,C,D,E,F 62 Deutscher Schäferhund 8;2 w A,C,D,E,F 63 Deutscher Schäferhund 2;4 w A,C,D,E,F 64 Deutscher Schäferhund 2;4 m A,B,C,D,E,F 65 Labrador 2;0 m A,B,C,D,E,F 66 Golden Retriever 9;0 mk A,B,D,E,F 67 Deutscher Schäferhund 3;10 w A,B,D,E,F 68 Malinois 3;0 w A,B,E,F 69 Deutscher Schäferhund 1;4 w A,B,D,E,F
A = kapilläre Blutungszeit, B = PFA-100, C = turbidimetrische Aggregometrie, D = Impedanzaggregometrie, E = Thrombozytenzahl, F = Hämatokrit, NSDT = Nova Scotia Duck Tolling, m = männlich, , mk = männlich kastriert, w = weiblich, wk = weiblich kastriert
X Tabellarischer Anhang
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Tab. B4: Ergebnisse der Messung der kapillären in-vivo Blutungszeit bei 25 Hunden mit
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Reinhard Mischke für die Überlassung des interessanten Themas, die stets engagierte Betreuung und die unermüdlichen Hilfestellungen beim Anfertigen dieser Arbeit. Herrn Prof. Dr. I. Nolte danke ich für die Möglichkeit der Durchführung meiner Versuche in der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern des Labors, insbesondere Herrn Dirk Menzel, für die freundliche Hilfe bei der Durchführung der Laborarbeit und die Beantwortung vieler Fragen. Darüberhinaus möchte ich mich bei allen anderen Mitarbeitern der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover bedanken, die mir bei der Entnahme der Blutproben behilflich waren. Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, Martina und Faouzi Abid, meinem Bruder Benjamin Abid und meiner Großmutter Gisela Rauchholz, die durch ihren fortwährenden liebevollen Beistand und ihre finanzielle Unterstützung diese Arbeit erst ermöglicht haben. Ich danke besonders meinen Mitdoktoranden Jan-Wighard Minde, Jette Schönig, Christina Witten, Annika Pukropski und Elisabeth Döderlein, die wohl in manchen Momenten die einzigen Menschen waren, die Situationen nachempfinden konnten und für gegenseitiges Bemitleiden, aber auch Motivation zur Verfügung standen. Weiterhin gilt mein Dank meinen Freundinnen Annika Ferkau, Lisa Homburg, Melanie Gundlach, Svenja Lösken, Lisa Krahn, Verena Reupke, Caro Gietz, Britta Lövenich, Birke Großheim und Katrin Schaper dafür, dass es sie gibt und dass sie, ob nun am Telefon oder persönlich, immer ein offenes Ohr für mich hatten. Last but not least danke ich meiner Hündin Maja, die mich gezwungen hat, mindestens drei Mal am Tag den Schreibtisch zu verlassen.